대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

요약

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

초록

세포 자 멸은 자연 스러운 과정으로 서 배아 발달, 항상성 조절, 면역 내성 유도 및 염증의 해결에 중요 한 역할을 한다. 바디에 있는 사 멸 파편의 축적은 시간이 지남에 따라 전신 자기 면역 질병으로 이끌어 내는 만성 선 동적인 반응을 시작할 수 있습니다. 손상 된 사 멸 세포 클리어런스는 다양 한 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 사 멸 클리어런스는 생리학적 조건에서 거의 검출 되지 않는 복잡 한 과정입니다. 그것은 풍부한 표면 수용 체 및 신호 분자를 포함 한다. 사 멸 세포 클리어런스 과정을 연구 하는 것은 통찰력 있는 분자 메커니즘과 후속 생물학적 반응을 제공 하 여 새로운 치료제의 발달로 이어질 수 있습니다. 여기에서 우리는 사 멸 티 모 세포의 유도를 위한 프로토콜, 복 막 대 식 세포의 준비, 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에의 한 사 멸 세포 클리어런스 분석을 설명 합니다. 모든 세포는 특정 단계에서 아 폽 토시 스를 겪을 것 이며, 많은 주거 및 순환 세포는 사 멸 파편을 흡수 할 수 있다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 많은 다른 세포 유형에 의해 사 멸 세포 결합 및 섭취를 특성화 하기 위해 여러 응용 프로그램에서 사용 될 수 있습니다.

서문

우리 몸은 매일 1-10 억 사 멸 세포를 생성 합니다. 이러한 많은 수의 사 멸 세포는 면역 반응이 정지 상태를 유지 하는 방식으로 지워야 합니다. 적시에 사 멸 세포의 틈새를 지키기 위하여는, 조직 주민 세포의 수많은 모형 및 회람 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 하는 기계 장치를 개발 합니다¹. 아 폽 토시 스의 기능 장애 조절은 다양 한 염증 성 질환 및 자기 면역의 발병 및 진행에 연루 되어 있다². 아 폽 토시 스는 또한 종래의 치료법^3,4에 대 한 그의 후속 내성 및 암 발병의 발병 기 전에 서 중요 한 역할을 한다. 사 멸 세포의 제거는 일반적으로 면역 내성⁵에 연결 될 수 있는 항 염증 반응을 촉진 합니다. 사 멸 세포 클리어런스의 교란은 자기 면역을 촉진 하 고 인간 및 생쥐⁶의 전신 자가 면역 질환의 발병에 기여 합니다.

세포가 아 폽 토시 스를 겪을 때, 그들은 포스 파티 딜 세 린 (PtdSer)을 내부 리플 렛에서 멤브레인의 외부 리플 렛에 노출 시킵니다. PtdSer는 표면 수용 체를 통해 식 세포에 의해 인식 될 것입니다. 12 개 이상의 수용 체는 사 멸 세포의 침 몰을 인식 및/또는 촉진 하는 것으로 확인 되었습니다. 일반적으로, 사 멸 세포 클리어런스에 관여 하는 표면 수용 체의 적어도 3 가지의 종류가 있습니다: 테 더 링 수용 체, 사 멸 세포를 인식; 수용 체 간 질, 침 몰 시작; 수용 체, 전체 과정을 용이 하 게⁷. 탐 수용 체 티로신 키나 제 (TAM RTKs)는 Tyro-3, xl 및 Mer로 구성 되 고 주로 면역 시스템 (⁸)의 골수성 세포에 의해 표현 된다. TAM RTKs의 주된 기능은 테 더 링 수용 체 역할을 하 여 사 멸 세포와 파편의 포식 제거를 촉진 하는 것입니다. 우리 그룹은 수 년 동안 자동 면역의 설정에서 TAM 매개 사 멸 세포 클리어런스를 연구 했습니다. 비타민 K-의존성 단백질 성장 체포 특이 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S (프로)는 탐 수용 체를 결합 및활성화 시킨다. Gas6는 심장, 신장 및 폐에서 생산 됩니다. 프로는 주로 간에 서 생산¹¹. TAM은 Gas6/프로의 N-말단이 사 멸 세포에 PtdSer에 결합 하 고 Gas6/프로의 C-말단을 식 세포의 표면에 부착 된 탐 수용 체에 결합 하는 방식으로 사 멸 셀을 인식 한다. 다른 수용 체와 함께, 사 멸 세포의 침 몰은 발생¹². Mer는 리간드 프로와 Gas6 모두에 결합할 수 있지만, 우리는 항-메 르 항 체 (¹³)에 의해 차단 될 수 있는 사 멸 세포에 대 한 mer 매개 식 세포의 포식에 대 한 유일한 리간드 인 것으로 Gas6 것으로 나타났습니다. 대 식 세포는 전문 포식 세포입니다. 식 세포에의 한 사 멸 세포의 급속 한 클리어런스는 세포내 항 원에 대 한 염증 및 자가 면역 반응의 억제에 중요 합니다. Mer 수용 체 티로신 키나 아 제는 대 식 세포 침 적 및 효율적인 사 멸 셀 (¹⁴)의 클리어런스에 중요 하다. 마우스 비장에서 Mer는 주로 한계 구역과 유형 신체 대 식 세포¹³에 대해 표현 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜은 세포 사 멸을 유도 하 고 efferocytosis의 과정과 효율성을 측정 하는 방법을 입증 하는 기본적인 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 기원의 사 멸 세포의 침 몰에서 다른 세포 유형에 의해 efferocytosis를 연구 하기 위하여 쉽게 적응 될 수 있습니다.

프로토콜

실험 마우스는 우리의 마우스 콜로 니에서 사육 되 고 유지 되었다. 모든 동물 작업은 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행 되었다.

1. CFSE 표지 된 사 멸 계 세포의 준비

1. 두 명의 순진한 C57/B6 마우스를 CO2 흡입 하 여 흉 강을 열고 해 부에 2 개의 생쥐를 안락사 시키고, 10 ML의 RPMI1640 배지를 함유 하는 조직 배양 페 트리 디쉬에 곡선형 파인 팁 집게를 사용 하 여 흉 선을 제거 한다.
2. 현미경 슬라이드의 두 프 로스트 엔드에 대해 전체 흉 선을 연 삭 하 여 단일 세포 현 탁 액을 얻은 다음 100 μ m 세포 스 트레이너를 통해 현 탁 액을 필터링 합니다.
3. 10 mL의 흉 선 현 탁 액을 50 mL 튜브에 넣고, 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 합니다.
4. 상층 액을 제거 하 고, 1pb1의 40 mL의 소생을 하 고, 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.
5. 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 제거 한다.
6. 50 mL 튜브의 단일 세포 현 탁 액으로 서 20ml(12 x 8 세포 이상)의 1 세포 서 스 펜 션으로 20 ML의 pbs에서 소생 하 여 다른 50 ml 튜브에서 1xpbs의 다른 20ml의 다른 세포를 소생 시켰다.
7. 5 μ m의 cfse를 별도의 50 ml 튜브에 1pbs의 동일한 부피 (20ml)로 만들고 cfse 스톡 솔루션 (2.5 mM)의 40 μ l을 1x pbs로 파이 펫 팅 하 고 2-3 튜브를 반전 하 여 잘 섞어 줍니다.
8. 1.7 단계에서 CFSE 20 mL를 1.6 단계에서 20 mL의 세포 현 탁 액으로 추가 합니다 (CFSE의 최종 농도는 지금 2.5 μ m).
   참고: 20Ml 셀 서 스 펜 션 마다 20 mL의 CFSE 튜브가 필요 합니다.
9. 세포 및 CFSE 혼합물 튜브를 2-3 번 반전 하 고 실 온에서 최대 2 분 동안 암실에서 혼합물을 배양 한 후, 열 불 활성화 말 세럼 10ml를 첨가 하 여 반응을 중지 한다.
10. 50 mL 튜브 혼합물을 실 온에서 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기.
    참고: CFSE 라벨링이 성공적 이면 셀 펠 릿은 컬러로 연한 노란색이 됩니다.
11. 상층 액을 제거 하 고 세포 펠 릿을 1x PBS의 40 mL로 소생 하 고 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.
12. 세포 현 탁 액을 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버립니다.
13. RPMI1640 배지 40 mL로 세포 펠 렛을 다시 씻으십시오.
14. RPMI1640 조직 배양 배지에서 상 등 액 및 소생 세포를 제거 하 고, 100 mm 조직 배양 접시에 7x106 세포/m l의 농도로 10% FBS (열 불 활성화), 20mm 글루타민 및 1x 펜/ strep를 사용 한다.
    참고: 더 많은 세포를 얻을 경우, 별도의 100 mm 조직 배양 접시가 필요 합니다.
15. 5% CO2와 함께 공급 되는 조직 배양 인큐베이터에서 37 ° c에서 4 시간 동안 최종 농도 1 μ m의 세포 현 탁 액 배양 물에 슈 타우 로스포 린을 첨가 한다.

2. 복 막 대 식 세포의 제조

1. 두 개의 C57B6 마우스 (또는 실험실에서 유전자 조작 된 마우스)를 주사 하 여 0 일째에 3% 숙성 된 티 오 글 리 한을 1 mL로 복 강 내.
2. 단계 1.1에서와 같이 5 일째에 마우스를 안락사 시키고, 복 부 피부를 절단 하 고 껍질을 벗 겨 내 고 그대로 복 막 상태로 남겨 둡니다. 18G 바늘이 부착 된 10ml 주사기를 사용 하 여 10 mL의 세척 완충 액 (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA)을 복 강 내로 빠르게 밀어 복 강 세척.
3. 동일한 바늘/주사기로 세척 버퍼를 천천히 검색 하 고 세척 완충 액을 50 mL 튜브에 모읍니다 (자세한 내용은 Janssen 연구소 제^15조참조).
4. 복 막가 위를 1x PBS로 2 회 세척 하 고 24 웰 플레이트의 각 웰에 RPMI1640 세포/m l 및 분 취 액 500 μ l의 밀도로 하 여 조직 배양 배지에서 복 막 대 식 세포를 소생 시켰다. 2 시간 동안 티슈 배양 인큐베이터에 플레이트를 남겨 두십시오.
5. 신선한 배양 배지를 2 ~ 500 μ l로 흡입 및 교체 하 여 부유 세포를 제거 하십시오.
6. 선택적으로, 탐 수용 체 티로신 억제제, RXDX-106을 추가 하 고,도 전설에 나타난 농도에서 대 식 세포 배양의 각각의 웰에 넣고 또 다른 2 h를 배양 한다.

3. 사 멸 티 세포가 있는 복 막 대 식 세포의 공동 배양

1. 1 단계에서 사 멸 티 모 세포를 수집 하 고 RPMI1640 배지로 세 번 씻으십시오. 사 멸 유도의 효율은 아 넥 타 V/7-AAD 키트와 함께이 단계에서 측정할 수 있습니다.
2. 실험 배열 (예: 도 1참조)에 따라 #2 프로토콜 로부터 대 식 세포 배양 액의 각각의 웰에 0-12 x⁶ 세포 (500 μ l 배지)를 분배 한다. 이는 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 전체 배양 체적을 만든다. 사 멸 티 모 세포를 첨가 하기 직전에 상기 배양 액에 블로킹 항 체를 첨가 한다.
3. 세포 혼합물을 4 시간 동안 37 ° c에서 5% CO2와 함께 공급 된 조직 배양 인큐베이터에서 배양 한다.
4. 배양 액의 각 웰을 1x PBS (500 μ m EDTA를 함유)로 2 회 세척 하 여 자유 부유 사 멸 세포를 제거 한다.
5. 이 단계에서 CD11b으로 플레이트 바인딩된 대 식 세포를 얼룩.
   1. 염색 완충 액으로 플레이트에 바인딩된 대 식 세포를 한 번 세척 하십시오 (PBS 1% BSA).
   2. 각 웰에 CD11b 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.
   3. 플레이트를 4°c에서 20 분 동안 배양 하였다.
   4. 염색 완충 제를 사용 하 여 각 접시를 세 번 세척 합니다.
   5. 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 하 고, 형광 현미경 하에서 이미지 분석용 판을 진행 한다.
6. 대안적으로, PBS에 1% lidocaine를 첨가 하 고 37 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 플레이트 결합 대 식 세포를 분리 한다.
7. 반복 파이 펫 팅으로 플레이트 바운드 대 식 세포를 분리 합니다.
8. 대 식 세포 현 탁 액을 24 웰 플레이트의 각 웰에서 개별 5ml 둥근 바닥 FACS 튜브에 넣어 이동 합니다.
9. 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기.
10. 상층 액을 제거 하 고 CD11b (1:200 염색 완충 액에서의 희석)의 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.
11. 세포 현 탁 액을 4°c에서 20 분 동안 염색 버퍼로 배양 한다.
12. 염색 버퍼로 세포 현 탁 액을 두 번 씻으십시오.
13. 염색 버퍼의 200 μ l를 추가 하 고 유 세포 측정기로 FACS 분석을 진행 하 고 CFSE 양성 대 식 세포의 백분율을 분석 합니다.

결과

복 막 대 식 세포의 분석-사 멸 티 세포의 매개 침 몰. 복 막 대 식 세포 및 사 멸는 상기 프로토콜에 기재 된 바와 같이 제조 하 고 공동 배양 하였다. 대 식 세포는 분리 되 고 얼음에 20 분 동안 PE 공액 항 CD11b 항 체로 염색 되었다. 대 식 세포는 이어서 유 세포 계에서 세척 및 처리 되었다. 본 바와 같이, 사 멸 세포가 배양 물에 첨가 되지 않았을 때 우측 하단 사분면에는 CFSE 양성 대 식...

토론

세포 사 멸은 많은 신호 캐스케이드를 수반 하 고 단백질 발현, 분 비 및 수송을 유도 하는 고도로 보존 된 세포 사 멸 과정 이다. 아 폽 토시 스는 종종 세포 형태학 변화 (¹⁷)와 연관 된다. 사 멸 세포는 사이트에 이주 하 고 엄격한 통제¹⁸에서 매우 복잡 한 통로의 과정을 시작 하는 포식을 유치 하는 사이토카인 및 케 모카 인를 활발히 풀어 놓습니다. 한편, 괴 사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.