바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

요약

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

초록

인플루엔자 바이러스는 현재 유효한 백신의 한정된 효력 때문에 전 세계적으로 사망의 중요한 원인 남아 있습니다. 보편적 인 인플루엔자 백신의 개발에 대한 주요 과제는 항원 드리프트로 인한 높은 항원 다양성입니다. 이 도전을 극복하는 것은 다른 항원 특수형을 통해 많은 바이러스 긴장에 대하여 지시된 혈청 항체의 폭을 측정하기 위하여 새로운 연구 공구를 요구합니다. 여기서, 우리는 인플루엔자 항원의 단백질 마이크로어레이를 사용하여 다양한 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 혈청 항체의 폭을 분석하기 위한 프로토콜을 제시한다.

이러한 인플루엔자 항원 마이크로어레이는 마이크로어레이 프린터를 사용하여 니트로셀룰로오스 코팅 멤브레인상에 정제된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 항원을 인쇄하여 시공된다. 인간 혈청은 인플루엔자 항원에 대하여 항체를 결합하기 위하여 마이크로어레이에 배양됩니다. 양자-점-컨쥬게이트 이차 항체는 마이크로어레이에 대한 각 항원에 결합하는 IgG 및 IgA 항체를 동시에 검출하는데 사용된다. 정량적 항체 결합은 휴대용 이미저를 사용하여 형광 강도로 측정된다. 대표적인 결과는 인간 혈청에서 아류형 특이적 및 교차 반응성 인플루엔자 항체를 측정에서 분석 재현성을 입증하는 것으로 나타났다.

ELISA와 같은 전통적인 방법에 비해, 인플루엔자 항원 마이크로어레이는 짧은 시간 프레임에 있는 수백 개의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 수백개의 혈청을 시험할 수 있는 높은 처리량 다중화 접근법을 제공하고, 따라서 혈청 감시 및 백신 개발에 응용. 한계는 결합 항체와 중화 항체를 구별할 수 없다는 것입니다.

서문

인플루엔자 바이러스는 매년 전 세계 사망자의 1%를 포함하여 사망또는 장애로 인한 2천만 명의 생명을 앗아가는 책임이 있으며, 열대 지방과 개발도상국의 노인과 인구에 불균형한 영향을^{미칩니다. 2,3}. 계절적 전염병의 질병 부담 이외에, 유전 재분류를 통해 새로운 인플루엔자 균주의 출현은 자연적으로 일반적인 호스트에서 또는 생물 테러를 위해 인위적으로 급속한 퍼짐 및 높은 치사성을 가진 세계적인 전염병으로 이끌어 낼 수 있었습니다 ^{4개 , 5.}수많은 인플루엔자 백신이 현재 사용 가능하지만, 그 효과는 아류형 특이성^6에의해 제한되어 다중 바이러스에 대한 오래 지속되는 면역력을 부여하는 보편적 인플루엔자 백신을 개발할 필요성을 만듭니다. 균주⁷.

보편적인 인플루엔자 백신의 발달에 중요한 도전은 긴장에 걸쳐 높은 항원 다양성입니다. 순환 하는 바이러스의 항원 변이와 결합 된 현재 백신의 항원 특이성은 백신 균주와 순환 균주 사이의 불일치를 만듭니다. 이것은 전염병 도중 백신 긴장에서 멀리 유전 표류를 선호하는 진화적인 이점을 부여합니다, 백신효험을 수시로 50% 8,⁹이하로 제한하. 항원 불일치의 추가 원인은 백신 제조 중에 생성된 난자 적응형 바이러스 돌연변이이며, 이는 순환 바이러스^10,11에제대로 결합하지 못하는 항체로 이어진다.

높은 항원 다양성의 이 도전을 극복하는 것은 혈청과 점막 견본에 있는 임상으로 관련있는 항원 변이체에 걸쳐 기존 및 유도된 면역 반응의 폭을 특성화하기 위하여 새로운 연구 공구를 요구할 것입니다. 헤마글루티닝 억제(HAI), 미세 중화(MN) 및 전통적인 ELISA를 포함한 현재 이용 가능한 방법은 한 번에 단일 바이러스 균주에 대한 항체를 검출하는 것으로 제한되므로 여러 항체 이소타입의 검출에 사용됩니다. 여러 바이러스 균주에 대한 신속하게 사용 가능한 임상 표본 및 실험실 자원을 배출. 또한 HAI와 MN은 전문 실험실에서만 사용할 수 있는 라이브 바이러스 문화를 필요로 합니다.

도1에 도시된 바와 같이, 잠재적으로 수천 개의 항원으로 구성된 단백질 마이크로어레이는, 12의 필요성을채울 수 있다. 이 마이크로어레이는 배열에 각 개별 항원에 대하여 정량적인 항체 이소타입/특수형 수준을 결정하기 위하여 임상 견본의 소량을 소모하는 동안 높은 처리량 방식으로 생성되고 조사될 수 있습니다. 항원 발견에 대한 이러한 접근법은 다중 감염성 병원체에 대하여 진단 및 백신 개발에 적용되었다^13. 현재까지, 우리는 60,000개 이상의 총 발현 단백질을 포함하여 35개 이상의 병원체에 대한 단백질 마이크로어레이를 생산하고 감염및 대조군 개인으로부터 30,000명 이상의 인간 세라를 조사하는 데 사용했습니다. 마이크로어레이 슬라이드를 위한 최근 개발된 휴대용 이미징 플랫폼은 최종사용자(14)가 이 방법론에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하였다.

필드에 있는 다중 기여자에 의하여 광대한 이전 일을 토대로^{15,16,17,18,19,}인플루엔자 단백질 마이크로어레이는 최근에 이상을 포함하는 개발되었습니다 250 정제 헤마글루티닌 (HA) 모든 18 아류 형의 표현과 항원 변이체^12,20. 이 방법론을 사용하여, 자연 인플루엔자 감염은 계통유전학적으로 관련된 HA 특수형에 대하여 광범위하게 반응하는 IgG 및 IgA 항체를 생성하는 것으로 입증되었으며, 근육 내 인플루엔자 백신 접종은 아형 특이적 IgG만 생성하였다. 항체²¹. 그러나, 인플루엔자 백신에 톨-유사 수용체를 활성화시키는 보조제추가동물 연구에서 HA 아류형 전반에 걸쳐 유도된 IgG 항체 반응을 확대하는 것으로 나타났다^22.

이 마이크로어레이는 현재 인플루엔자 감염을 위해 따랐던 대학생의 예비 코호트 연구에서 수집된 세라를 조사하기 위하여 이용되고 있습니다. 여기서, 본 연구에서 시편의 서브세트에서 아류형 특이적 및 교차 반응성 항체를 검출하기 위한 분석 재현성의 시연을 이용한 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 방법론이 보고되고 있다.

프로토콜

모든 인간 적인 sera 처리 하 고 보호 개인 장비의 사용 으로 생물 안전에 대 한 승인 된 기관 프로토콜에 따라 폐기. 이 프로토콜에 참여하는 모든 실험실 직원은 생물 안전 및 연구 윤리 에 대한 교육을 받았습니다.

1. 인플루엔자 항원 마이크로어레이 생성

1. 마이크로어레이용 항원 세트 설계 및 획득
   1. 용이성 분말로 발현 및 정제 된 단백질 항원을 얻었다.
2. 마이크로어레이 슬라이드에 항원 인쇄
   1. 인산완충식염수(PBS)에서 각각의 동포화된 항원을 0.001% 트웬-20(T-PBS)으로 0.1 mg/mL의 농도로 재구성한다. 각 재구성 된 항원의 10 μL을 처리되지 않은 384 웰 플랫 바닥 플레이트의 개별 우물로 옮김.
   2. 마이크로어레이 프린터를 사용하여 항원을 인쇄(이 연구에 사용된 마이크로어레이 프린터는 더 이상 상용화되지 않음, 토론참조) 항원을 시료 채널에 흡인하고 직접 통해 침전하는 저용량 마이크로어레이 스포팅 핀으로 16 패드 니트로 셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드에 접촉 및 모세관 작용.
      1. 소스 플레이트 구성 및 인쇄 매개변수로 인쇄 소프트웨어(예: 그리드더)를 프로그래밍합니다.
         1. 풀다운 메뉴를 사용하여 이 인쇄 방법과 함께 사용할 플레이트 유형의 이름을 선택합니다. 이 연구를 위해, 처리되지 않은 384 웰 플랫 바닥 플레이트를 사용하십시오.
         2. 플레이트 번호 옆에 있는 텍스트 상자를 선택하고 이 인쇄 프로토콜에 사용할 샘플 플레이트 수를 입력합니다. 이 연구를 위해 1 접시를 사용하십시오.
         3. 이 방법으로 사용할 핀 구성을 선택합니다. 이 스터디에서는 8핀 구성을 사용합니다.
         4. 원점이 슬라이드 원소(관리 섹션에서 보정)와 인쇄 핀이 슬라이드에서 인쇄를 시작하는 위치 사이의 거리(X- 및 Y-방향)인지 확인합니다.
         5. 배열 디자인 탭을 사용하여 배열의 크기와 모양(도트 간격 및 하위 배열당 점 수)을 정의합니다. 이 연구를 위해 8핀을 사용하여 18x18 형식으로 16패드 슬라이드에 324개 스팟(직경 180μm 간격으로 300μm 간격)을 인쇄합니다.
         6. 인쇄 핀이 샘플을 선택하고 분배하는 방법에 대한 매개 변수를 선택합니다. 이 연구를 위해 각 핀은 항원 용액 250 nL을 흡인하고 40 개의 반점 각각에 1 nL을 인쇄합니다 (8 핀 전체에 대해 총 20 개의 슬라이드).
         7. 핀 청소 프로토콜 및 블로팅 프로토콜을 구성합니다. 이 연구를 위해, 각 핀은 항원을 인쇄하고, 소각 세척 용기에 멸균 ddH₂O에 담근 다음 다음 항원을 흡인한다.
         8. 샘플 블록이 슬라이드에 인쇄되는 순서를 정의합니다. 어레이 소프트웨어는 각 마이크로어레이 내에서 항원의 배열을 설명하기 위해 추가된 그리드 인덱스(.gal) 파일을 구성합니다.
            참고: 상단 행은 이미징 중에 그리드를 방향을 지정하기 위해 (예 : Qdot 585 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트 와 Qdot 800 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트의 혼합과 같은 이미징에 사용되는 모든 파장에서 형광과 함께) fiducials에 사용됩니다. 긴 인쇄 실행의 경우, 소스 플레이트의 항원은 주기적으로 위아래로 파이펫팅한 다음 원심 분리를 통해 다시 부유할 수 있으며, 새로운 소스 플레이트를 준비하고 사용할 수 있습니다.
   3. 프로브되지 않은 마이크로어레이 슬라이드를 내광 상자에 놓고 실온의 건조기 캐비닛에 보관하여 장기간 보관하십시오.
      참고: 이 시점에서 프로토콜이 무기한 일시 중지될 수 있습니다.
3. 품질 관리 검사 수행(폴리 히스티딘 태그 필요)
   1. 슬라이드를 프로빙 챔버에 부착하고 단계 2.1.1-2.1.2에 설명된 바와 같이 차단 버퍼로 수분을 재수화하고 도2에 도시된 바와 같이.
   2. 마우스 단클론 폴리-그의 항체를 1:100 여과된 1x 차단 버퍼로 희석시켰다.
      참고: 비정제 단백질 항원(예: 시험관 내 전사 및 번역 시스템으로 발현)이 마이크로어레이를 인쇄하는 데 직접 사용되는 경우, 단백질 발현 시스템의 성분(예를 들어, 대장균 용해물)을 1:10의 비율로 추가합니다. 이러한 구성 요소에 대한 지시 된 항체를 차단하기 위해 혈청 희석에 사용되는 차단 버퍼.
   3. 100 μL의 희석 된 폴리 - 그의 항체를 포인포인 후 어레이 패드를 포함하는 각 슬라이드 챔버에 넣고 실온에서 2 시간 동안 배양하거나 셰이커에서 4 °C에서 밤새 배양하십시오. 2.2.1단계에서 설명한 대로 T-TBS 버퍼로 3x 세척합니다. 비오틴-접합 염소 항마우스 IgG 보조 항체를 차단 완충액에서 1:200으로 희석하고, 포부 후 잘 당 100 μL을 추가하고, 셰이커상에서 실온에서 1시간 동안 배양한다. T-TBS 버퍼로 3x를 씻으소서.
   4. Qdot 585 nm 스트렙타비딘 컨쥬게이트를 블로킹 버퍼에서 4 nM으로 희석하고, 포인포인 후 잘 당 100 μL을 추가하고, 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. T-TBS 버퍼로 3x를 씻은 다음 TBS 버퍼로 한 번 씻으소서(트웬 없이).
   5. 단계 2.2.5 – 3.1.2에 설명된 대로 슬라이드를 분리하고 정량화합니다.
      참고: 단백질 항원이 품질 관리 프로토콜을 사용하려면 그의_10개의 태그를 포함해야 합니다. 대안적으로, 상이한 태그가 포함되는 경우, 품질 관리 검사는 그 태그에 대한 항체 또는 리간드로 수행될 수 있다.

2. 마이크로어레이를 이용한 인플루엔자 항체용 프로브 세라

1. 항체 결합을 위한 마이크로어레이에 인큐베이트 세라
   1. 그림3과 같이 클립을 사용하여 챔버에 마이크로어레이 슬라이드를 연결하고 프레임에 배치합니다.
      참고: 항상 핸즈어계열이 있는 마이크로어레이 패드를 건드리지 마십시오. 슬라이드가 패드 측면위쪽으로 방향을 정하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 노치가 있는지 확인합니다.
   2. 여과된 1x 차단 버퍼의 웰당 100 μL의 마이크로어레이 슬라이드를 재수화하고, 차단 버퍼의 100 μL에서 혈청 1:100을 희석합니다(처리되지 않은 96웰 플레이트 또는 2 mL 튜브를 사용할 수 있음). 100-250 rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 30 분 동안 덮인 프레임과 희석 된 세라에 재수화 된 마이크로 어레이 슬라이드를 배양하십시오. 셰이커에서 모든 후속 인큐베이션 단계를 유사하게 수행합니다.
      참고: 혈라는 동결 해동 주기를 최소화하기 위해 장기 보관을 위해 -80 °C에서 aliquoted 및 냉동되어야하며 사용하기 전에 미립자를 제거하기 위해 혼합및 원심 분리를 혼합하여 원심 분리해야합니다. 슬라이드 챔버를 재조립해야 하는 누출을 감지하기 위해 이 단계 중과 이후에 슬라이드 챔버를 주의 깊게 관찰하십시오.
   3. 보조 수집 플라스크와 진공 라인에 연결된 파이펫 팁을 사용하여 패드를 건드리지 않고 각 챔버의 모서리에서 조심스럽게 차단 버퍼를 흡인합니다. 이후의 모든 흡인 단계를 유사하게 수행합니다. 패드가 건조하지 않도록 포부 후 신속하게 패드에 희석 된 세라를 추가합니다.
   4. 축축한 종이 타월로 둘러싸인 보조 용기 안에 트레이에 덮인 프레임을 놓고 증발을 방지하기 위해 밀봉하십시오. 흔들 쉐이커에 4 °C에서 밤새 배양 (또는, 100-250 rpm에서 궤도 셰이커에 실온에서 2 시간 동안 배양 할 수 있습니다).
2. 양자점 컨쥬게이트 이차 항체를 가진 표지 결합 혈청 항체
   1. 위에서 설명한 바와 같이 챔버에서 흡인 세라를 신중하게, T-TBS 버퍼의 웰 당 100 μL을 추가 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 에서 ddH₂O pH 7.5로 조정하고 여과, 궤도 셰이커에서 5 분 동안 배양) 100-250 rpm. 이 세척 단계를 총 3x 반복합니다 (모든 후속 세척 단계가 유사하게 수행됩니다).
   2. 블로킹 버퍼에서 1 μM으로 희석된 이차 항체의 혼합물을 준비하고 사용 전과 사용 중에 균질성을 유지하기 위해 파이펫팅하여 철저히 혼합합니다.
      참고: 분석 재현성을 유지하기 위해, 각 이차 항체의 동일한 배치는 실험 전반에 걸쳐 데이터의 정량적 비교가 계획된 모든 프로빙 실험에 사용되어야 합니다. 이차 항체의 특정 농도는 친화성에 따라 달라질 필요가 있다; 가능한 경우 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
   3. 최종 세척 후 챔버에서 흡기 완충액을, 이차 항체 혼합물의 웰 당 100 μL을 추가하고, 셰이커에 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
   4. 흡인 이차 항체 혼합물은 T-TBS 완충액으로 3x 세척한 다음 TBS 버퍼로 한 번 세척합니다(트웬 없이).
   5. 패드를 만지지 않도록 챔버에서 마이크로어레이 슬라이드를 조심스럽게 분리하고, 여과된 ddH 2O로 부드럽게 헹구고, 50 mL 튜브에 넣고 500 x g에서 원심분리하여 10분 동안 건조시다.
   6. 프로브 된 마이크로 어레이 슬라이드를 내광 상자에 놓고 장기 보관을 위해 실온에서 건조기 캐비닛에 보관하십시오.
      참고: 이 시점에서 프로토콜은 최대 1주동안 일시 중지될 수 있습니다.

3. 마이크로어레이 내 항원과 결합하는 항체를 정량화

1. 마이크로어레이 슬라이드를 시각화하고 스팟 형광 강도를 정량화하여 항체 결합을 측정합니다.
   1. 내장 소프트웨어가 내장된 휴대용 이미저를 사용하여 마이크로어레이 슬라이드 이미지를 수집합니다.
      1. 이미저 구성 탭에서 적절한 슬라이드 구성을 선택합니다. 이 연구에서는 16패드 슬라이드를 사용합니다.
      2. 이미지 제어 탭에서 적절한 형광 채널을 선택하고 세라의 반응성에 따라 게인, 노출 시간 및 수집 시간을 조정하여 최적의 이미지를 얻습니다. 본 연구를 위해, IgA 및 IgG를 위한 형광 채널은 각각 585 nm 및 800 nm이고, 화상 진찰 설정은 50의 이득, 500 ms의 노출 시간 및 1 s의 취득 시간 이었습니다.
      3. 캡처를 클릭하여 이미지 획득 프로세스를 시작합니다.
         참고: 마이크로어레이 슬라이드는 어둡고 건조한 상태에서 신호를 저하없이 여러 설정에서 다시 이미지화할 수 있습니다. 슬라이드와 호환되는 경우 다른 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다.
   2. fiducial 마커를 기반으로 그리드를 사용하여 배열 스팟을 감지하고 스팟 주위에서 측정된 픽셀 강도에서 배경에서 제외된 배경의 중앙값으로 스팟 강도를 측정합니다. 1.2.2단계에서 구성된 .gal 파일을 활용하여 각 마이크로어레이의 개별 항원과 스팟 강도를 연결하는 내장 된 이미저 소프트웨어를 사용하여 이 정량화 알고리즘을 일괄적으로 수행합니다.
      1. 파일 정보 패널에서 컴퓨터의 폴더에서 선택하여 .gal 파일을 업로드하고 분석 출력 파일이 분석 옵션 섹션에 저장할 폴더를 지정합니다.
      2. 이미지 제어 탭에서 획득한 이미지 중 하나를 열어 정량화하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 자동 단추를 선택합니다.
      3. 오른쪽 하단의 배열 분석 섹션에서 소프트웨어의 지시에 따라 신탁 템플릿을 만듭니다.
      4. 일괄 처리를클릭하고 정량화할 이미지가 포함된 폴더를 선택하고 이전 단계에서 만든 신탁 템플릿을 선택합니다. 이 소프트웨어는 각 이미지를 분석하고 스팟 강도를 정량화합니다.
         참고: 이 단계는 스프레드시트 조작 또는 분석 소프트웨어에서 이후에 조작될 수 있는 마이크로어레이상의 각 개별 항원에 결합하는 각 혈청 시편 내에서 항체를 정량화하는 스팟 강도를 포함하는 .csv 파일을 생성한다.
   3. 원시 데이터를 분석하여 항원 과 혈청 표본 전반에 걸쳐 항체 결합을 비교합니다. 본 연구를 위해, IgA 및 IgG 항체는 585 nm 및 800 nm 형광 점점 강도로 측정되었고, 다른 날에 다른 슬라이드를 사용하여 실험의 2개의 독립적인 실행 사이에서 모든 항원에서 비교되었고, 상관관계 분석은 수행되었다. 측정 분석 재현성.
      참고: 발현 혼합물로 인쇄된 정제되지 않은 단백질의 경우, 데이터 분석은 DNA 제어가 없는 배경 감산으로 시작해야 합니다.

결과

프로토콜의 데모로, 기준선 혈청은 인플루엔자 항원 마이크로어레이에 인플루엔자 감염을 위해 뒤따랐다 대학생의 예비 코호트 연구 내16명의 개별에게서 분석되었습니다. 분석 재현성을 입증하기 위해, 이 표본은 다른 슬라이드와 다른 날에 두 번 조사되었습니다.

본 연구를 위해, 그의_10개의 태그를 포함하는 정제된 인플루엔자 항원들은 상용 공급업체로부터 수득되었다(재료표 참조) 및 협력자. 이들 항원은 총 251개의 HA 항원을 포함하며, 63개의 구형 두체 도메인(HA1) 및 186개의 전신 단백질(HA0)을 포함하며, 여기에는 96개의 단모성 HA0 단백질 및 90개의 삼량화된 HA0 단백질이 함유된 융합 된 삼합("foldon") 도메인^23. 이 연구에 사용된 항원 및 대조물의 전체 목록은 보충파일로 포함되어 있습니다. 본 연구를 위해, 사용된 이차 항체는 800 nm(GAH-IgG-Q800)에서 양자점을 방출하는 염소 항인간 IgG 컨쥬게이트를 하고, 염소 항인간 IgA는 585 nm(GAH-IgA-Q585)에서 양자점을 방출하는 공액으로 접합되어 IgG 및 IgA 항체의 다중 검출을 위해 그림 3에나와 있습니다. IgG 및 IgA 항체는 상이한 아류형 및 분자 형태의 인플루엔자 HA 항원과 결합하여 전술한 임상 코호트로부터 수득된 세라에 대해 비교하였다.

결과 열 맵은 그림 4에 그림 5의그래픽 표현과 함께 표시됩니다. 이 수치에서는 배열에 높은 표현이 있는 임상적으로 관련된 하위 유형만 공간을 절약하기 위해 레이블이 지정되며, "+"는 더 높은 수의 모든 나머지 하위 유형을 나타내며, 순서대로 포함되는 사소하거나 덜 잘 표현된 하위 유형(예: H1 사이에 있는 H2)을 표시합니다. 및 H3)를 참조하십시오. 배열의 균주 및 하위 유형의 전체 목록이 보충파일로 포함되어 있습니다. 이 데이터는 HA의 헤드 그룹에 대한 항체가 임상적으로 널리 퍼진 균주 (H1N1, H3N2 및 B)에 대한 예상되는 다량의 항체와 다른 균주에 대한 낮은 수량의 항체를 가진 아류형 특이적임을 입증한다. 그러나, 줄기 도메인을 포함하는 전체 HA에 대한 항체는, 아류형에 걸쳐 더 교차 반응성이고, 이 효력은 전체 HA가 다량화될 때 증강되는 것처럼 보입니다. 전체 HA가 아류형에 걸쳐 매우 보존되는 줄기 영역을 포함하기 때문에 이 결과는 예기치 않은 것이 아닙니다. 따라서, 비임상 아류형(예를 들어, H5 및 H7)으로부터의 전체 HA 분자에 대한 항체는 다른 HA 아류형의 줄기 영역과 교차 반응하는 임상 적 아류형(예를 들어, H1 및 H3)에 대해 원래 유도된 항줄기 항체를 나타낼 가능성이 높습니다. 배열에. 이 점은 상이한 반응성 프로파일을 보여주는 헤드 및 줄기 영역의 항체를 구별하기 위해 어레이상 에 머리 HA 및 전체 분자 HA를 모두 포함하는 것의 중요성을 나타낸다.

이 분석은 프로빙 실행 전반에 걸쳐 좋은 재현성을 보여줍니다. 두 번째 실행은 균주 사이의 패턴이 일관적이지만 모든 균주에 걸쳐 약간 낮은 IgG 항체를 보여줍니다. 이 보드 전반에 걸친 약간의 감소는 IgG에 대한 실행 간에 변경되었지만 IgA에 대한 것이 아닌 이차 항체의 배치 대 배치 변동성으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 프로토콜에 언급된 바와 같이, 정량적 비교가 계획된 임의의 실험에 대해 각 이차 항체의 동일한 배치를 사용하는 것이 좋습니다. 시험할 샘플의 높은 수로 인해 항체의 다른 배치가 필요한 경우, 우리는 보정과 정량적 비교를 허용하기 위해 다른 항체 배치와 실험 실행 사이의 공유 샘플을 포함하는 것이 좋습니다.

그림 1: 단백질 마이크로어레이의 개략적. 각 슬라이드에는 격자에 배치된 반점에 인쇄된 수백 개의 항원으로 구성된 단일 배열이 있는 여러 개의 패드가 포함되어 있으며, 각 스팟에는 니트로셀룰로오스 표면의 3차원 지형에 흡착된 항원이 하나 있습니다. 혈청의 항체가 결합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 인플루엔자 항원 마이크로어레이 프린팅 및 프로빙 프로토콜의 회로도. 왼쪽에서 오른쪽으로 마이크로어레이는 휴대용 이미저를 사용하여 이미지화된 슬라이드와 함께 양자점 접합 부항체를 사용하여 IgG 및 IgA 항체용 세라를 프로브하는 데 사용되는 니트로셀룰로오스 코팅 슬라이드를 사용하여 인쇄되고, 그 결과는 히트 맵을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마이크로어레이 슬라이드에 프로빙 챔버를 부착하는 절차. A에서 F까지프로빙 챔버는 올바른 방향으로 슬라이드 위에 배치되고, 측면의 수평 클립을 사용하여 슬라이드에 부착되고, 프로빙 트레이에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 대표적인 결과. 히트 맵은 항원 특이적 항체 반응을 나타내며, 각 행은 분자, 아류형 및 변형에 의해 배열된 단일 항원을 나타내며, 각컬럼은 단일 시편의 프로빙 런을 나타내며, 항체 이소타입에 의해 배열되고 실행된다(A. 흰색 = 0, 검정 = 20000, 빨간색 = 형광 강도 40000). 1에서 18까지의 모든 헤마글루티닌 아류형을 포함하는 항원 아류형 및 1에서 10까지의 모든 뉴라미니다아제 아류형은 수직으로 배열되고 왼쪽에 표기된다. 두 실행 사이의 형광 강도의 비교는 IgA (B) 및 IgG (C)에대한 선형 회귀에 의한 양호한 분석 재현성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 인플루엔자 항원 마이크로어레이에서 측정된 혈청 항체의 폭. 혈청 IgA(A) 및 IgG (B)는 HA 및 NA 분자 형태 및 아류형에 의해 그룹화되어 전체 HA의 임상 특수형 및 높은 교차 반응성에 대한 HA 헤드 그룹 항체의 높은 특이성을 입증하고 전체 HA 항체를 삼량화 줄기 영역의 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일: 인플루엔자 항원 마이크로어레이에 대한 항원 목록. 콘텐츠는 블랭크, 신탁, 컨트롤(인간 IgG 및 IgA 및 0.1 mg/mL 및 0.3 mg/mL의 항인간 IgG 및 IgA) 및 소스, 분자 형태, 하위 유형 및 변형에 대한 정보가 포함된 항원을 포함하여 배열의 모든 324개 지점에 대해 표시됩니다. 약어는 다음과 같습니다: 소스에 대한, 시노 = 시노 생물학 Inc., FKL = 플로리안 크라머 연구소; 분자 형태, HA1 = 헤드 HA, HA0 = 전체 HA, HA2 = 줄기 HA, NP = 핵 단백질. Sino Biological Inc.에서 공급된 항원의 경우 카탈로그 번호가 표시됩니다. Krammer 실험실에서 공급된 항원에 대한 항원 ID가 나열됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서 기술된 인플루엔자 항원 마이크로어레이 프로토콜은 많은 항원에 대한 항체 반응을 분석해야 하는 임의의 프로젝트에 적응할 수 있다. 마이크로어레이 플랫폼은 앞서 설명한 바와 같이 정제 유무에 관계없이 0.1 mg/mL 이상의 수율을 달성할 수 있는 임의의 시스템에서 발현되는 임의의 원하는 단백질 항원 세트와 함께 사용될 수^{있다 12.} 비정제 단백질 항원(예를 들어, 시험관 내 전사 및 번역 시스템으로 발현)이 마이크로어레이를 인쇄하는 데 직접 사용되는 경우, 단백질 발현 시스템의 성분(예를 들어, 대장균 용해)을 1:10추가하여 차단 버퍼에 사용해야 합니다. 이러한 구성 요소에 대해 지시된 항체를 차단하기 위해 세라 및 품질 관리 항체의 희석. 슬라이드 구성은 배열당 더 많은 수의 항원을 수용할 수 있도록 각 슬라이드에서 더 적은 수의 더 큰 패드로 사용할 수 있습니다. 이 연구를 위해, 우리는 어레이에 반점을 침전하기 위해 니트로 셀룰로오스 표면에 직접 접촉 핀을 사용하는 GeneMachine OmniGrid 100 마이크로 어레이 프린터를 사용했다. 이 마이크로어레이 프린터는 더 이상 시판되지 않지만 이 프로토콜에서 다른 상용 마이크로어레이 프린터를 사용할 수 있지만 사용자 지정 핀(접촉 또는 비접촉식) 및 소프트웨어가 필요할 수 있으며 충분한 스팟 해상도가 있어야 합니다. 슬라이드 및 이미저와의 호환성을 제공합니다. 세라의 반응성에 따라 1:50에서 1:400까지 희석을 사용할 수 있습니다. 혈청 프리 완충제는 음성 대조군으로서 사용될 수 있으며, 항원과 결합하는 것으로 알려진 단일클론 항체는 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.

사용자는 몇 가지 문제 해결 문제를 알고 있어야 합니다. 그의 태그에 대한 항체를 사용하여 품질 관리 검사의 목적은 인쇄가 성공하지 않은 항원을 확인하는 것입니다. 여러 어레이의 품질 관리 검사에서 일관되게 낮은 신호를 제공하는 모든 반점은 인쇄되지 않은 항원인쇄를 나타낼 가능성이 높습니다. 가능한 이유는 니트로 셀룰로오스 패드의 가변 두께로 인해 소스 플레이트의 응집 또는 침전 또는 항원 또는 인쇄 핀과 마이크로 어레이 슬라이드 사이의 불량 한 접촉을 포함한다. 이 시점에서, 우리는 그의 항체의 검출된 결합이 3 차원 형태에 의존하는 이 꼬리표의 가용성에 의해 좌우될 수 있다는 것을 감안할 때, 품질 관리 검사의 정량적인 결과에 근거를 둔 분석 정규화를 능력을 발휘하지 않습니다 각 항원에 특정.

인플루엔자 항원 마이크로어레이는 ELISA와 같은 전통적인 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공하며 HAI 및 MN과 같은 기능성 검소에 상보적입니다. 16 패드 단백질 마이크로어레이는 혈청 1 μL에서 약 300 개의 항원에 대해 동시에 여러 등방형의 항체를 측정 할 수있는 능력을 가진 샘플 절약 기술입니다. 항원의 수는 슬라이드 당 패드의 수를 감소시킴으로써 수천으로 증가 될 수있다. 다중 분석 또한 수백 개의 세라가 2 일 안에 항체를 조사 할 수 있으며 슬라이드 및 시약 이외의 모든 물질을 재사용할 수 있으므로 많은 양의 플라스틱 폐기물을 생성하지 않으므로 인력 시간과 소모품 자원을 절약 할 수 있습니다.

마이크로어레이 프린터는 널리 배포되지 않을 수 있지만 마이크로어레이 슬라이드는 중앙 집중식 위치에서 인쇄한 다음 최종 사용자에게 전송하여 프로빙할 수 있습니다. 프로빙에 필요한 유일한 장비는 저가형 휴대용 이미저입니다. 이 프로토콜을 보급하는 목적은 이 기술을 보다 광범위하게 활용하는 것입니다.

인플루엔자 항원 마이크로어레이의 주요 한계는 검출된 항체의 기능 및 역학을 특성화할 수 없다는 것이다. 마이크로어레이는 각 항원에 대한 결합 항체의 폴리클론 세트를 검출한다. 이들 항체는 HAI 및 MN 성아에서 바이러스를 중화시키는 데 기능할 수도 있고 기능적이지 않을 수도 있다. 그러나, HAI와 MN 측정은 단백질 마이크로어레이가 살아있는 바이러스를 관련시키지 않는 반면, 인플루엔자의 조류 특수형에 대하여 항체를 위해 시험하기 위하여 높은 수준의 생물 안전성 캐비닛을 가진 전문화된 시설에 대한 관련있는 살아있는 바이러스 문화를 요구합니다 모든 기본 실험실에서 사용할 수 있습니다. 결합 역학에 관하여, 각 항원의 단일 농도를 포함하는 배열로 조사된 혈청의 단일 희석은 항원과 결합하는 모든 항체에 걸쳐 합산된 양과 친화성의 복합체를 나타내는 단일 데이터 포인트를 산출합니다. . 항원 항체 결합 역학을 완전히 해결하기 위해, 혈청의 다중 항원 농도 및/또는 직렬 희석이 요구된다.

이러한 제한에도 불구하고, 인플루엔자 항원 마이크로어레이는 처리량 및 가용성에 더 제한되는 기능성 검정을 보완할 수 있는 항원 지형전반에 걸쳐 인플루엔자 항체의 폭을 특성화하는 유용한 도구이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-pad nitrocellulose-coated glass slides	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FAST blocking buffer	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam portable imager	Grace Bio Labs	400S	Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody	Thermo Fischer	31800
HiBase 384-well plate	Greiner Bio-One	T-3037-11
Microarray pins	ArrayIt	GMP2	Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.
Mouse monoclonal poly-His antibody	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100 microarray printer	GeneMachines		The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.
ProPlate slide chambers	Grace Bio Labs	246890
ProPlate slide clips	Grace Bio Labs	204838
ProPlate slide frames	Grace Bio Labs	246879
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody	Grace Bio Labs	110620
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate	Thermo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody	Grace Bio Labs	110610