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요약

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

초록

만능 줄기 세포는 심장 발달과 질병을 이해하고 재생 의학에 대한 큰 잠재력을 제공합니다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 다능성 줄기 세포에서 심장 세포를 생성하는 지도하는 동안, 두 개의 심장 필드 - 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF 및 SHF) - 만능 줄기 세포 시스템에서 유도되는 경우에 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 시험관 내 사양 및 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리를위한 프로토콜을 생성했다. 우리는 Hcn4-GFP 및 Tbx1-Cre를 운반하는 배아 줄기 세포 라인을 사용; FHF 및 SHF의 로사-RFP 리포터는 각각 세포막 단백질 Cxcr4의 세포 면역염색, SHF 마커의 살아있는 세포 면역염색. 이 접근법으로, 우리는 생체 내 대응물의 기능적 특성 및 전사체를 재량화시키는 전구 세포를 생성하였다. 우리의 프로토콜은 두 심장 필드의 초기 명세 및 분리를 연구하고 심장 질환 모델링을위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 시험관 내 오르가노이드 시스템이기 때문에 정확한 해부학 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이 시스템은 가위 단계 배아의 가난한 접근성을 극복하고 높은 처리량 스크린을 위해 업스케일링될 수 있습니다.

서문

만능 줄기 세포 (PSC)의 사용은 질병 모델링 및 약물 치료를위한 환자 별 근세포와 심장 재생 및 개인화된 의학의 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2,3, 4.최근에는 심방 대 심실 생성을 위한 시험관내 프로토콜뿐만 아니라 심박동기 유사 PSC 유래 심근세포가 5,6으로개발되었다. 그러나, 심장 발생이 심실 발달을 연구하고 이어서 심실 챔버 특이적 심장 세포를 생성하기 위해 시험관 내에서 재현될 수 있는지 여부는 여전히 불분명하다.

초기 배아 발달 동안, BMP4, Wnts 및 Activin A와 같은 분비 된 모르포겐의 영향으로중피 세포는 원시 적 줄무늬 7을 형성한다. Mesp1의 발현에 의해 표시된 심장 중피 세포는 전방 및 후후반에 이동하여 심장 초승달을 형성한 다음 원시 심장 튜브 7,8을형성합니다. 세포의 이 철새 군은 심장 전구 세포 (CPC) 즉 제 1 및 제 2 심장 필드 (FHF및 SHF) 9,10의두 개의 매우 뚜렷한 집단을 포함한다. SHF에서 세포는 높게 증식하고 철새이고 심장 관의 신장 그리고 반복에 1 차적으로 책임 있습니다. 또한, SHF 세포는 심근세포, 섬유아세포, 평활근 및 내피 세포가 심장관에 진입하여 우심실, 우심실 유출관 및 아트리아7,10의큰 부분을 형성함에 따라 분화한다. 대조적으로, FHF 세포는 덜 증식하고 철새이며 주로 심근세포로 분화하여 좌심실과 심방의 작은 부분을 발생시며11. 더욱이, SHF 전구체는 Tbx1, FGF8, FGF10 및 식스2의 발현에 의해 표시되고 FHF 세포는 Hcn4 및 Tbx511,12,13,14,15를발현한다.

PSCs는 3개의 세균 층 모두를 분화하고 그후에 바디에 있는 어떤 세포 모형든지4,16로분화할 수 있습니다. 그러므로, 그(것)들은 선천적인 심장병, 출생 결함의 가장 빈번한 원인17의결과로 심장 발달을 이해하고 특정 발달 결함을 모델링을 위한 엄청난 잠재력을 제안합니다. 선천성 심장 질환의 큰 하위 그룹은 챔버 특정 심장 이상을 포함18,19. 그러나, 그것은 여전히 불분명 여부 이러한 비정상적인 심장 필드 개발에서 유래. 또한, 출생 후 증식하는 심근세포의 무능력을 감안할 때, 심장 재생을 위한 심장조직을 만들기 위한 광범위한 노력이 있었다 1,7,20. 심장 챔버 사이의 생리적 및 형태학적 차이를 고려할 때, PSC를 사용하는 챔버 특이적 심장 조직의 생성은 매우 중요하다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 PSC에서 심장 세포의 강력한 생성으로 이끌어 냈습니다 그러나, 2개의 심혼 필드가 PSC 시스템에서 유도될 수 있는지 아직도 불분명합니다.

시험관내 심장 발생을 재량화하고 CPC의 사양 및 특성을 연구하기 위해 이전에는 PSC 유래 심장 스페로이드21,22,23,24를차별화하는 시스템을 사용했습니다. 최근, 우리는 FHF 유전자 Hcn4 및 SHF 유전자 Tbx1의 통제 하에 GFP 및 RFP 리포터를 가진 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 각각 생성하였다(mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP) 25. 시험관 내 분화 mESCs는 GFP+ 및 RFP + 세포가 중피 세포의 두 개의 별개의 영역에서 나타나고 상보적인 방식으로 패턴화 된 심장 스페로이드를 형성했습니다. 생성된 GFP+ 및 RFP+ 세포는 각각 RNA 시퀀싱 및 클론 분석에 의해 결정된 FHF 및 SHF 특성을 나타내었다. 중요한 것은, Isl1-RFP 리포터 (mESCIsl1-RFP)를운반하는 mESCs를 사용하여, 우리는 SHF 세포가 세포 표면 단백질 CXCR4에 의해 충실하게 표시되었다는 것을 것을을 발견하고, 이것은 형질 전환 없이 심혼 필드 특정 세포의 격리를 가능하게 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 mcCS에서 심장 필드 특정 CPC의 생성 그리고 격리를 기술할 것입니다, 이는 챔버 특정 심장 병을 공부하기위한 귀중한 도구로 봉사 할 수있다.

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프로토콜

참고: 심장 필드 특정 마우스 심장 전구 세포의 시험관내 생성 (그림 1).

1. 마우스 ESC의 유지 보수

  1. mESCs 성장 (mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP,mESCIsl1-RFP)25 에 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅 T25 플라스크 2i 매체 (870 mL의 글래스코우 최소 필수 배지 (GMEM), 태아 소 혈청 (FBS), 100 mL의 글루타맥스, 10 mL의 비 필수 ml, 10 mL pyruvate, 3 μL의 베타 메르카프토에탄올, 20 μL의 Lif (200 U/mL), 0.3 μM CHIR99021 및 0.1 μM PD0325901).
  2. 세포가 70-80% 합류에 도달하면 인산완충액(PBS)으로 세포를 한 번 헹구고 트립신 1mL를 추가하고 37°C에서 3분 동안 배양하여 단일 세포로 해리합니다.
  3. 덜베코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에 10 % FBS의 4 mL을 추가하여 트립신을 중화하십시오. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
  4. 원심 분리기 ~ 3 x 105 세포 270 x g 및 실온에서 3 분 동안.
  5. 상판을 흡인하고, 세포를 2i 배지의 5 mL로 재중단하고 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅 T25 플라스크에 재플레이트하여 유지보수를 한다.

2. 심장 전구체를 이용한 심장 전구 세포 생성

  1. 원심분리기 2.5 x 106 세포 단계 1.3 에서 3 분 동안 270 x g 및 실온.
  2. 상판을 흡인하고 SFD 배지 의 25 mL (105 세포 / mL)에서 세포를 다시 중단합니다. 실험의 규모에 따라, mESC 수는 그에 따라 조정될 수 있다.
    참고: SFD 매체에는 이스코브의 수정된 덜베코 미디엄(IMDM), 250 mL의 햄 F12, 5 mL의 N2 보충, B27마이너스 비타민 A의 10 mL, 5 mL의 10% (w/v) BSA (PBS), 7.5 글루타맥스의 mL 과 7.5 페니실린-스트렙 토마이신의 mL. 사용 전에 아스코르브산(50 mg/mL)과 3.9 x 10-3%(v/v)의 모노티오글리세롤을 첨가하십시오.
  3. 세포 현탁액을 150 mm x 25 mm 멸균 플레이트에 플레이트하고 48 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양하여 심장 스페로이드를 24시간 내에 형성해야 한다.
  4. 145 x g및 실온에서 3 분 동안 형성 된 모든 심장 스페로이드 및 원심 분리기를 수집하여 선택적으로 스페로이드를 분리하고 단일 세포를 피하십시오.
  5. 상판을 흡인하고 분화 유도를 위해 액티빈 A의 1 ng/mL 및 BMP4의 1.5 ng/mL로 SFD 배지의 25 mL에서 스페로이드를 다시 일시 중단합니다. 동일한 150 mm x 25mm 멸균 플레이트에 스페로이드를 플레이트하고 40시간 동안 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
    참고: 액티빈 A(0-3 ng/mL) 및 BMP4(0.5-2 ng/mL)의 다양한 농도는 mESC 라인에 따라 분화 최적화에 사용될 수 있습니다.
  6. 모든 심장 스페로이드와 원심 분리기를 145 x g 및 실온에서 3 분 동안 수집하십시오.
  7. 상판을 흡인하고 SFD 배지의 25 mL에서 스페로이드를 다시 중단합니다. 재부유 된 EB를 초저 부착 75 cm2 플라스크로 옮기고 48 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배양하십시오.

3. 형광 기자를 사용하여 심장 필드 특정 심장 전조 세포의 격리

  1. 145 x g에서 심장 스페로이드를 3 분 동안 실온에서 원심 분리기 및 상수흡기. 트립신 1 mL을 넣고 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
  2. DMEM에 10% FBS 의 4mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 비해리 된 EB를 제거하려면 70mm 스트레이너를 사용하여 혼합물을 걸러내고 270 x g 및 실온에서 3 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리합니다.
  3. 형광 리포터(mESCs Tbx1-Cre에서 파생된 CPC)를 운반하는 CPC를 정렬하기위해; 로사-RFP; HCN4-GFP)상월체를 흡인하고 FACS 선별 용액 500 μL(1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES 및 PBS에서 EDTA 10 mM)를 추가하여 다시 중단합니다.
  4. 선별하기 전에 모든 세포 클러스터를 제거하려면 40 μm 셀 스트레이너가있는 5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브를 사용하여 세포를 다시 필터링하십시오. 선별될 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
  5. Tbx1-Cre를 분리하기 위해 세포를 정렬; 형광 활성화 세포 선별기(FACS)를 이용한 로사-RFP 및 HCN4-GFP 양성 CPC. FBS의 1 mL에서 정렬 된 세포를 수집합니다. 세포 샘플과 선별된 세포를 4°C로 유지합니다.

4. 세포 표면 단백질 마커로 Cxcr4를 사용하여 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리

  1. 표면 단백질 수용체 Cxcr4의 발현에 기초하여 제1 대 제2 심장 필드 CPC를 분리하려면, mESCIsl1-RFP라인을사용한다. 3.3단계에서 상월체를 흡인하고 1:200(vol/vol) PerCP-efluor 710 공액 항 Cxcr4 항체를 함유하는 PBS에서 10% FBS의 300 μL에서 단일 CPC를 재중단한다.
  2. 실온에서 5분 동안 배양하고 1-2 mL의 차가운 PBS를 추가하여 세척합니다. 270 x g및 실온에서 3 분 동안 단일 CPC를 원심 분리하고 원심 분리후 2 회 더 세척하십시오.
  3. 상급을 흡인하고 500 μL의 FACS 선별 솔루션을 추가하여 3.4 단계에서와 같이 단일 CPC 및 필터를 다시 중단합니다.
  4. FACS를 사용하여 Cxcr4+ 및 Cxcr4 세포를 분리합니다. FBS의 1 mL에서 정렬 된 세포를 수집합니다. 세포 샘플과 선별된 세포를 4°C로 유지합니다.

5. 고립 된 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 분석

  1. 원심분리기는 270 x g 및 실온에서 3분 동안 CPC를 분류했습니다. 정렬된 세포는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 이용될 수 있거나 나중에 분석을 위해 배양될 수 있습니다.
  2. 분리 된 CPC를 다시 배양하기 위해, 상월체를 흡인하고, 0.1 % (w / v) 젤라틴으로 코팅 된 384 웰 플레이트의 웰 당 3 x 104 세포당 SFD 배지 및 재플레이트에서 세포를 재중단합니다.  선별 후 세포 사멸이 증가하면, Y-27632(ROCK 억제제)의 10 μM을 시료에 첨가한다. 재문화 후 이틀 후, 자발적인 구타는 주목해야한다.
  3. 심근세포로 분화하는 도금 된 CPC의 능력을 분석하려면 분화 12 일째에 세포를 수집하십시오. 1.2-1.5 단계에 설명된 대로 트립신을 사용하여 단일 CM을 분리합니다.
  4. 세포를 895 x g에서 3 분 동안 원심 분리하고 실온에 대 고 있습니다. 상월체를 흡인하고 PFA를 세척하기 위해 PBS에서 세포를 재중단한다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
  5. 상급체를 흡인하고 PBS에서 10 % FBS에서 세포를 다시 중단합니다. 마우스 항 트로포닌 T 항체(1:500)로 세포 샘플의 절반을 인큐베이션하고 나머지 샘플을 음성 대조군으로 사용한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
  6. PBS를 사용하여 5.4단계에서 설명한 대로 세포를 2회 세척한다. 상월체를 흡인하고 1:500 당나귀 항마우스 IgG(H+L) 이차 항체, 알렉사 플루어 647 컨쥬게이트를 사용하여 PBS에서 10% FBS에서 두 세포 샘플을 재중단한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
  7. 5.6단계에서와 같이 PBS로 두 번 씻으세요. 상월체를 흡인하고 PBS의 200 μL에서 세포를 재중단한다. 유세포계를 사용하여 세포를 분석합니다.

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결과

분화의 대략 132 시간 후에, Tbx1-RFP 및 Hcn4-GFP CPC는 형광 현미경을 사용하여 검출될 수 있습니다(그림2). 일반적으로, GFP 및 RFP 세포는 대략 같은 시간에 나타납니다. CPC의 두 인구는 근접하고 일반적으로 상호 보완적인 패턴으로 계속 확장됩니다. 액티빈 A 및 BMP4의 농도를 조정하면 FHF 대 SHF CPC의 백분율이 변경됩니다(그림 3). 시험관내 CPC 사양은 주로 BMP4...

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토론

우리의 프로토콜에서는, 우리는 심장 스페로이드 및 고립된 심혼 필드 특정 CPC를 생성하는 방법론을 기술합니다. 이들은 CPC 명세서및 그들의 속성의 기계장치, 뿐만 아니라 심장 약실 특정 질병 모델링을 위해 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이전에 발표된 한 연구는 체외에서 심장 발생을 연구하기 위해 2개의 형광 기기자(Mef2c/Nkx2.5)와 mESC 라인을 사용했지만, 두 마커 모두 심근세포가

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공개

저자는 공개에 대한 아무것도 없다.

감사의 말

E. T. 중요한 매직과 AHA에 의해 지원되었다. C. K.는 NICHD/NIH(R01HD086026), AHA 및 MSCRF의 보조금으로 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
β-mercaptoethanolSigmaM6250
0.1% (w/v) GelatinEMD MilliporeES-006-B
100 mM Sodium PyruvateGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS w/o Calcium and MagnesiumThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainerBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Ascorbic AcidSigmaA-4544
B27 minus vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
Cell sorterSonySH800Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μmThermo Fisher Scientific08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flaskCorning07-200-875
Countless II FL automated cell counterThermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo Fisher ScientificA-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)MilliporeESG1106
EVOS FL microscopeThermo Fisher ScientificAMF4300
Fetal Bovine SerumInvitrogenSH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ham’s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
Mouse anti-Troponin T antibodyThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibodyThermo Fisher Scientific46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mmCorning430597
T25 flasksCorning353109
TrypLE (Trypsin)Gibco12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)Stem cell technologies72304

참고문헌

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