학습 및 기억 테스트를 위한 저비용의 냄새-보상 연관 과제

요약

냄새-보상, 연상 학습 과제를 사용하여 장기 및 단기 기억에 대한 생리적 조작의 차별적 효과를 조사했습니다.

초록

식욕 왕복, 연상 기억에 대한 강력하고 단순한 행동 패러다임은 기억의 세포 및 분자 메커니즘에 관심이 있는 연구자에게 매우 중요합니다. 이 논문에서는 생리적 조작(예: 약리학적 제제 주입)이 냄새 보상 기억의 학습 속도와 지속 시간에 미치는 영향을 조사하기 위한 효과적이고 저렴한 마우스 행동 프로토콜에 대해 설명합니다. 대표적인 결과는 단기(STM) 및 장기 기억(LTM)에서 티로신 키나아제 수용체 활성의 차등적인 역할을 조사한 연구에서 제공됩니다. 수컷 마우스는 두 가지 냄새 중 하나와 보상(설탕 알갱이)을 연관시키도록 조건화되었으며, 연관성에 대한 기억은 2시간 또는 48시간 후에 테스트되었습니다. 훈련 직전에 티로신 키나아제(Trk) 수용체 억제제 또는 비히클 주입제를 후각구(OB)에 전달했습니다. 주입이 학습률에 미치는 영향은 없었지만, 산부인과에서 Trk 수용체의 차단은 단기 기억(STM, 2시간)이 아닌 LTM(48시간)을 선택적으로 손상시켰습니다. LTM 손상은 굴착 시간의 길이로 측정된 냄새 선택성 감소에 기인합니다. 이 실험 결과의 절정은 OB의 Trk 수용체 활성화가 후각 기억 통합의 핵심임을 보여주었습니다.

서문

연상 기억 형성의 메커니즘은 이전에 주로 1회 임상시험 공포 조건화 연구를 기반으로 조사되었습니다. 그러나 많은 일상적인 작업은 일반적으로 더 복잡한 습득 패턴을 가지며 반복적인 만남에 의존합니다. 이 프로토콜의 목표는 다중 시도 식욕 학습 및 기억의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 데 사용되는 비용 효율적인 설치류 행동 패러다임을 제공하는 것입니다.

주 후각구(OB)에 의존하는 냄새 학습은 다중 시도 식욕 기억 연구에 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 산부인과 의존성 기억은 지속 시간(STM, LTM, 중기 기억¹)이 다양하며, 신경 조절⁴, 장기 강화⁵, 성인 신경 발생 ^6,7,8 등 뇌의 다른 곳과 동일한 분자 ^2,3 및 구조적 메커니즘에 의존합니다. 둘째, 해마와 같은 고차원 영역과 대조적으로 OB 의존 기억은 지각 환경의 실험자 조작과 학습을 담당하는 신경 회로의 변화 사이의 보다 직접적인 대응을 관찰할 수 있습니다 ^8,9,10,11. 이 논문에서는 일반적인 분자 및 구조 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있는 OB 의존적 연관 학습 및 기억 패러다임에 대해 자세히 설명합니다. 연구자들이 기억의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해 후각 학습의 이점에 접근할 수 있도록 개발되었습니다.

최근 간행물³에서 여기에 설명된 프로토콜은 식욕 냄새 학습의 통합이 OB 내 Trk 수용체 활성화에 의존한다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 아래 프로토콜에서는 다양한 실험 요구에 맞게 행동 패러다임을 조정할 수 있는 영역도 논의됩니다.

이 연구에는 캐뉼레이션 당시 8주령 된 총 27마리의 성인 수컷 CD-1 마우스가 사용되었습니다. 정확한 그룹 분포 및 냄새 세트 사용은 이전 간행물³의 방법 섹션을 참조하십시오. 수컷 쥐는 에스트로겐 수치의 큰 변동을 피하기 위해 사용되었는데, 이전 연구¹² 에서는 에스트로겐 수치가 증가하면 후각 기억이 향상된다는 것을 보여주었기 때문이다. 이 쥐는 항상 12:12 시간의 역 밝기 / 어둡기 주기로 유지되었으며 물에 접근 할 수있었습니다. 행동 실험 동안, 생쥐의 식단은 자유 사료 체중의 ~90%로 유지되도록 제한되었습니다. 다이어트 제한은 행동 실험이 시작되기 3일 전부터 시작되었다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 동일한 세트의 마우스는 동물 사용을 최소화하면서 적절한 수준의 통계적 검정력에 도달하기 위해 서로 다른 냄새 세트를 제공합니다. 통계 분석 섹션에서는 이로 인해 발생할 수 있는 무작위 분산을 설명하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

아래 프로토콜은 Earlham College의 IACUC의 동물 관리 지침을 준수합니다.

1. 후각구 캐뉼레이션

참고: 이러한 수술은 큰 절개가 필요하지 않기 때문에 멸균 기술이 필요하지 않습니다. 그러나 각 기관마다 요구 사항이 다를 수 있습니다. 실험자가 면역이 저하된 마우스 균주에 대해 이 수술을 수행하는 경우 추가 고려 사항이 필요할 수 있습니다. 전체적으로 실험자는 사용하기 전에 수의사 및 동물 관리 팀과 이 프로토콜에 대해 논의하고 각 수술 사이에 모든 도구를 세척하고 소독하는 것이 좋습니다.

1. 설정하는 동안 캐뉼라와 나사를 32% 클로르헥시딘이 함유된 작은 비커나 페트리 접시에 담가 소독 상태를 유지하십시오.
2. 순수한 산소에 기체 상태의 4% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 입체택시 장치에 고정합니다. 수술 중에는 마우스가 콧방울을 통해 공급되는 1.5-2% 이소플루란 마취 상태로 유지되는지 확인합니다. 수술 내내 호흡을 모니터링합니다. 마취 상태에서 안구건조를 방지하기 위해 안연고를 사용하십시오.
3. 마우스가 고정되고 뒷발을 세게 꼬집어도 더 이상 반응하지 않으면 32% 클로르헥시딘을 사용하여 머리 꼭대기를 문질러 절개 표면을 청소합니다.
4. 다음으로, 리도카인(국소 진통제)으로 머리 윗부분을 꼬리 방향으로 문지릅니다.
5. 세게 눌러 깨끗한 메스 날로 정중선을 한 번 절개합니다.
6. 입체축에 부착된 드릴을 사용하여 브레그마에 대해 AP +5.0mm, ML +/-0.75mm 좌표를 사용하여 가이드 캐뉼라(26G)의 후각 전구 위에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
7. 소뇌 형성 부위에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
   알림: 이 나사의 위치는 정확할 필요가 없으며 정중선을 따라 대칭인지 확인하십시오.
8. 소뇌 형성 위에 있는 두 개의 구멍에 나사를 끼우고 조직 접착제를 사용하여 이 나사를 두개골에 고정합니다.
9. 입체축을 사용하여 가이드 캐뉼러(26G)를 후각 전구 위에 뚫린 구멍에 삽입합니다(1.6단계). 캐뉼러 DV를 1.0mm 내립니다.
10. 페트리 접시에 치과 시멘트를 섞습니다. 작은 금속 스쿱을 사용하여 캐뉼라 주위에 치과 시멘트를 천천히 쌓습니다. 5초 동안 말리십시오. 그런 다음 입체 장치의 암을 제거하고 과정에서 가이드 캐뉼라를 당기지 않도록 주의하십시오. 작은 뚜껑이 형성될 때까지 절개 부위 전체에 치과 시멘트를 계속 쌓습니다( 그림 1A 참조).
11. 이 시점에서 더미 플러그를 가이드 캐뉼러에 삽입하여 막힘을 방지하십시오.
12. 수술 직후 케토프로펜(0.2mg/kg)과 식염수(200μL)를 주사하여 통증을 줄이고 수분을 보충합니다. 수술 후 연화된 음식이나 하이드로겔을 생쥐에게 제공하십시오. 흉골 누운 상태를 유지하기 위해 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오.
    참고: 이 시점부터 생쥐도 단독으로 수용됩니다.
13. 식염수(200μL)와 케토프로펜(0.2mg/kg)을 하루 1회, 수술 후 2일 동안 투여한다.
14. 수술 후 2일에서 최대 5일 동안(필요에 따라) 쥐의 체중을 측정하고 체중을 모니터링합니다. 2-3일 이내에 체중이 수술 전 수준으로 돌아오지 않으면 적절한 수유 방법에 대해 수의사와 상담하십시오.
15. 행동 훈련을 시작하기 전에 쥐가 최소 7일 동안 회복할 수 있도록 합니다.

2. 연관 차별 과제

1. 시달렸다
   1. 다음과 같이 티로신 키나아제 수용체 억제제, K252a(50μM, 식염수 내 5% DMSO) 또는 비히클(식염수 내 5% DMSO)의 OB 특이적 주입을 마우스에 투여합니다.
      1. 양측으로 마우스의 OB에 주입액을 전달합니다. 이중 주입기 펌프를 사용하여 0.2 μL/min 주입 속도와 10분의 총 주입 시간으로 전구당 2.0 μL의 최종 부피를 주입합니다.
         참고: 조작 시기는 수행되는 행동 연구의 유형에 따라 조정될 수 있습니다. 정확한 주입 단계는 각 주입기 펌프에 따라 다르며 제조업체의 설명서에 나와 있습니다.
      2. 역류를 억제하고 확산을 촉진하기 위해 분만 후 약 5분 동안 캐뉼라 내부에 주입기를 그대로 두십시오. (즉, 각 주입에 대해 총 15분 계획).
2. 냄새가 굳습니다.
   1. 증기압을 기준으로 미리 계산된 비율을 사용하여 경질 미네랄 오일의 모든 냄새 물질을 1.0Pa의 부분 압력으로 희석합니다(표 1).
   2. 표 1의 5가지 개별 냄새 쌍을 사용합니다(표의 숫자는 1.0Pa에 대해 50mL 미네랄 오일을 혼합하기 위해 μL 단위의 부피를 나타냄).
   3. 행동 단계(섹션 2.3 및 3) 중에 사용할 향이 나는 모래를 준비하려면 놀이 모래 100g당 2.2.2단계의 1.0Pa 냄새 물질 400μL를 혼합합니다.
3. 형성
   알림: 마우스는 아래 설명된 대로 10일 동안 성형을 거쳐야 합니다.
   1. 생쥐를 시술실로 데려와 수술 후 회복 후 처음 이틀 동안 하루에 10분 동안 처리합니다.
   2. 3일차에 (+)-리모넨 향이 나는 모래로 채워진 페트리 접시를 쥐의 집 우리에 넣고 각각 5mg 질량의 약 10개의 자당 펠릿으로 채웁니다.
      참고: 보상된 냄새로 1.0Pa(+)-리모넨(50mL 미네랄 오일에 102μL 혼합)을 사용하고 보상되지 않은 냄새로 일반 미네랄 오일(테스트 냄새를 위한 희석제)을 사용합니다. 단분자 냄새 물질을 선택하는 것도 권장되는데, 이는 생쥐에게 가장 신기할 가능성이 높기 때문입니다.
   3. 4일차에 모래와 펠릿을 모두 보충합니다.
   4. 5일차와 6일차에는 쥐를 장치에 넣고 공간을 탐색하게 하여 쥐를 맞춤형 행동 장치에 적응시킵니다(그림 1B, C). 표준 가정용 케이지와 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 사용하여 두 개의 뚜껑과 검은색 중앙 칸막이를 구성하여 장치를 만듭니다. 뚜껑과 중앙 칸막이가 모두 가정용 케이지보다 1-2cm 더 큰지 확인하십시오.
   5. 리모넨 향이 나는 모래로 된 페트리 접시 하나와 미네랄 오일이 함유된 모래로 다른 접시를 준비합니다. 5일차와 6일차에 모두 적응한 후, 두 모래 접시를 모두 테스트 챔버에 넣고 10개의 자당 펠릿을 리모넨 향이 나는 접시에 섞어 보상으로 제공합니다. 각 쥐를 10분 동안 실험실에 넣고 보상 펠릿을 자유롭게 탐색하고 섭취할 수 있도록 합니다.
   6. 7일차에는 리모넨 향이 나는 모래와 미네랄 오일 향이 나는 모래가 들어 있는 접시를 행동 장치에 넣어 최종 테스트 절차의 요약본을 마우스에게 소개합니다. 이번에는 중앙 칸막이를 포함합니다.
      1. 리모넨 향이 나는 모래 위에 보상 하나를 놓고 쥐를 휴게실에 넣습니다.
      2. 마우스가 휴게실에 놓이면 중앙 칸막이를 들어 올려 마우스가 테스트 챔버에 들어가 모래가 채워진 접시를 조사하고 파낼 수 있도록 합니다. 보상 펠릿을 회수한 후 또는 5분이 경과한 후 마우스를 휴게실로 되돌립니다.
      3. 각 개별 마우스에 대해 총 10번의 시도에 대해 이 과정을 반복합니다. 보상이 주어지는 접시의 배치를 무작위 숫자 생성기를 사용하여 왼쪽 또는 오른쪽에 배치하는 균형을 맞추십시오. 트라이얼 사이에는 휴식 시간이 없습니다.
   7. 8일째에는 7일째의 시도를 반복하되 점차적으로 펠릿을 모래 깊숙이 묻습니다.
      참고: 대부분의 마우스는 8일차 10^번째 시험까지 보이지 않는 보상 펠릿을 파고 있어야 합니다.
   8. 9일차에 각 마우스에 대해 시도 횟수를 20회로 늘리고 자당 1분 동안 마우스를 테스트 챔버에 넣습니다. 쥐가 보상을 위해 두 접시를 모두 파게 하십시오.
   9. 10일째에 각 마우스에 대해 20번의 시도를 반복하되, 보상이 없는 접시를 파기 전에 보상이 없는 접시를 파면 다음 시도를 시작합니다. 보상(리모넨 향이 나는) 접시를 처음 파낸 쥐가 보상 펠릿을 회수한 후 휴게실로 다시 보낼 수 있도록 합니다.

3. 교육 및 테스트

참고: 쥐가 보이지 않는 냄새를 유발하는 보상 알갱이를 안정적으로 파기 시작하면 실험을 시작할 수 있습니다.

1. 훈련
   참고: 트레이닝 단계는 쉐이핑이 완료된 후 2일 후에 시작되며 각 마우스에 대해 20번의 시도로 구성됩니다. 교육 전에 구강 내 약물/차량 주입을 즉시 전달하고(주입에 대한 자세한 내용은 섹션 2.1 참조) 주입 직후 교육을 시작합니다.
   1. 휴게실에 마우스를 놓습니다.
   2. 새로운 냄새 쌍의 냄새가 나는 모래 접시 두 개를 실험실에 놓고, 보상 펠릿이 접시 중 하나에 묻혀 있습니다.
   3. 테스트 챔버가 준비되면 불투명 장벽을 들어 올리고 마우스를 테스트 챔버에 넣습니다. 쥐가 보상이 없는 접시를 먼저 파면 즉시 마우스를 휴게실로 되돌립니다(이 시도를 "0"으로 기록). 쥐가 보람 있는 냄새를 먼저 파헤치면 펠릿을 회수하여 휴게실로 되돌려 놓으십시오. 이러한 시도를 "1"로 기록합니다. 마우스가 보상을 회수하지 않고 시험이 1분 동안 지속되면 마우스를 휴게실로 다시 보냅니다.
   4. 접시를 청소하고 다시 채우고 다음 시도를 시작하십시오. 20개의 평가판에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
2. 테스트
   참고: 기억력 검사는 연구자가 원하는 기간 동안 수행할 수 있습니다. 이 실험에서는 STM과 LTM에 대한 K252a의 차등 영향에 대한 관심을 고려하여 훈련 후 2시간(STM) 또는 48시간(LTM)에 두 개의 개별 마우스 그룹을 테스트했습니다.
   1. 교육에 대해 설명된 것과 동일한 냄새 및 절차를 사용하여 테스트를 수행합니다(섹션 3.1).
      참고: 연구 질문에 따라 연구자는 대조군을 포함해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 이전에 발표된 실험에서는 기억 통합에 대한 Trk 수용체 차단의 효과를 연구했습니다³. 그러므로, 48시간 실험 전에 대조군에게 K252a를 주입하여 효과가 회수 방해로 인한 것이 아님을 보여주었습니다.
3. 통계 분석
   참고: 각 단계에 대한 SPSS 22.0 구문은 예제로 보충 파일로 제공됩니다.
   1. 선형 혼합 효과 분석을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 분산 분석과 달리 선형 혼합 효과 모델은 무작위 효과와 반복 측정을 더 잘 설명할 수 있습니다.
   2. 종속 측정값을 계산합니다: "정확한 비율". 3.1.3에서 마우스가 보람 있는 냄새를 먼저 파는 시험에 "1"이 할당되고, 보람 없는 냄새를 먼저 파면 "0"이 할당되었음을 상기하십시오. 5번의 시도마다 평균을 내서 4개의 시행 블록을 만들었다(결핵; 예를 들어, 시행 블록 1 또는 TB1은 시행 1-5의 평균, 시행 블록 2 또는 결핵 2는 시행 6-10의 평균인 식).
   3. 독립 변수 또는 고정 효과를 약물 그룹으로 설정합니다(K252a 또는 차량; 섹션 2.1.1) 및 평가판 블록(3.3.1)에서 확인할 수 있습니다. 아래의 대표적인 결과에서는 각 해석에 사용된 변수가 명시되어 있습니다.
   4. 마우스의 고유한 행동 차이와 여러 냄새 세트 사용의 영향을 보상하기 위해 마우스 내에 중첩된 개별 마우스 및 냄새 세트를 "무작위 효과"로 포함합니다.
   5. 올바른 비율에 대해 로짓 변환을 수행합니다.
      참고: 정확한 비율은 연속적이고 바인딩되지 않은 종속 변수가 아닙니다. 따라서 선형 모델에 대한 두 가지 가정을 위반합니다. 따라서 로짓 변환이 수행됩니다.
   6. 추정된 주변 평균을 사용하여 전체 모형으로 식별된 유의한 교호작용에 대한 사후 검정을 수행합니다. 사후 테스트를 위해 여러 쌍별 비교를 수정해야 합니다. Bonferroni 또는 Šidák이 일반적으로 사용됩니다.

결과

설명된 바와 같이 이 프로토콜을 통해 연구자는 학습, STM 및 LTM에 대한 일부 조작의 영향을 평가할 수 있습니다. Tong et al, 2018³ 의 샘플 결과가 여기에 나와 있습니다. 이 결과는 Trk 수용체 차단이 LTM을 선택적으로 억제하지만 학습이나 STM은 억제하지 않는다는 가설을 뒷받침합니다.

그림 2A 는 교육, STM 테스트 및 LTM 테스트의 회로도를 보여줍니다. 첫째, K252a 주입이 냄새-보상 연관성의 학습률에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 그림 2B (섹션 3.1)는 K252a와 훈련의 차량 그룹의 학습률을 보여줍니다. 선형 혼합 모델을 사용한 통계 분석은 약물군과 시험 블록(TB)의 두 가지 고정 효과로 실행되었습니다. 마우스 내에 중첩된 마우스와 냄새 세트는 무작위 효과였습니다. 테스트(섹션 3.2)의 데이터는 분석에 포함되지 않았습니다. 임상시험 블록군에서는 유의한 주효과가 나타났으나(F(3, 183.692) = 43.735, p < 0.001), 약물군에서는 효과가 없었고(F(1, 85.685) = 0.132, p =0.717) 유의한 상호작용도 없었다(F(3, 183.692) = 0.111, p =0.954). Šidák 조정을 사용한 사후 테스트에서 K252a와 차량 그룹이 훈련 중 시험 블록에서 차이가 없음을 확인했습니다(모든 비교에서 p > 0.05). TB2, TB3 및 TB4는 모든 비교에서 TB1보다 유의하게 높았으며(모든 사례에서 p ≤ 0.001), 두 그룹 모두 20번의 훈련 시험이 끝날 때까지 냄새-보상 연관성을 성공적으로 학습했음을 보여주었습니다.

다음으로, STM 및 LTM에 대한 주입의 효과를 조사하기 위해 동일한 분석을 실행하고 테스트(섹션 3.2)의 데이터를 포함했습니다. 약물군과 임상시험군(F(2, 77.558) = 4.043, p =0.021) 간에 유의한 상호작용이 있었으며, 약물군(F(1, 55.629) = 1.438, p =0.236) 또는 임상시험군(F(2, 69.979) = 1.360, p =0.263)에는 유의한 주효과가 없었다. 기억을 구체적으로 검사하기 위해 Šidák 보정과 사후 쌍별 비교를 통해 훈련의 마지막 시도 블록(섹션 3.1)과 테스트의 첫 번째 시도 블록(섹션 3.2) 2(STM) 또는 48시간(LTM) 후의 차이를 비교했습니다. 비히클이 주입된 마우스의 경우, 비교 결과, 훈련 후 2시간 및 48시간 모두에서 연관 기억이 유지되는 것으로 나타났습니다(훈련 성과와의 모든 비교에서 p > 0.05). K252a 주입 마우스의 경우, 2시간 테스트(STM)의 첫 번째 시험 블록은 훈련의 마지막 시험 블록(p > 0.05)과 다르지 않았습니다. 그러나 메모리 성능은 48시간 후에 현저히 낮아졌습니다(p = 0.018). 또한, 48시간 테스트의 메모리는 2시간 테스트의 메모리(p =0.009), 48시간 테스트의 차량군 성능(p =0.006)에 비해 현저히 감소했다. 비히클 마우스와 K252a 주입 마우스 간의 STM에는 차이가 없었습니다(p = 0.356). 이 결과들은 K252a의 후각구 수용체 억제가 단기적 냄새가 아닌 장기적 냄새 기억을 선택적으로 방해한다는 것을 보여줍니다(그림 3).

냄새 세트	냄새 1	냄새 2
1	펜탄산	부탄산
	225.1	63.6
2	육각형	헵타날
	11.1	35.3
3	프로필 아세테이트	부틸 아세테이트
	3.1	10.9
4	2-옥타논	2-헵타논
	87.4	28.7
5	펜탄올	헥산올
	37.2	127.3

표 1: 냄새 세트에 대한 혼합 부피. 각 행에는 동작 단계를 위해 한 쌍으로 사용할 수 있는 두 가지 냄새가 표시됩니다. 예를 들어, 첫 번째 "냄새 세트"를 사용하려면 펜탄산과 부탄산 혼합물을 만드십시오. 표의 숫자는 각 냄새의 1.0 Pa 농도에 대해 50 mL 미네랄 오일을 혼합하기 위한 부피(μL)를 나타냅니다. 훈련과 테스트 중에 페트리 접시 하나에는 펜탄산이, 다른 하나에는 부탄산 냄새가 납니다.

그림 1: 캐뉼레이션 배치 및 행동 장치. (A) 캐뉼라, 치과용 시멘트 캡 및 나사의 상대적 위치를 마우스 머리에 표시합니다. 캐뉼라의 바늘은 두 개의 후각 전구에 도달하고 받침대 자체는 치과 시멘트 캡에 내장되어 있습니다. 나사는 소뇌 형성 위의 두개골에 뚫린 두 개의 구멍에 배치됩니다. 나사는 뇌 자체에 닿지는 않지만 치과 시멘트 뚜껑의 꼬리 닻 역할을 합니다. 그림은 시멘트 캡을 만들기 위한 상대적 크기를 보여줍니다. (B) 조립된 동작 장치를 보여줍니다. 몸은 전형적인 쥐 가정용 케이지입니다. 공기 구멍이 있는 뚜껑은 플렉시 유리로 만들었습니다. 중앙 칸막이도 검은색 플렉시 유리로 만들어졌습니다. 뚜껑은 시험 중에 중앙 칸막이를 들어 올리고 내려놓을 수 있는 통로 역할을 할 수 있을 만큼 충분히 무거운 플렉시 유리로 만들어야 합니다. (C) 행동 장치의 한쪽 면을 보여줍니다. 중앙 칸막이는 들어 올리기 쉽도록 케이지보다 약간 더 높습니다. 모래 페트리 접시는 가장자리를 따라 놓을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 설계 및 학습 결과 연구. (A) 연구 설계의 개략도를 보여줍니다. STM과 LTM 그룹은 독립적이었습니다(즉, 서로 다른 마우스 그룹). 블록의 시작 부분에 있는 기호는 주입이 제공된 시간을 나타냅니다. (B) 트레이닝 중 트라이얼 1-20에 대한 정확한 비율을 보여줍니다. 결과는 K252a와 차량 그룹이 학습률(선의 경사)에 차이가 없음을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. 별표는 차량 및 K252a 코호트 모두에 대해 TB1에 비해 정확한 비율이 크게 증가했음을 보여줍니다(모든 비교에 대해 p ≤ 0.001). 이 그림은 Tong et al. 2018의 허가³에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: STM과 LTM에 대한 Trk 수용체 차단의 차등 효과. STM 및 LTM 테스트의 Training의 Trial Block 4와 Trial Block 1에 대한 올바른 비율을 표시합니다. 즉, 선형 혼합 모델을 사용하여 학습 단계의 마지막 시도 블록 동안 정확한 비율을 비교합니다(그림 2; Training-TB4)를 단기(2시간 테스트) 및 장기(48시간 테스트) 메모리 테스트의 첫 번째 시도 블록(Testing-TB1) 동안 테스트했습니다. 선형 혼합 모델은 약물군과 임상시험군(Training-TB4, STM-TB1, LTM-TB1)의 두 가지 고정 효과를 가졌습니다. 무작위 효과는 마우스 내에 중첩된 마우스와 냄새 세트였습니다. 사후 비교를 통해 K252a 마우스는 LTM이 현저히 손상된 것으로 나타났습니다(훈련용 TB4; p = 0.018)이지만 STM(p > 0.05)은 아닙니다. K252a 주입 마우스의 LTM 성능도 K252a 주입 마우스의 STM보다 유의하게 낮았고(p = 0.009), 차량 마우스의 LTM(p = 0.006)보다 낮았습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림은 Tong et al. 2018의 허가³에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 파일: 통계 분석에 사용되는 구문입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

1회 공포 조건화는 기억의 분자 및 세포 역학을 연구하기 위한 강력한 행동 프로토콜이지만, 자연 학습의 대부분은 점진적이며 위에서 설명한 것과 같은 패러다임을 통해 가장 잘 모델링됩니다. 산부인과에서 Trk 수용체의 억제는 앞서 본 그룹³에서 보여준 바와 같이 다중 시도, 식욕 학습 패러다임에서 후각 기억의 통합을 방해했습니다. 이 발견은 식욕 학습과 혐오 학습에서 신경 영양 호르몬과 같은 분자 메커니즘의 차등 타이밍에 대한 연구를 위한 새로운 길을 열어줍니다.

이 실험은 두 가지 중요한 부분으로 구성되었습니다: (1) 캐뉼레이션(cannulation)과 (2) 연관 차별 작업(associative discrimination task, 형성, 훈련, 테스트로 세분화됨). 실험자는 이 프로토콜을 특정 연구 질문에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 주로 산부인과에 관심이 있었고 이 확립된 프로토콜은 다른 산부인과 연구에 쉽게 적용될 수 있습니다. 다른 관심 영역을 가진 실험자의 경우 파일럿 연구에서 주입 부위를 검증하는 것이 중요합니다. 실험자는 또한 주입하는 것의 확산 속도, 공간 침투 및 생체 활성 지속 시간을 고려해야 할 수도 있습니다.

프로토콜에 설명된 형성 단계는 이 프로토콜의 작성자에 의해 광범위하게 사용되었습니다. 설명된 대로 이를 준수하는 것은 생쥐가 적시에 작업을 배우도록 하는 데 중요한 것으로 보입니다. 다른 타임라인을 사용하여 저자는 작업에 대한 친숙도에서 쥐 사이에서 더 많은 차이를 관찰했으며, 이는 모든 쥐가 실험적 냄새로 테스트하기 위한 기준에 도달하도록 추가 교육을 의미했습니다. 교육 및 테스트의 경우, 연구자는 연구 관심 분야에 따라 실험 횟수, 실험 냄새의 농도 및 서로 간의 냄새의 유사성에 대한 유연성을 갖습니다. 앞서 설명한 것처럼 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 가능하면 여러 가지 냄새 세트를 사용하는 것이 좋습니다. 최종 분석에서 여러 차수 세트의 사용을 고려하는 방법에 대한 지침은 통계 분석 섹션을 참조하십시오. 원칙적으로, 냄새 쌍의 유사성은 구별의 난이도를 조정하기 위해 다양해질 수 있습니다. 이전에 발표된 그룹³의 연구에서 냄새 쌍은 동일한 작용기의 두 가지 냄새 물질로 구성되지만 하나의 탄소 길이만큼 서로 달랐습니다. 이러한 구별은 탄소 길이가 2개 이상 다른 쌍보다 더 어렵지만, 거울상 이성질체(예: (+)-리모넨 및 (-)-리모넨)보다는 쉽습니다. 서로 다른 작용기의 냄새 물질은 지각적으로 매우 다릅니다. Cleland et al¹³ 은 더 많은 자극 변화와 특정 학습 매개변수에 미치는 영향에 대해 논의합니다.

이 프로토콜의 주요 제한 사항 중 하나는 여러 동물을 병렬로 테스트할 수 있는 자동화된 연관 학습 작업에 비해 수행하는 데 훨씬 더 오랜 시간이 걸린다는 것입니다. 주어진 테스트의 경우, 한 명의 연구원이 한 마리의 마우스에 대해 20번의 시험을 완료하는 데 최소 20분이 걸립니다. 그러나 이러한 자동화의 부족은 프로토콜이 재정적으로 더 접근하기 쉽다는 것을 의미하며, 이는 많은 기관에서 우선 순위입니다. 중요한 것은 이 실험의 경우 이 프로토콜이 행동 신경 과학에 관심이 있는 학부 연구자를 교육하는 데 매우 다루기 쉽고 효과적이라는 것이 밝혀졌다는 것입니다. 특히, 이 학생들은 연구 참여의 일반적인 이점 외에도 강력한 동물 취급 기술을 개발합니다.

이 패러다임을 채택하는 데 관심이 있는 연구자는 몇 가지 매개변수를 변경할 수 있습니다. 가장 명백하게, 메커니즘의 약리학적 조작은 다양하며, 이 행동 프로토콜은 화학 유전학 기술 또는 분자 및 세포 경로를 조작하는 다양한 다른 방법(예: 광유전학)과 함께 사용될 수 있습니다. 패러다임 자체는 테스트되는 학습과 기억의 종류를 다양화하기 위해 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 연구원들은 학습률을 제어하기 위해 제시된 두 가지 냄새의 유사성을 조정할 수 있습니다. 본 연구³에서, 악취 쌍은 동일한 작용기의 두 가지 냄새 물질로 구성되지만 하나의 탄소 길이만큼 서로 달랐습니다. 이러한 구별은 탄소 길이가 2개 이상 다른 쌍보다 어렵지만 거울상 이성질체(예: (+)-리모넨 및 (-)-리모넨)보다 쉽습니다. 서로 다른 작용기의 냄새 물질은 지각적으로 매우 다릅니다. Cleland et al¹³은 더 많은 자극 변화와 특정 학습 매개변수에 미치는 영향에 대해 논의하며, 유사한 냄새가 많을수록 구별하기가 더 어렵기 때문에 학습하는 데 시간이 더 오래 걸린다고 결론지었습니다¹⁴. 이러한 조작은 기억력에도 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 맥락에서 연구자들은 학습 후 다른 시점에서 기억력을 테스트하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 2건의 연구^15,16에서는 1회 시행 혐오적 학습 과제에 대한 LTM 지속성에서 BDNF의 역할을 조사했다. BDNF는 TrkB의 리간드입니다. 연구에 따르면 학습 후 12시간 후에 해마에 항-BDNF 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주입하면 7일 후에 LTM이 차단되지만 2일 후에는 차단되지 않는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 초기 학습 후 분자 메커니즘의 시간 척도가 LTM에서 흥미롭지만 아직 이해되지 않은 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 이 백서에서는 이러한 시간 척도를 조사할 수 있는 동작 프로토콜에 대해 설명합니다. 향후 응용 프로그램을 위한 다른 관심 매개변수에는 사용된 마우스 모델이 포함됩니다. 예를 들어, 암컷 포유류가 수컷 포유류보다 냄새에 대한 민감도와 선택성이 더 높기 때문에 향후 연구에서 학습률, STM 및 LTM의 차이를 조사하기 위해 수컷 마우스(신경생물학적으로 훨씬 더 잘 연구된 마우스)¹⁷를 암컷 마우스로 대체하는 것은 흥미로울 것입니다¹⁸. 물론, 질병의 설치류 모델도 이 프로토콜과 함께 효과적으로 사용될 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double guide cannula	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	Custom order
(-)-limonene	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-limonene	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanone	Sigma-Aldrich	537683
2-octanone	Sigma-Aldrich	O4709
5mg sucrose pellets	Test Diet	1811560	Custom size. Used for rewards
Butanoic acid	Sigma-Aldrich	B103500
butyl acetate	Sigma-Aldrich	402842
Dental Cement Powder (Coral)	A-M Systems	525000
Dental Cement Solvent	A-M Systems	526000
Double connector assembly	PlasticsOne	C232C
Double dummy cannula	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC dummy dbl	Custom order
Double injector	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	Custom order
Drill	Kopf Instruments	Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill	This drill requires an additional "adaptor" piece in order to fit certain drill bits. We get by this problem by wrapping the drill bit with lab tape to increase the circumference of the drill it to fit. This may not be an option for surgeries requiring sterile technique.
Eye Ointment			Purchase from local pharmacy
Figure 1 illustration software	BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
Infusion pump model 11	Harvard Apparatus	4169D	Used pumps available via American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	Vet prescription needed for order
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	Mixed to 50uM in DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	Vet prescription needed for order
Lidocaine	Aspercreme		Purchased from Amazon
Mounting Screws	PlasticsOne	00-96 X 3/32
Mouse Anesthesia Mask	Kopf Instruments	Model 907 Mouse Anesthesia Mask	Used with the stereotaxic to allow oxygen and anesthesia while mouse in stereotax
Mouse Nose Adaptor	Kopf Instruments	Model 926 Mouse Adaptor	Used with the stereotaxic to allow for head of mouse to be secured.
Novalsan	Jeffers	41375
Pentanoic acid	Sigma-Aldrich	240370
pentanol	Sigma-Aldrich	138975
Petri dish glass bottoms	VWR	10754-804
Polycarbonate Café bottoms	Ancare	N10PCSEC	Use normal housing cages and custom fit a track in the middle to act as the track for an opaque plexiglass divider
propyl acetate	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			Purchase from local hardware store
Saline	Insight Needles	N/A	Sterile saline for drug mixing
Stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 902 Small Animal Stereotaxic Instrument
Testing chamber	Ancare	N10PCSEC	Our testing chambers are modified using the regular mouse housing cage. The manuscript details what was done.
Vetbond Tissue Adhesive	3M		Purchased from Amazon