혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

요약

이 프로토콜은 마우스에서 분리 된 장 간 막 동맥의 경 벽 등각 장력을 평가 하는 와이어 묘 조 그래피의 사용을 설명 하며, 내 피 세포 및 혈관 주위 지방 조직에서 방출 되는 요인에의 한 변조를 특별히 고려 합니다.

초록

병 태 생리학적 자극에 대 한 변경 된 혈관 톤 반응성은 광범위 한 심혈 관 및 대사 성 질환의 발달에 기여 합니다. 내 피 세포 기능 장애는 동맥의 혈관 수축 감소와 혈관의 개선에 대 한 주요 범인을 나타낸다. 지방 (지방) 동맥을 둘러싼 조직은 혈관 평활 근 세포의 내 피 의존적 이완 및/또는 수축 조절에 중요 한 역할을 한다. 내 피와 혈관 주위 지방 조직 사이의 교차 회담은 와이어 myography 시스템에 의해 장착 된 혈관을 사용 하 여 ex 생체 내 평가 될 수 있다. 그러나, 다른 종, 나이, 유전 배경 및/또는 병 태 생리학적 조건의 동물에서 파생 된 동맥에 대 한 최적의 설정을 설정 해야 합니다.

서문

팽창과 동맥의 수축은 각각의 혈관 평활 근 세포의 이완 및 수축에 의해 달성 됩니다. 작은 동맥의 혈관 반응성의 변화는 혈액에 존재 하는 자율 신경 및 호르몬 (예: 카 테 콜 아민, 안 지 오 텐 신 II, 세로토닌, 바소)에 의해 동맥 혈압의 항상성 규칙에 기여 합니다. 지역 수준에서 평활 근 세포의 혈관 반응은 막의 내 피 세포와 동맥을 둘러싼 지방 조직의 신호에 의해 변조 됩니다 (그림 1).

내 피는 수 동적 장벽 뿐만 아니라 혈액과 기저 혈관 평활 근 세포 사이의 신호를 교환 하는 표면 역할도 한다. 다양 한 혈관 활성 물질을 방출 함으로써, 내 피는 혈관 톤 응답의 국부 제어에 중요 한 역할을 한다¹. 예를 들어, 아 세 틸 콜린에 대 한 반응에서, 내 피 질 산화 질소 신 타제 (이 노스)는 산화 질소 (NO)를 생성 하는 내 피의 활성을 유발 하며,이는 용해성 guanylyl 사이 클론 (sGC) ^{을 활성화 시 킴으로써 기저 혈관 평활 근의 이완을 유도 한다 2}. 다른 혈관 활성 물질에는 cyclooxygenases의 생성물 (예를 들어, 프로 스테이 시 클로 및 트 라 보네 아) 및 시 토 크롬 P450 모노 자 나아 제 (예: 12 hydroxyeicosatetraenoic 산, 12 hete) 및 epoxyeicosatrienoic 산, EETs) 및 혈관 활성 펩타이드 (예컨대, 엔도 텔 린 1 및 안 지 오 텐 신 II) 및 내 피 유래 하이퍼 편광 인자 (EDHF)³. 내 피 유래 혈관 확장 제와 혈관 수축 기 사이의 섬세 한 균형이 국부 혈관 운동 톤^4,5를 유지 한다.

내 피 세포 기능 장애는 혈관 노화의 특징⁷인 내 피의 의존성의 혈관 확장⁶에서의 손상에 의해 특성화 된다. 나이가 들 수록 혈관 확장을 촉진 하는 내 피의 능력은 점진적으로 감소 하 게 되 고,이로 인해 혈 중 내 피 및 sGC에서의 비정상적인 발현 및 기능 뿐만 아니라 생체 이용률을 크게 감소 시 키 게 된다^{8 , 9 , 10}. 감소 된 생체 이용률은 내 피 의존성 혈관 수축^기의 생산을 증강 시킵니다. 나이 든 동맥에서, 내 피 세포 기능 장애는 벽 두께의 현저한 증가, 내측 핵의 수에 의해 반사 됨에 따라 배지에서 증식을 일으키고,이는 인간에서 관찰 되는 고혈압과 동맥 경화 증에서 동맥 농축을 연상 시키는 환자^13,14. 또한, 비만, 당뇨병 또는 고혈압과 같은 병 리 생리학적 조건은 내 피 세포 기능 장애의 개발을 촉진 하는^15,16.

혈관 주위 지방 조직 (PVAT)은 관 구조와 기능을 조절 하기 위해수많은 adipokines을 방출 합니다. Pvat의 항 수축 효과는 adiponectin, 과산화 수소 및 황화 수소^18,20과 같은 이완 요인에 의해 매개 됩니다. 그러나, 위치 및 병 리 생리학적 조건에 따라, PVAT는 또한 다양 한 동맥 (²¹)에서 수축 반응을 향상 시킬 수 있다. Pvat가 생산 하는 수축 물질에는 안 지 오 텐 신 II, 렙 틴, 레 시 틴이 있으며 ROS^22,23이 포함 되어 있습니다.  고립 된 혈관에 대 한 연구의 대부분에서, PVAT는 혈관 구조에 대 한 간단한 구조적 지원으로 간주 하 고 따라서 혈액 혈관 고리 세그먼트의 준비 동안 제거. 지방 기능 장애는 고혈압과 관련 된 심혈 관 합병증 (²⁴)에 대 한 독립적 인 위험 인자를 나타내며, 혈관을 둘러싼 pvat의 관 반응성을 조사할 때 고려해 야 합니다. 다른 동맥.

상기 다중 와이어 myograph 시스템은 대동맥, 장 간 막, 신장, 대 퇴, 대뇌 및 관상 동맥 (²⁵)을 포함 하는 다양 한 혈관의 혈관 운동 기능을 조사 하기 위해 널리 사용 되 고 있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 와이어 myography를 사용 하 여 PVAT의 변조에 특별 한 초점을 맞춘 유전자 변형 마우스 모델에서 분리 된 장 간 막 동맥의 혈관 반응성을 평가 합니다.

프로토콜

다음 연구에 사용 되는 모든 동물은 의학 학부의 실험실 동물 단위에 의해 제공 되었다, 홍콩의 대학. 윤리 승인은 교육 및 연구를 위한 실험실 동물의 사용에 대 한 부서별 위원회에서 얻어 졌습니다 (CULATR, 4085-16).

1. 준비

1. 약물의 제조
   1. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 명시 된 대로 약품을 수령한 직후에 보관 하십시오. 고 농도 원 액으로 용 매에 약물을 분말 형태로 녹여 서-20°c에서 보관 하십시오.
      참고: 대부분의 약물은 증류수에 용 해 되어 스톡 솔루션을 준비 합니다. 일부 약물에는가 열 또는 초음파 처리가 필요할 수 있습니다. 약물이 물에 완전히 녹지 않으면 1m의 NaOH를 첨가 할 수 있으며 기본 약물의 경우 1m HCl을 사용할 수 있습니다. 소수 성 약물은 dimethylsulfoxide (DMSO) 또는 절대 에탄올에 용 해 될 수 있다. 후자의 경우, 최종 욕 농도 (M)를 알고 있어야 하 고 적절 한 제어는 용 매의 효과를 배제 하기 위해 수행 되어야 한다.
   2. 실험 전에 크 렙 스 링거 중 탄산염 용액 (Krebs)에 약물을 용 해 하 여 약 액을 녹 인 후, 4.6 mm 115, 2.5 mM CaCl₂, 1.17 mmmgso4, 1.17 φ2k2 포₄,25mm 11.1 Mm D 글루코스 및 0.01의 EDTA, pH 7.4.
   3. 누적 농도-반응 곡선의 경우, 일련 희석을 통해 다양 한 약물의 주식 및 작업 용액을 준비 합니다 (표 1).
2. 계측기 설정
   1. 모든 채널의 힘 트랜스듀서를 매일 또는 시스템을 움직일 때마다 myograph 시스템을 사용 하기 전에 교정 합니다.
      참고: 자세한 교정 절차는 모델에 따라 다릅니다. 일반적으로, 2 그램 무게는 턱에 적용 되 고 상응 하는 힘은 9.81 ± 0.1 mN 이어야 한다. 판독값이 0.1 mN 이상 꺼져 있으면 변환기를 다시 교정 해야 합니다. 본 프로토콜에서 사용 되는 시스템의 경우 ( 재료 표참조) 캘리브레이션 중에 포스 트랜스듀서에 대 한 작동 값은 3000과 3500 사이 여야 합니다. 트랜스듀서 값이 높거나 낮을 경우, 힘 트랜스듀서를 교체 해야 합니다.
   2. 각 챔버에서 장착 지지대를 조정 하 고 정렬 합니다. Myograph 챔버의 지속적이 고 반복적인 사용은 장착 지지대의 부정합을 유발할 수 있으며,이는 턱이 제대로 정렬 되도록 하기 위해 실험 전에 때때로 조정이 필요 합니다.
      주: 힘 트랜스듀서는 매우 민감하고 깨지기 쉽기 때문에 장착 지지대를 조정할 때 특별 한 주의가 필요 합니다.
   3. 상기 실험 전에 30 분 이상의 히터 및 가스 (95% o2 및5% co2)를 사용 하 여 챔버 및 완충 액을 37 ± 0.1 ° c까지가 온 하 고 기체 혼합물과 평형 화 시킬 수 있도록 한다.
      1. 온도계의 온도를 확인 하 여 히터의 정확도를 확인 하십시오. 온도는 냉각 또는 온난화 실험을 실행 하도록 수정할 수 있습니다. 온도가 설정 된 대로 올바르지 않으면 기기의 오프셋 기능을 적용 하 여 필요한 온도에 도달 하도록 설정을 늘리거나 줄입니다.
   4. 실험이 끝날 때, 모든 챔버를 청소 하 고 히터 뿐만 아니라 설정에 실행 가스를 끄십시오.
      1. 챔버의 모든 액체가 시스템에서 빨려 들어가 전에 가스를 끄지 마십시오, 그렇지 않으면 산/증류수는 역류 하 고 다음 사용 중에 장기 챔버에 도달 할 수 있습니다.
      2. 와이어 묘 그래프의 챔버를 청소 하기 위해, 가장 효과적인 방법은 희석 아세트산 용액을 사용 하 여 산 세척을 수행 하는 것 이다. 면봉으로 챔버의 가장자리와 내부를 청소 하십시오.
      3. 세척 후, 챔버를 증류수로 철저히 헹 궈 냅니다. 젖은 천으로 챔버의 바깥을 닦아 말린 소금을 제거 하십시오. 에탄올은 또한 실험 중에 소수 성 약물이 사용 된 경우에도 사용 될 수 있다.
      4. 세척 절차의 예는 다음과 같다. 8% 아세트산 용액으로 챔버를 채우고 2 분 동안 배양 합니다. 코 튼 팁 어플리케이터를 사용 하 여 스틸 챔버 표면을 기계적으로 청소 합니다. Myograph의 알루미늄 부분과의 접촉을 피하십시오.
      5. 아세트산을 흡입 하 고 myograph 챔버를 세척 하 고 증류수로 여러 번 지원 하 고 흡수 성 종이 또는 면 팁 애플리 케이 터를 사용 하 여 표면을 건조 시킵니다.
3. 장 간 막 동맥 고리의 해 부
   참고: 현재 연구에 사용 된 동물은 고 지방 식이 요법으로 남성 Adipo-SIRT1 마우스와 야생 형 리 테 메이 트를 컨트롤로 공급 하였다. 각 동물은 실험 시 약 45 g을 무게.
   1. Pentobarbital 나트륨 50)의 주입을 복 강 내 하 여 마우스를 안락사 시켰다.
   2. 외과가 위 및 집게로, 중간 라인 개복 술을 수행 하 여 복 부 내용물을 드러냅니다.
   3. 메 장 간 아케이드를 실리콘 코팅 된 페 트리 접시에 모으십시오.
   4. 장 간 망을 확산 하 고 핀으로 하 여 페 트리 디쉬의 분기를 표시 하 고 결합 조직의 메시 작업을 한다.
   5. 현미경 (10 배) 하에서,가 위 및 집게를 사용 하 여 주위의 결합 조직을 조심 스럽게 분해 합니다. 모험 층을 손상 시 키 지 마십시오. 대안적으로, 주변 지방 조직은 실험을 위해 혈관 주위에 유지 될 수 있다 (필요한 경우).
   6. 미세가 위 및 집게를 사용 하 여 얼음-차가운 Krebs 완충 액에서 장 간 막 동맥의 2 차 분 지를 소비 합니다.
      참고: 각 연구원은 자신의 해 부 키트, 문자열 및 등 자 세트를가지고 있어야 합니다. 이 도구는 일부 약물이 떨어져 세척 하기 어렵고 잔류물이 그들에 게 충실 할 수 있기 때문에 실험 후 모든 시간을 올바르게 유지 하 고 청소 해야 합니다.
      1. PVAT를 포함 한 주변 결합 조직을 분리 하면서 혈관을 차가운 Krebs 완충 액에 보관 하십시오. 혈관을 처리 하는 동안, 내 피에 불필요 한 손상을 방지 하기 위해 부드럽게.
      2. 실험은 PVAT의 연구를 포함 하는 경우, 혈관 주위 PVAT의 2mm 직경의 1.5을 유지 한다. 대안적으로, 동일한 양의 지방 조직이 실험을 위해 각 챔버에서 첨가 될 수 있다.
   7. 선택적 해 부 혈관 으로부터 내 피를 제거 하 여 대조 군으로 서 반응의 내 피의 의존성을 평가 하였다. 장 간 동맥의 경우, 와이어 등을 통해 부드럽게 롤링 하 여 내 피를 제거 또는 머리.
   8. 위와 같이 준비 된 혈관을 작은 고리 (~ 2mm 길이)로 자른 후 와이어의 챔버에 설치 하기 위해 (95% O2 및 5% CO2 ) 크 렙 스 완충액으로 가득 찬 플라스틱 접시에 넣습니다.
   9. 용기 링을 현미경으로 배치 된 myograph 챔버로 전달 합니다. 링은 상부 및 하 부 등 자 평행 하 게 고르게 배치 되어야 합니다. 부착 와이어 (40 µm)는 약물이 현에 결합할 수 있으므로 새로 준비 해야 합니다.
   10. 혈관 링을 와이어의 적당 한 길이 (2cm)에 놓고 나사에 의해 장착 챔버의 한 턱에 고정 하 여 위치를 고정 합니다.
   11. 링을 통해 두 번째 와이어를 전달 하 고 반대쪽 턱에 고정 합니다.
   12. 링을 스레드 하 고 챔버 턱에 고정 하 여 챔버를 myograph 설정에 마운트하고 마이크로미터 나사를 시계 방향으로 돌려 장착 된 챔버에 해당 하는 사용자 인터페이스에 대 한 힘 읽기가 0 이거나 그냥 있을 때까지 서로 가까이 와이어를 이동 합니다. 아래.
       참고: 위쪽 턱에 부착 된 와이어는 장력이 검출기에 완전히 형질 도입 수 있도록 최소한의 길이로 해야 합니다.
   13. 조정 가능한 마이크로미터를 사용 하 여 제 1 힘의 적용 이전에 적어도 30 분 동안 37 ° c에서 제제를 평형 화 한다.
   14. 115 mM의 조직 생존 율 평가 높은 칼륨 (염화 나트륨 은 몰 단위로 KCl 로 대체) 4.6 mm 염화 나트륨, 115 mm Kcl, 2.5 mm cacl ₂, 1.17 mm pH 7.4에서 11.1 mM D-포도 당.
       참고: 절연 용기는 수축 에이전트에 대 한 응답으로 수축 force 형질 도입 및 myograph 시스템의 데이터 기록 소프트웨어에서 기준선 이상의 편향으로 기록 된 경우 해당 휴식 톤의 40% 이상이 면 실행 가능한 것으로 간주 됩니다. 동맥이 적절 하 게 계약 하지 않는 경우, 최적의 기저 장력/벽 압력이 제대로 조정 되지 않았거나 혈관을 분리 하거나 장착 하는 동안 동맥이 손상 되었을 수 있습니다.
   15. 선택적 혈관의 수 축을 유도 하기 위해 페 닐를 적용 하 여 내 피 세포의 완전성을 평가 하 여 KCl에 대 한 초기 반응의 50%로 (데이터 기록 소프트웨어에서 포스 트랜스듀서에 의해 기록 됨), 1 µ M 아 세 틸 콜린을 첨가 하였다.
       참고: 좋은 혈관 준비는 일관 되 고 정확한 결과를 얻기 위해 중요 합니다. 내 피 성 무결성 검사가 불충분 하거나 KCl에 반응 하지 않으면 내 피 기능 또는 혈관 평활 근 수 축력을 나타내는 제제를 실험에 사용 하지 않아야 합니다. 이 경우, 제제는 동일한 혈관 또는 새로운 혈관 으로부터의 새로운 링으로 대체 되어야 한다.

2. 정규화는 최적의 초기 장력을 결정 하는

참고: 정규화 절차를 통해 혈관이 적절 한 휴식 mmHg (장 간 동맥에 대 한 100 또는 13.3 kPa)을 경험 하 고 최대 활성을 생성 하는 동맥의 최적의 내부 지름 (IC)을 결정할 수 있습니다. 혈관 활성 제에 반응 하 여 힘.

1. 컴퓨터를 켜고 데이터 기록 소프트웨어를 엽니다 ( 재질 표참조).
2. 원래 설정 파일을 덮어쓰지 않도록 새 이름을 사용 하 여 실험을 "LabChart 데이터 파일"로 저장 합니다.
3. 정규화 설정 창을 열고 k 계수를 1로 설정 합니다. 접 안 렌즈 교정 (0.3 용기 길이를 알 수 없는 경우 또는 용기 길이를 알고 있는 경우 1)의 기본값을 적용 하 고, 목표 압력 (13.3), 온라인 평균 시간 (60) 및 지연 시간을 허용 합니다. 확인 을 클릭 하 여 설정을 저장 합니다.
4. 관심 채널을 선택 하 고 와이어 지름 (40 µm), 조직 엔드포인트를 입력 합니다. a2: 측정 된 조직 길이), 정규화 창에서 초기 마이크로미터 판독값입니다.
5. 첫 번째 수동 스트레치를 혈관에 적용 하 여 정규화 절차를 시작 합니다 (마이크로미터 나사를 반시계 방향으로 돌립니다).
6. 선박이 안정화 될 때까지 기다린 후 (3 분) 정규화 창에 새로운 마이크로미터 판독값을 입력 합니다. 벽 장력이 자동으로 계산 되 고 그래프에 점으로 표시 됩니다.
   참고: 패시브 스트레치 중에 사용 되는 마이크로미터 "단계"는 동일할 필요가 없습니다. 처음 몇 뻗는 각각 20 µm 수 있습니다. 스트레치가 isobar 선에 가까워지면 단계를 10 µm, 5 µm, 2 µm 또는 더 작게 줄일 수 있습니다. 마이크로미터 설정을 조정 하는 동안 메인 차트 창을 열어 둘 수 있습니다-길이/장력 그래프 (사전 결정 된 값에 해당 하는 압력 점을 나타냄)에서 isobar 라인을 초과 하는 큰 스파이크가 나타나면 장력을 줄이십시오.
7. 각각의 패시브 스트레치 후에는 115의 KCl을 함유 하는이 소 삼 투 고 칼륨 크 렙 스로 조절 크 렙을 교체 하십시오. 수축이 고원 (약 3 분)에 도달할 때, 칼륨 활성화 힘에서 각 스트레칭에서의 패시브 힘을 빼서 활성 힘 (F)을 기록 합니다. 벽 장력 뿐만 아니라 내부 원주 (IC) 값을 계산 합니다.
   1. 활성 장력을 기준선 위의 편향으로 측정 합니다. 상기 활성 장력 (T)은 수학식에 기초 하 여 계산 되 고 Tm(mn/mm) x 2 x 용기 길이 (mm). 내부 둘레 (IC) 값은 마이크로미터 데이터에서 계산 됩니다 (IC = 205.6 µm + 2 간격).
8. 신선한 크 렙 스로 교체 하 여 높은 칼륨 상태를 제거 하십시오. 5 분 이상 세 번 반복 세탁 하십시오.
9. 활성 장력이 감소 하기 시작할 때까지 2.5 단계를 반복 하 여 (수동 스트레치 2.8를 유도 하 고 대체 회전에서 활성 수 축을 유발) 합니다 (그림 2).
10. 여러 번의 대체 신축이 끝난 후 수동 길이/인장 곡선은 IC100 mmHg의 내부 원주 값을 isobar 선과 교차 지점으로 서 100의 압력으로 제공 합니다.
    참고: 패시브 스트레치 중 각 마이크로미터 값은 소프트웨어 정규화 모듈에 수동으로 도입 됩니다. 프로그램은 자동으로 상응 하는 힘 측정을 기록 하 여 수동 길이/장력 곡선을 생성 하 여 IC100의 값을 isobar 선 (그림 2, 오른쪽 패널)과 함께 교차점으로 제공 합니다. 마지막 점은 isobar 라인에 가까울수록 더 나은 정상화 보다는 혈관을 손상 시 키 지 않고 있습니다. Isobar 선 보다 너무 멀리 있는 점은 장착 된 용기를 물리적으로 손상 시켜 실험 중에 신뢰할 수 없는 결과를 초래 합니다.
11. 활성 길이/장력 곡선을 작성 하 여 IC1 값을 결정 하 고, 이후 근 전도 실험에서이 유형의 혈관에 사용 되는 IC1/IC100의 비율로 정규화 k 계수를 계산 합니다.
    주: 활성 길이/장력 곡선은 x 축의 마이크로미터 데이터에서 계산 된 IC 값과 y 축의 활성 장력을 플로팅하여 작성 됩니다. IC1 피크 플라토 영역 내에 있는 값입니다 ( 그림 2, 오른쪽 패널의 빨간색 트레이스). 활성 길이/장력 커브를 플로팅 하 고 IC1를 결정 한 후, 정규화 k 팩터는 IC1/IC100의 비율로 계산 됩니다. 정규화 k 계수를 기준으로, IC1로 표시 되는 기준선에 대 한 최적 IC는 수동 길이/장력 곡선에 나타납니다. 이 IC에 대 한 마이크로미터 설정은 곡선 아래에 나타나며 이후 근 전도 실험을 위해 마이크로 포지 셔 너를 설정 하는 데 사용 해야 합니다. 초기 장력 (T)은 목표 압력 (Pi) x IC/2 π와 동일 하 게 선박에 적용 되는 최적 힘 (F)이 T x 2 x 용기 길이와 동일 하다.
12. 높은 칼륨 크 렙 스를 철저히 씻어 내 고 준비를 30 ~ 45 분 정도 평형 화 시킵니다. 후속 실험 중에 활성 수축 응답만 기록 되도록 기저 장력을 "0"으로 재설정 합니다.

3. 페 닐 유도 수축

참고: 혈관 수축 반응을 유도 하기 위해 선택 될 수 있는 약물은 비 특이 적 아드레날린 수용 체 작용 제 노르, 선택적 α-1 아드레날린 수용 체 작용 제 페 닐, 안 지 오 텐 신 2 II, 및 모노 아민을 포함 한다 신경 전달 물질 5-트립토판. 페 닐는 시험 (재료 표)에 대 한 본 의정서에 사용 된다.

1. 1.3 절에 설명 된 바와 같이 쌍을 이루는 동맥 고리를 준비 하 고 설치 합니다 (PVAT를 그대로 사용 하 고 다른 하나는 PVAT를 제거한 후 각 동맥의 인접 섹션에서 실험을 위해).
2. 정규화 후 (2 절에서 설명) 크 렙 스를 포함 하는 챔버에 115 mM KCl 용액을 첨가 하 여 높은 칼륨 Krebs 완충 액으로 동맥 세그먼트를 사전 계약 합니다.
3. (3 분), 고 칼륨을 세척 하 고 신선한 공기 크 렙 스 버퍼로 대체 하 여 수 축을 기다립니다. 5 분 이상 3 회 세탁을 반복 합니다.
4. Kcl 자극을 반복 하 고 세 번 세척 한 후 kcl 자극으로 인 한 장력에서 기준선 장력을 빼서 KCl에 최대 수축 응답/장력을 기록 합니다.
5. 마지막 수축과 세척 후, 챔버를 따뜻하고 기포로 된 크 렙 스 버퍼로 리필 하 고 다음 작업을 수행 하기 전에 동맥이 약 30 분 동안 회복 되도록 합니다.
6. 각 챔버에 페 닐의 누적 량 (10 ~ 10 ~ 10^-4 미터 의 절반 로그 증분)을 추가 하 여 정 동작 제제의 등각 투영 장력의 농도 의존적 증가를 유도 한다.
7. 먼저 챔버에 저 농도의 작용 제를 첨가 하 여 시작 한다. 안정 된 수축에 충분 한 시간을 허용한 후 (3 ~ 5 분) 다음 농도를 추가 하십시오. 페 닐 농도가 증가할수록 단계를 반복 합니다.
8. 아 고 니스 트 (페 닐)의 마지막 복용량을 추가 한 후, 약물을 철저히 씻고 신선한 크 렙 스 버퍼로 챔버를 리필 하십시오. 농도 의존적 응답을 KCl로 유도 되는 최대 수축 률의 증가 비율로 플로팅합니다 (그림 3).
9. 선택적 NO의 기여를 평가 하기 위해, 페 닐를 첨가 하기 전에 30 분 동안 NO 신 타제 억제제, L 이름 (104m)을 사용 하 여 제제를 배양 한다. L-이름은 장 간 막 동맥의 정 동작 준비에서 페 닐 유도 된 수축이 향상 됩니다 (그림 4).
   참고: 억제제 또는 길 항 제는 평형 화를 달성 하기에 충분 한 시간을 가져야 합니다 (일반적으로 30 ~ 45 분).
10. 제 2 농도-응답 곡선을 순차적으로 수행 하는 경우, 톤의 더 이상 변화가 관찰 되지 않는 한 이전 작용 제의 모두를 제거 하기 위해 챔버를 완전히 반복적으로 세척 한다.
    참고: 평행 실험은 동일한 혈관에서 주 작동 근에 게 서 얻은 적어도 2 개의 고리를 노출 하 고, 제어 조건 하에서 하나는 억제제 (들)의 존재 하에 하나; 각 링에서 농도-응답 곡선은 한 번만 수행 됩니다. 이는 약물의 작용 및 혈관 민감성에 대 한 더 나은 제어를 제공 하기 때문에 평행 실험을 수행 하는 것이 바람직하다. 시리얼 실험은 단일 고리에서 작용 제에 대 한 농도-응답 곡선을 얻는다; 세척 하 고 실험 조건 (예: 억제제 추가)을 변경한 다음 동일한 고리에서 농도 응답 곡선을 반복 합니다. 이 경우 시간 제어는 약물 응답이 시간이 지남에 따라 조직의 변화로 인 한 것이 아니라는 것을 보여주기 위해 필요 합니다. 하나는 조직이 농도 반응 실험에 노출 된 후에 정확히 동일한 상태에 있다는 것을 확신할 수 없다. 충분 한 시간 (최소 30 ~ 60 분)은 용기 세그먼트가 자신의 휴식 (기저) 장력으로 돌아갈 수 있도록 주어져야 합니다. 어떤 경우에는 수용 체에서 높은 친화도 작용 제의 해리 후 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다. 또한, 높은 칼륨 크 렙 스는 탈 감 작²⁸을 감소 시키기 위해 누적 농도 반응 곡선 사이에 적용 될 수 있다. 대부분의 길 항 제는 완전히 씻어 낼 수 없으므로 실험의 나머지 부분에 계속 추가 해야 합니다.

4. 내 피 의존성 이완/수축

1. 새로 장착 된 동맥 세그먼트를 사전 계약 (3.2 단계에서 3.5에 설명 된 대로). 다시 말하지만, KCl 자극으로 인 한 장력의 기준선 장력을 빼서 KCl에 대 한 최대 수축 응답/장력을 기록 합니다.
2. 선택적 U46619을 첨가 하기 전에 30 분 동안 NO 신 타제 억제제, L 이름 (104m)을 사용 하 여 제제를 배양 한다.
3. U46619의 미리 계산 된 농도를 챔버에 추가 하 고 동맥 세그먼트의 안정적이 고 지속적인 수 축을 허용 합니다.
   참고: 혈관 확장 반응은 115 mM KCl에 대 한 최대 응답의 약 80%로 사전 계약 된 장 간 동맥에서 유도 됩니다. 다른 촉진제는 그들의 특정 수용 체의 활성화에 의해 수 축을 유도 하는 데 사용 됩니다. 여기에서 PVAT가 있거나 없는 혈관 세그먼트는 U46619로 사전 계약 됩니다 (1 ~ 3 x 10^-8m ; 물질의 표), 트로 코 박스 네 A2 수용 체 작용 제, 안정적이 고 지속적인 평활 근 수 축을 유도 한다.
4. 장기 실에 아 세 틸 콜린 (10 ~ 10 ~^4m )의 누적 농도를 추가 합니다. 동맥 세그먼트의 농도 의존적 혈관 확장 반응은 U46619 유도 된 수축 반응의 백분율로 제시 됩니다 (그림 5).
   참고: 대부분의 실험에서, 다음 농도의 이완 작용 제를 즉시 첨가 하 여 긴장이 긴장에 반동 하는 것을 방지 하는 것을 관찰 해야 합니다. 동맥 세그먼트의 농도 의존성 혈관 확장 반응은 U46619 유도 된 수축 반응의 백분율로 정상화 되어 신경 분포의 사소한 차이와 동맥 세그먼트 사이의 직경을 조정 합니다 (그림 5). 6 개 이상의 실험 그룹이 통계적으로 분석 될 때 동일한 혈관에서 얻은 개별 고리 사이의 응답성에 있는 작은 variabilities가 최소화 됩니다. 개별 조직의 최대 수 축의 백분율로 응답을 표현 하는 경우, 쌍을 이루는 분석 (예: 페어링된 학생의 t 검정)을 사용 하 여 서로 다른 동물에서 동일한 유형의 조직 반응을 비교 하는 것이 적절 합니다. 개입 전후 단일 조직의 반응. PVAT의 효과를 분석할 때 양방향 ANOVA를 사용 하 여 다중 비교 테스트를 수행 합니다.
5. 이완 작용 제의 최종 용량을 추가한 후, 각 챔버에서 약물을 제거 하 고 신선한 Krebs 완충 액으로 리필 하십시오. 크 렙 스 버퍼로 챔버를 깨끗이 씻고 추가 실험을 수행 하기 전에 적어도 45 분 동안 동맥을 안정화 시키십시오.

결과

정규화 인자 k 를 구하는 길이/인장 관계의 시험

혈관 세그먼트에 적용 되는 스트레칭의 양은 액 틴의 상호 작용의 정도에 영향을 미치며, 따라서 최대의 활성 력이 개발 되었습니다. 따라서, 모든 유형의 혈관에 대해, 최대 활성 력에 필요한 스트레칭 양을 결정 하는 것은 적절 한 근 전도 연구에 필요 합니?...

토론

내 피 세포 외에 PVAT에서 유래한 신호는 평활 근 톤 반응성의 조절에 중요 한 역할을 한다 (³⁰). 건강 한 pvat는 비만 및 대사 증후군^31,32와 같은 병리학 적 상태에서 손실 되는 동맥에 대 한 항 수축 효과를 발휘 하는 NO 및 항 염증 adiponectin을 방출 합니다. 질병 상태에서 pvat는 내 피 세포 기능 장애 및 기타 심혈 관 이상³³...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools