Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용

요약

프로토콜의 목적은 후보 바이러스 진입 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있는 바이러스 입력과 관련된 상이한 분석방법을 설명하는 것이다.

초록

기계론적으로 바이러스 진입을 검사하는 항바이러스 분석제는 평가된 에이전트가 가장 효과적인 단계를 분별하는 것과 관련이 있으며, 후보 바이러스 진입 억제제의 식별을 허용한다. 여기서, 우리는 초기 바이러스 진입에서 바이러스 입자 또는 특정 단계를 표적으로 하여 비봉투콕사키바이러스 A16(CVA16)에 의한 감염을 차단할 수 있는 소분자의 식별을 위한 실험접근법을 제시한다. 분석법은 약물 첨가 시간 분석, 유세포분석계 바이러스 결합 분석, 및 바이러스 불활성화 분석기를 포함한다. 우리는 또한 항 바이러스 화합물에 의해 표적으로 한 잠재적인 잔류물을 예측하기 위하여 바이러스 capsid 단백질을 이용하는 분자 도킹 프로토콜을 제시합니다. 이 해법은 바이러스 성 진입에 작용하는 후보 항 바이러스 에이전트의 확인에 도움이 될 것입니다. 미래의 방향은 추가 약물 개발을 위한 이러한 가능한 억제제들을 탐구할 수 있다.

서문

손, 발 및 구강 질환(HFMD)은 어린 아이들의 콕사키바이러스 A16(CVA16) 및 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 가장 흔하게 발생하는 질환이다. 최근 아시아 태평양 지역에서 CVA16 유도 HFMD에 상당한 상승세가 있었습니다. 현상이 온화할 수 있는 동안, 가혹한 합병증은 잠재적인치명적인 1,^2와함께 두뇌와 심혼에 영향을 미치는 생길 수 있습니다. 현재 CVA16에 사용할 수있는 허가 된 항 바이러스 요법이나 예방 접종은 없으므로 향후 발병 및 관련 합병증을 억제하기위한 항 바이러스 전략을 개발할 필요성이 절실히 필요합니다.

CVA16은 각각 VP1, VP2, VP3 및 VP4와 같은 4개의 구조 단백질을 포함하는 펜타머에서 조립된 이코사헤드랄 캡시드가 있는 비봉투 바이러스입니다. 펜타머에서 각 5 배 축을 둘러싸는 것은 우울증으로 표시하고 수용체 결합 3에서의역할로 지적되는 '협곡'영역입니다. 이 협곡의 하단에는 스핑고신(SPH)이라는 천연 지방 리간드가 들어 있는 VP1 부위에 소수성 포켓이 있습니다. 인간 P 셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1) 및 스캐빈저 수용체 클래스 B 부재 2(SCARB2)와 같은 세포 수용체는 캡시드및 캡시드에 대한 형태 적 변화를 초래하는 이 리간드를 대체함으로써 바이러스 결합에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 호스트 세포로 바이러스 게놈의후속 배출 4,^5,6. 바이러스 진입 과정에서 연속적인 사건을 차단하는 가능한 억제제를 식별하면 CVA16 감염에 대한 잠재적 인 치료 전략을 제공 할 수 있습니다.

바이러스 수명 주기의 단계는 모드 특정 항 바이러스 제를 식별하는 데 도움이되는 표적으로 실험적 접근을 통해 해부 될 수 있습니다. 약물 첨가 시간 분석은 사전 진입(바이러스 감염 이전에 추가), 항목(바이러스 감염에 동시 추가), 및 사후 진입(다음에 추가됨)을 포함하여 바이러스 감염 중 다른 시간에 약물 치료 효과를 검사합니다. 바이러스 감염)⁷. 충격은 각각의 처리 조건에서 형성된 바이러스 성 플라크의 수를 정량화함으로써 표준 플라크 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 유세포분석기반 바이러스 결합 분석법은 약물이 숙주 세포에 대한 바이러스 부착을 방지하는지 여부를 결정한다. 이는 대부분의 인간 바이러스 감염이 발생하는 37°C에서 4°C로 온도를 이동시킴으로써 달성되며, 여기서 비리온은 숙주 세포 표면에 결합할수 있지만 세포 7에 들어갈 수 없다. 세포막 결합된 바이러스 입자는 그 때 바이러스 성 항원에 대하여 면역 염색을 통해 정량화되고 유세포 측정에 의해 평가됩니다. 한편 바이러스 성 불활성화 분석은 비활성 을 렌더링 하는 응집 또는 구성 변화를 일으키는 무료 바이러스 입자와 약물의 잠재적인 물리적 상호 작용을 평가 하는 데 도움이, 차폐 또는 중화, 또는 그들을 비활성 렌더링 하는 조직 변화 감염 동안 호스트 세포 표면과후속 상호 작용 8,⁹. 본 실험에서, 바이러스 성 접종은 숙주 세포 단층을 감염시키고 표준 플라크 분석^8을수행하기 전에 약물을 적정하기 위해 희석되기 전에 약물을 먼저 배양할 수 있다. 마지막으로, 분자 도킹은 비봉투 바이러스의 바이러스 성 당단백질과 비봉투 바이러스의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하여 비리온 표면의 잠재적인 약물 상호 작용 부위를 예측하는 강력한 도구입니다. 알고리즘. 이것은 기계론적으로 약물의 행동 모드의 표적을 찾아내고 다운스트림 검아에 의해 추가로 검증될 수 있는 유용한 정보를 제공하는 것을 돕습니다.

우리는 최근에 비 봉투 CVA16 9에 의해 감염을 효율적으로 차단하는 항바이러스 화합물을 식별하기 위해 전술 한 방법을 채택했다. 본 명세서에서, 사용된 상세한 프로토콜들이 기술되고 논의된다.

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프로토콜

참고: 모든 세포 배양 및 바이러스 감염은 취급되는 견본의 생물 안전 수준에 적합한 인증된 생물 안전 성 후드에서 수행되어야 합니다. CVA16 감염을 효율적으로 차단하기 위해 관찰된 소분자 체불라그산(CHLA) 및 푸니타진(PUG)의2개의 탄닌 클래스는 후보 억제제의 예로 사용된다. 바이러스학 기술의 기본 원리, 바이러스 전파, 바이러스 적규기의 결정, 및 플라크 형성 단위(PFU) 또는 감염의 복합성(MOI)의 개념에 대해, 판독기는 참조^10을참조한다.

1. 세포 배양, 바이러스 준비, 화합물 준비 및 화합물 세포 독성

1. 인간 횡문근육종(RD) 세포는 CVA16^{감염(11)에}허용되는 숙주 세포이다. D세포를 10mL의 DMEM(DMEM)으로 10% 태아 소 혈청(FBS), 200 U/mL 페니실린 G, 200 μg/mL 스트렙토마이신, 및 T-75 플라스크에서 0.5 μg/mL 암포테리신 B를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서.
2. RD 세포에서 바이러스를 전파하여 CVA16을 준비하고 PFU / mL에서 바이러스 성 적기를 결정합니다. 최적화된 프로토콜의 경우^{참조 11을}참조하십시오.
3. 각각의 용매를 사용하여 시험 화합물 및 대조군을 준비합니다: 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 CHLA 및 PUG를 용해시다. 모든 감염 단계에 대해, 기저 배지는 DMEM 플러스 2% FBS 및 항생제로 구성되었다.
   참고: 시험 화합물 처리에서 DMSO의 최종 농도는 실험에서 0.25% 이하; 0.25% DMSO는 비교를 위한 분석에서 음성 대조군 치료제로서 포함된다.
4. XTT와 같은 시약을 결정하는 세포 생존능력을 이용하여 RD 세포상에서 시험 화합물의 세포 독성 분석((2,3-bis[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-5-페닐아미노)-카보닐]-2H-테트라졸리움 수산화화물)를 수행한다. 자세한 프로토콜은^{참조 12를}참조하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 GraphPad 프리즘과 같은 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 화합물의 세포 독성 농도를 결정합니다. 세포 생존율에 유의하지 않는 약물 농도 (≥95% 생존 가능 세포)는 연구의 나머지 부분에 사용된다.

2. 약물 첨가 시

1. 바이러스 감염 (전처리) 전에 숙주 세포에 약물의 영향을 평가하기 위해
   1. 2 x 10⁵ 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   2. 1 시간 또는 4 시간 동안 기저 매부 부피의 1 mL에서 비 세포 독성 농도 (단계 1.4에서 결정)에서 테스트 화합물로 RD 세포를 치료하십시오.
   3. 기저 배지에 바이러스 의 50 PFU / 웰을 추가하기 전에 PBS의 1-2 mL로 세포를 씻어 (접종의 최종 부피는 300 μL입니다) 1 시간마다 플레이트를 15 분마다 바위.
   4. 감염 후, PBS를 사용하여 단층을 다시 세척한 다음, 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 추가 배양을 위해 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 기저 매제 1 mL로 오버레이하였다.
   5. 72시간 의 배양 후, 오버레이 매체를 제거하고 2 mL의 PBS를 사용하여 웰을 세척한다.
   6. 15 분 동안 37 % 포름 알데히드의 0.5 mL를 사용하여 우물을 수정하십시오.
   7. 상급체를 제거하고 PBS를 사용하여 다시 씻으십시오.
   8. 0.5 mL의 0.5 mL의 크리스탈 바이올렛 용액을 사용 하 여 우물을 얼룩. 그런 다음 2 분 이내에 얼룩 용액을 제거하고 공기 건조하기 전에 부드러운 물 흐름으로 우물을 씻으십시오.
   9. 백색광 상자에 접시를 놓아 바이러스 성 플라크를 계산합니다. 백분율 계산(%) CVA16 감염은 다음과 같다: (플라크 _{바이러스+약물/평균} # 플라크 _{바이러스+DMSO 대조군)}× 100%.
2. 약물과 바이러스를 동시에 추가하는 효과를 평가하기 위해 (공동 첨가)
   1. 2 x 10⁵ 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   2. 시험 화합물을 적절한 농도로 처리하고 CVA16의 50 PFU/well(접종물의 최종 부피는 300 μL)을 동시에 1시간 동안 15분마다 플레이트를 바위로 처리한다.
   3. PBS의 1 mL로 세포를 세척한 다음 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 추가 배양을 위해 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 기저 매액의 1-2 mL로 오버레이하였다.
   4. 72시간 후 감염 후 크리스탈 바이올렛으로 바이러스 플라크를 염색하고 전술한 바와 같이 CVA16 감염을 확인한다.
3. 바이러스 입력 후 약물 치료 효과를 평가하기 위해 (감염 후)
   1. 2 x 10⁵ 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 얻기 위해 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   2. 1 시간 동안 CVA16의 50 PFU / 웰 (접종의 최종 부피는 300 μL)으로 RD 세포를 접종하십시오.
   3. PBS의 1-2 mL로 우물을 세척하고 0.8 % 메틸 셀룰로오스와 테스트 화합물의 적절한 농도를 포함하는 기저 매체로 세포를 오버레이.
   4. 크리스탈 바이올렛으로 바이러스 플라크를 염색하고 72 시간 후 감염 후 카운트및 위에서 설명한 % CVA16 감염 배양을 결정합니다.
      참고: 세포를 들어 올리지 않도록 모든 PBS를 부드럽게 시정하십시오.

3. 유세포 분석 기반 결합 분석

1. 2 x 10⁵ 세포 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 종자 RD 세포. 단층을 달성하기 위해 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
2. 세포 단층을 4°C에서 1시간 동안 미리 식힙니다.
3. 4°C에서 3시간 동안 시험 화합물의 존재 및 부재 시에 CVA16(MOI=100)으로 RD 세포를 감염시켰다.
   참고: 얼음에 바이러스 접종을 수행하고 4 °C 냉장고에서 이어지는 배양을 수행하여 4 °C에서 온도를 유지하여 바이러스 결합을 허용하지만 진입하지 않습니다.
4. 바이러스 접종을 제거하고 얼음 차가운 PBS 1-2 mL로 한 번 씻으하십시오.
5. 세포를 수집하고 얼음 차가운 유동 세포 분석 버퍼 (1x PBS + 2 % FBS)에서 다시 중단하기 전에 얼음 - 차가운 해리 버퍼 1 mL을 얼음 의 얼음 해리 버퍼를 3 분 동안 얼음에 추가하여 세포를 들어 올립니다.
6. 얼음-차가운 유동 세포 분석 버퍼를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 얼음에 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 0.5 mL로 세포를 고정시다.
7. PBS를 사용하여 세포를 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거한 다음, 1mL의 항 VP1 항체(1:2,000; 3% BSA를 함유하는 PBS에서 희석)로 세포를 1시간 동안 얼음위에 얼룩지게 한 다음, 이차 알렉사 488-컨쥬게이트 안티 마우스 IgG(1:250; 1 시간 동안 얼음에 3 % BSA를 포함하는 PBS에서 희석. 각 항체 처리 후 PBS 세차 (3 회)를 수행한다.
8. 얼음-차가운 유동 세포측정 버퍼의 0.5 mL에서 세포를 다시 중단하고 표준 절차를 사용하여 유동 세포측정계에서 유세포 분석 수행. 연관된 소프트웨어를 사용하여 히스토그램에 데이터를 표시하고 막대 그래프 표현을 위해 수량을 표시합니다.

4. 바이러스 성 불활성화 분석

1. 앞서 설명한^바와 같이 바이러스 성 불활성화 분석(12)을 수행하여 다음 조건을 사용한다:
   - CVA16의 10⁶ PFU / mL의 시작 농도.
   - 2 x 10⁵ 셀 / 웰의 파종 밀도에서 12 웰 플레이트의 RD 셀 단층.
   - 50 PFU / well의 최종 바이러스 농도의 결과로 약물 화합물을 적정하기위한 50 배 희석.
   - PBS 1-2 mL을 사용하여 세척 단계.
   - 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유하는 오버레이 미디어.
2. 위에서 설명한 바와 같이 바이러스 성 플라크 절차의 크리스탈 보라색 염색을 사용하여 바이러스 감염의 최종 판독을 수행합니다.

5. 분자 도킹 분석

1. PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 테스트 화합물의 3D 분자를 다운로드하십시오. 분자가 업로드된 3D 구조가 없는 경우, 2D 구조를 다운로드하거나 SMILES 문자열 서열을 사용하여 분자 프로그램(예: CORINA)을 통해 3D 분자로 변환합니다.
2. RCSB 단백질 데이터 뱅크(https://www.rcsb.org/)에서 바이러스 성 생물학적 조립 유닛을 다운로드하고 바이오 컴퓨팅 프로그램(예: UCSF 키메라)을 사용하여 바이러스 구조 모델을 준비합니다. 예를 들어, CVA16 성숙한 바이리온 결정 구조(PDB: 5C4W)의 경우^3,PDB 파일에서 용매를 삭제하고, Dunbrach 2010 로타머 라이브러리의 데이터를 사용하여 불완전한 사이드 체인을 교체하고, 수소와 전하를 구조에 추가하는 경우 이전에 보고^{된 13}. 도킹 표적은 생물학적 어셈블리 정보(Protein Data Bank)를 사용하여 의도된 분석을 위한 임의의 관련 바이러스 성 단백질일 수 있다.
3. 예를 들어 UCSF 키메라를 사용하여 준비된 바이러스 유닛에 화합물을 도킹하고 시각화 소프트웨어(예: 오토독 비나, 파이몰)를 사용하여 출력 파일을 분석합니다.
   1. 시험 화합물 파일을 UCSF 키메라에 '리간드'로 업로드하고 준비된 전체 바이러스 단백질을 '수용체'로 선택하여 블라인드 도킹을 수행한다. 컴퓨터 마우스 또는 트랙패드를 사용하여 검색 볼륨을 전체 '수용체'로 크기를 조정합니다. '고급 옵션'에서 바인딩 모드 수를 최대로 허용합니다. 도킹 프레임은 바인딩 에너지중 가장 높은 에너지에서 가장 낮은 에너지로 자동으로 순위가 매겨집니다.
   2. (선택 사항) 또한 블라인드 도킹에, 마우스 또는 트랙패드를 사용하여 다시 맹목적인 도킹 결과로부터 유래된 관심 부위의 바이러스 성 단백질 상에 도킹 부위를 제한하여 검색 량을 감소시이어(예를 들어, 100 Å x 100 Å x 100 Å). 이 단계는 블라인드 도킹 결과를 확인하고 특이성을 높이는 데 도움이 됩니다.
   3. 분자 그래픽 시스템(예: PyMol)을 사용하여 도킹 파일을 업로드하여 바인딩 모드의 위치를 분석합니다. '리간드'를 선택하고 '어떤 원자에'옵션으로 극성 접촉을 식별하여 바이러스 성 단백질에 화합물에서 극성 접촉을 찾아; 결과를 검사합니다.

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결과

약물 첨가 시술은 도 1에 도시되어 CVA16 감염에 대한 소분자 CHLA 및 PUG를 이용한 치료로부터의 영향을 예-바이러스 입력(pre-addition) 또는 바이러스 후 진입(co-addition) 또는 후바이러스 항목( 감염 후). 두 소분자 모두 바이러스 감염 전의 숙주 세포의 전처리 여부에 관계없이 CVA16 감염에 대한 한계 영향을 발생시켰다(도1A)또는 감염...

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토론

이 보고서에서, 우리는 특히 비 포위 된 CVA16에 대하여 바이러스 입력을 표적으로 하는 항 바이러스 후보의 식별에 유용한 프로토콜을 기술했습니다. 이 실험은 바이러스 진입 중에 초기 이벤트를 해부하는 방법으로 설계되었으며, 이는 시험에이전트의 항바이러스 활성의 작용 메커니즘과 잠재적 표적(들)을 명확히 하는 데 도움이 된다. '약물 첨가 시간'은 시험 화합물의 잠재적 표적, 예를 들어 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco