RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

요약

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

초록

원형 RNA (circRNAs)는 마이크로 RNA (miRNA) 규정, 단백질 상호 작용의 중재 및 부모 유전자 전사의 조절을 포함하는 기능에 관여하는 비 코딩 RNA의 부류입니다. 고전적인 차세대 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서 circRNAs는 전형적으로 mRNA 라이브러리의 시공 동안 폴리-A 선택의 결과로 간과되거나 매우 낮은 풍부함에서 발견되며, 따라서 분리 및 검출하기 가 어렵습니다. 여기서, circRNA 라이브러리 시공 프로토콜은 라이브러리 제제 키트, 전처리 옵션 및 다양한 총 RNA 입력 량을 비교하여 최적화되었다. RNase R 전처리 및 가변 적인 양의 총 RNA 입력(1~ 4 μg)을 사용 하 여 2 개의 시판 된 전체 전사체 라이브러리 준비 키트를 테스트 했습니다. 마지막으로, 여러 조직 유형; 간을 포함 하 여, 폐, 림프절, 그리고 췌 장; 뿐만 아니라 여러 뇌 영역; 소뇌, 열등한 정수리 엽, 중간 측두엽, 후두 피질 및 우수한 전두엽 자이러스를 포함; 조직 모형에 걸쳐 circRNA 풍부를 평가하기 위하여 비교되었습니다. 6개의 서로 다른 circRNA 검출 도구(find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC 및 CIRCexplorer)를 사용하여 생성된 RNA-seq 데이터를 분석한 결과 RNase R 전처리 및 4 μg RNA 입력을 사용한 총 RNA 라이브러리 준비 키트가 최적임을 밝혀냈습니다. circRNAs의 가장 높은 상대 수를 식별하는 방법. 이전 사실 인정과 일치, circRNAs의 가장 높은 농축 다른 조직 유형에 비해 뇌 조직에서 관찰 되었다.

서문

원형 RNA(CircRNAs)는 진핵 전사체^1,2,3에서그들의 만연한 발현을 감안할 때 주목을 받고 있는 내인성, 비코딩 RNA이다. 그(것)들은 exons가 서로 에 다시 접합할 때 형성되고, 그러므로 처음에 접합^유물4,5로여겨졌습니다 . 그러나, 최근 연구에 따르면 circRNAs는 세포 유형, 조직 및 발달 단계 특이적 발현^3,6을 나타내고 진화적으로 보존되는^2,3. 더욱이, 이들은 단백질-단백질 상호작용^7,마이크로RNA(miRNA) 결합^3,8,9,10,및 부모 유전자^{전사(11)의}조절에 관여한다.

고전적인 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서, circRNAs는 mRNA를 위한 폴리-A 선택의 결과로 라이브러리 시공 도중 완전히 손실될 수 있거나 그들의 낮은 풍부도를 감안할 때 격리하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근 circRNA 특성화 연구는 CircRNAs^2,12,13을풍부하게 하기 위해 RNase R을 이용한 전처리 단계를 통합했다. RNase R은 선형 RNA를 소화하는 외분비증으로, 원형 RNA 구조를 남깁니다. CircRNA 농축 프로토콜은 RNase R 전처리 단계의 유무에 관계없이 시판되는 두 개의 전체 전사체 라이브러리 구성 키트에서 데이터를 생성 및 비교하고 다양한 양의 총 RNA 입력(1 ~ 4 μg)을 사용하여 최적화되었습니다. 최적화된 프로토콜은 5개의 상이한 뇌 영역(소뇌 [BC], 열등한 정수리 엽 [IP], 중간 측두엽 [MG], 후두 피질 [OC] 및 우수한 전두엽 자이러스 [SF]) 및 4개의 다른 조직 유형(간[LV], 폐[LU]] 및 파프린스 [LN]에 걸쳐 circRNAs의 풍부를 평가하는 데 사용되었다. RNA-seq 라이브러리는 짝을 이루고 데이터를 6개의 상이한 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 분석했다: find_circ^3,CIRI^14,Mapsplice^15,나이프^16,DCC^17,및 CIRCexplorer^18. 우리의 분석에 기초하여, RNase R 전처리 및 4 μg 총 입력 RNA를 가진 좌초된 총 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용할 때 가장 많은 고유 circRNAs가 검출되었다. 최적화된 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 보고 된 바와 같이^19,20,circRNAs의 가장 높은 농축은 다른 조직 유형에 비해 뇌에서 관찰되었다.

프로토콜

이 연구는 인간의 복지에 대한 모든 제도적, 국가적, 국제적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 뇌 조직은 애리조나 주 선시티에 있는 배너 선 건강 연구소 뇌 및 신체 기증 프로그램에서 얻어졌습니다. 두뇌와 바디 기증 프로그램의 운영은 서부 기관 검토 위원회 (WIRB 프로토콜 #20120821)에 의해 승인됩니다. 모든 주체 또는 법정 대리인은 통보된 동의서에 서명했습니다. 상업적(비뇌) 생물표본은 프로테오제넥스로부터 구입하였다.

1. RNase R 치료

참고: 다음 단계에서, 반응 부피는 총 부피 50 μL로 조정된다. 이것은 RNA 정리 및 농축기 키트에 사용되는 최소 샘플 부피입니다(재료 표참조). 부가적으로, 여기서 설명된 최적화된 프로토콜은 총 RNA의 4 μg의 입력량에 대한 것이다. RNase R 치료를 위한 더 긴 배양 시간은 입력량 >4 μg에 권장됩니다.

1. 총 RNA를 39 μL RNase 불물에서 4 μg로 미세 원심 분리 튜브에 희석하고 파이펫팅을 통해 잘 섞습니다.
2. 별도의 튜브에서 RNase R을 1X RNase R 반응 버퍼로 2 U/μL의 작동 농도로 희석합니다. 즉시 사용하기에 충분합니다.
3. 파이펫 39 μL의 총 RNA 및 10x RNase R 반응 버퍼의 5 μL을 1.5 mL 반응 튜브에 넣고 파이펫팅에 의해 잘 혼합된다 (50 μL은 총 반응 량이 될 것이다). 다음으로 RNase R(2 U/μL)의 6μL을 추가합니다.
4. 파이펫을 전체 반응 량(50 μL)으로 조정하고 10회 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞습니다.
5. 튜브를 37°C 수조에 10분 동안 놓습니다.
6. 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 RNA 정화 및 농도(섹션 2)를 진행합니다.

2. RNA 정화 및 농축기 키트를 사용하여 RNA 정화

참고: 고품질 RNA (RIN>8, DV200>80%)를 사용하는 경우, RNase R 치료는 RNA의 약 60%의 손실을 초래할 수 있습니다. 4 μg 입력을 사용하여, 처리된 RNA의 2-2.5 μg가 섹션 1 후에 남아 있는 것으로 추정된다.

1. 시작하기 전에, 버퍼 농축액에 100% 에탄올 48 mL를 첨가하여 RNA 세척 버퍼를 준비하고 파이펫팅을 통해 잘 섞는다. 정화 컬럼을 수집 튜브에 넣고(재료 표참조) 튜브 랙에 놓습니다.
   참고: 다음 모든 단계에 대해 다음 원심 분리 설정을 사용합니다: 10,000-16,000 x g. DNase I 치료가 이미 수행된 경우 이 단계에서 DNase I 치료를 건너뜁니다.
2. RNase R 처리 된 샘플에 2 개의 RNA 결합 버퍼를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 150 μL)으로 잘 혼합하십시오.
3. RNA 결합 버퍼 및 RNase R 처리 된 샘플 혼합물에 1 부피 1 부피를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 300 μL)으로 잘 섞습니다.
4. 전체 볼륨을 컬럼으로 전송하고 30초 동안 컬럼을 원심분리합니다.
5. 400 μL의 RNA 준비 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.
6. 700 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.
7. 400 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 넣고 2분 동안 컬럼을 원심분리하고 컬럼을 신선한 RNase 프리 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.
8. 열 필터 바로 위에 파이펫 팁을 잡고 물이 기둥 필터에만 닿도록 하여 11 μL의 RNase-free 물을 컬럼에 직접 추가합니다.
9. 실온에서 1 분 동안 컬럼을 배양하고 원심 분리기를 1 분 동안 배양합니다.
10. 컬럼을 폐기하기 전에 RNase 가없는 튜브에서 흐르는지 확인하십시오. 용출이 성공하면 샘플을 -80°C에 저장하거나 즉시 라이브러리 준비를 진행합니다. 약 10 μL의 최종 총 용출 부피가 라이브러리 시공에 사용됩니다.
    참고: 중지 지점: RNA를 -80°C에서 최대 7일 간 방치한 후 라이브러리 준비를 계속하십시오.

3. circRNA 도서관 준비

참고: 이 섹션에서 사용되는 대부분의 시약을 포함하는 키트용 재료 표를 참조하십시오.

1. rRNA 고갈 및 단편화
   1. 정제된 RNA의 10 μL을 2.10단계에서 새로운 96웰 0.3 mL PCR 플레이트에서 깨끗한 우물로 옮김. 잘, 5 μL의 rRNA 결합 버퍼를 넣고 5 μL rRNA 제거 믹스를 추가합니다. 부드럽게 파이펫을 위아래로 10회 부드럽게 섞어주세요.
   2. 미리 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 68°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 5 분 배양을 완료 한 후, 벤치에 접시를 놓고 실온에서 1 분 동안 배양하십시오.
   3. 접시에서 씰을 제거합니다. 35 μL의 와르텍스실 온온 rRNA 제거 비드를 시료에 넣습니다. 파이펫을 45μL로 조정하고 파이펫을 10~20배 위아래로 조정하여 완전히 혼합합니다. 실온에서 1 분 동안 인큐베이팅 플레이트.
   4. 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 스탠드에서 1분 동안 또는 용액이 지워지때까지 인큐베이팅합니다. 모든 상판(~45 μL)을 동일한 플레이트또는 새 플레이트에 새 우물로 옮김(작업중인 샘플 수에 따라 다름).
   5. RNA 정화 구슬을 소용돌이(재료 표참조)가 잘 분산될 때까지, 각 샘플에 99 μL의 구슬을 추가한다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다. 접시를 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
   6. 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 5분 간 추가로 인큐베이션하거나 용액이 지워지때까지 배양합니다. 우물에서 상급자 모두를 제거하고 버린다.
   7. 마그네틱 스탠드에 여전히 플레이트를 장착한 후, 구슬을 방해하지 않고 새로 준비된 80% EtOH의 200 μL을 웰에 추가합니다. 30 s에 대 한 배양, 다음 제거 하 고 에탄올을 폐기. 총 2회 를 반복합니다.
   8. 각 우물에 11 μL의 용출 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 10회 섞어 보입니다. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한 다음 용액이 지워지지 때까지 자기 스탠드로 옮김(1-5분).
   9. 상급물의 8.5 μL을 우물에서 동일한 플레이트 또는 새 판에 새 우물로 옮김. 엘루트, 프라이머, 프래그먼트 하이 믹스의 8.5 μL을 각 웰 함유 시료에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다.
   10. 사전 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 94°C에서 8분 동안 인큐베이션합니다. 4 °C에 도달하면 열자전거에서 제거하고 원심 분리기를 짧게 제거하십시오.
       참고: 신디사이징 퍼스트 스트랜드 cDNA 프로토콜을 즉시 진행합니다.
2. cDNA 합성
   1. 제조중인 각 샘플에 대해, 9 μL 첫 번째 스트랜드 합성 믹스를 역전사 1 μL과 혼합합니다(재료 표참조). 혼합물의 8 μL을 샘플에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 6번 섞어 섞으세요.
      1. 밀봉 플레이트 및 다음과 같은 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된 예열 열사이클러 블록상에서 배양: 10분 동안 25°C, 15분 동안 42°C, 15분 동안 70°C, 4°C 홀드. 즉시 두 번째 가닥 합성을 진행합니다.
   2. 각 샘플에 5 μL의 재서스펜션 버퍼를 넣고 20 μL의 두 번째 스트랜드 마킹 마스터 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 6회 위아래로 파이펫합니다.
   3. 플레이트를 밀봉하고 1시간 동안 16°C로 설정된 사전 가열된 열열 사이클러 블록상에 인큐베이션한다. 배양 후, 열자전거에서 플레이트를 제거하고 실온에 평형화시키십시오.
   4. 소용돌이 PCR 정제 비드 (재료 표참조) 및 샘플의 각 우물에 90 μL 비드를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   5. 비드/샘플 믹스를 마그네틱 스탠드에 옮기고 5분 동안 또는 액체가 깨끗해질 때까지 배양합니다. 장식품을 제거하고 폐기하십시오.
   6. 각 샘플에 80% EtOH의 200 μL을 추가합니다. 30 초 동안 실온에서 자기 스탠드에 샘플을 인큐베이터하십시오. 1x를 반복합니다.
   7. 구슬이 실온에서 6분 동안 건조되도록 한 다음 마그네틱 스탠드에서 제거합니다.
   8. 19.5 μL의 재서스펜션 버퍼에서 비드를 다시 일시 중단합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 2 분 동안 배양 한 다음 자기 스탠드로 옮기고 추가로 1 분 동안 또는 액체가 지워지때까지 배양하십시오.
   9. 17.5 μL의 상판을 새로운 우물/새 플레이트로 옮김.
      참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 도서관 준비
   1. 상급물질을 함유한 각 우물에 12.5 μL의 A-테일링 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 위아래로 10회 파이펫하여 혼합합니다.
   2. 다음 파라미터를 사용하여 37°C로 설정된 미리 프로그래밍된 예열 열사이클러 블록상에서 반응을 인큐베이션합니다: 30분 동안 37°C, 5분 동안 70°C, 4°C 홀드. 시료가 4°C에 도달하면 즉시 어댑터 결찰을 진행합니다.
   3. 각 샘플에 2.5 μL의 재서스펜션 버퍼, 2.5 μL의 고유 RNA 어댑터 및 2.5 μL의 결찰 믹스를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다.
   4. 30°C에서 10분 동안 미리 프로그래밍된 예열 열자전거 블록에 샘플을 인큐베이트합니다.
   5. 각 시료에 5 μL의 스톱 리감 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 보도록 합니다.
   6. 각 샘플에 42 μL의 혼합 PCR 정제 구슬을 넣고 완전히 섞습니다. 3.2.6 단계부터 3.2.10 단계까지 를 따르되, 재서스펜션 부피를 52 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 50 μL로 변경하십시오.
   7. 3.3.6단계에서 50 μL 용출을 사용하여 PCR 정제 비드 프로토콜을 다시 반복하지만 재서스펜션 부피를 22 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 20 μL로 변경합니다.
      참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
   8. 각 샘플에 PCR 프라이머 칵테일 5 μL과 PCR 마스터 믹스 25 μL을 추가합니다. 위아래로 10번 파이펫팅하여 섞으세요. 다음 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된, 예열된 열사이클러 블록에 대한 반응을 배양한다: 30s에 대한 98°C; 이어서 10s에 대한 98°C의 8사이클, 30s에 대한 60°C, 30s에 대한 72°C; 72°C를 5분 동안 유지한 다음 4°C를 유지합니다.
      참고: 시퀀싱을 위해 충분한 양의 라이브러리를 생성하려면 총 PCR 사이클 수를 최적화해야 할 수 있습니다.
   9. 잘 혼합된 PCR 정제 비드 의 50 μL을 추가하고 30 μL의 최종 용출 부피로 재서스펜션 부피를 32.5 μL로 변경하는 것을 제외하고, PCR 비드 정제(단계 3.2.4 ~ 3.2.9)에 대한 프로토콜을 따르십시오.
      참고: 샘플은 -20 °C에서 보관해야합니다.
4. 핵산 분석기를 이용한 정량화 및 품질 관리
   1. 테이프와 시약이 실온에서 30분 동안 평형화되도록 하십시오.
   2. 2 μL의 라이브러리를 HS D1000 버퍼의 2 μL과 혼합하고 호환되는 웰 플레이트에 추가합니다.
   3. 호환 되는 호일 씰로 단단히 밀봉하고 2,000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이를 밀봉하십시오.
   4. 소프트웨어 프롬프트에 따라 분석기에서 스핀다운 및 로드 플레이트를 돌이켜야 합니다.
      참고: 라이브러리의 크기는 약 260bp여야 합니다.

4. 데이터 분석 워크플로우

1. 82bp 의 쌍을 이루는 엔드 판독을 생성하는 RNA-seq 라이브러리(재료 표 참조)를 시퀀스. bcl2fastq 도구(v0.2.19)를 사용하여 기본 호출 파일(.bcl) 형태로 원시 시퀀싱 데이터를 FASTQ로 변환합니다.
2. circRNAs를 감지합니다.
   참고: 이전에 보고된 증거에 기초하여 앙상블 circRNA 검출 접근법은 단일 검출 도구^21,22를사용하는 것에 비해 더 잘 수행된다는 것을, 우리는 circRNA 검출을 위한 다중 공구를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서 circRNAs는 find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE 및 DCC의 6개의 기존 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 각 알고리즘에 권장되는 매개 변수 설정을 적용하여 확인되었습니다.
   1. 개발자가 제공한 지침을 사용하여 Linux 고성능 컴퓨팅 클러스터에 각 circRNA 검색 알고리즘을 다운로드하여 설치합니다.
   2. RNA-seq FASTQs를 각 공구에 권장되는 정렬자를 활용하여 기준 게놈(GRCh37)에 맞춥습니다.
   3. 정렬 다음, 각각의 권장 매개 변수 설정을 적용하여 circRNA 검출 알고리즘을 실행합니다.
   4. 각 도구는 각 샘플/테스트 조건에서 검색된 후보 수를 정량화하기 위해 감지된 circRNAs 목록과 함께 다중 열 결과 파일을 출력하고 circRNA 좌표를 추출하고 이로부터 읽기를 지원합니다.
3. CIRI, Mapsplice 및 DCC에 의한 circRNA 좌표 출력을 다른 세 알고리즘과 일치하도록 0기반 좌표로 변환합니다.
4. 두 개 이상의 지원 읽기 또는 다운스트림 분석 및 비교가 있는 circRNAs를 선택합니다. 표 1은 각 샘플에 대해 생성된 총 시퀀싱 판독 횟수와 함께 연구에서 평가된 모든 매개 변수를 요약합니다.
5. 각 샘플/테스트 조건에 대해 해당 라이브러리에 대해 생성된 매핑된 읽기 수(백만개)로 정규화된 검색된 circRNAs 수를 계산합니다. 대표 결과에 자세히 설명된 대로 상자 플롯의 다양한 도구/샘플에서 결과를 요약합니다.

결과

시판되는 범용 제어 RNA(UC)를 사용하여 생성된 데이터와 두 개의 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성된 데이터는 둘 다 프로토콜에서 리보 고갈 단계를 포함하고, 먼저 평가되었다. 분석 워크플로우(데이터 분석 워크플로우, 섹션 4)를 사용하여 전체적으로 Kapa 데이터 집합에 비해 TruSeq 데이터 집합에서 더 많은 수의 circRNAs가 검출되었습니다(그림1). 리보소말 RNA(rRNA) 백분?...

토론

본 연구에서, 시판되는 2개의 라이브러리 준비 키트, 전처리 옵션 및 입력 RNA 양은 circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 시공을 위한 circRNA 농축 프로토콜을 최적화하기 위해 시험되었다. 이 연구의 평가에 기초하여, circRNA 염기서열 분석 라이브러리를 만드는 중요한 단계및 중요한 단계의 숫자는 명백하다. 우리의 평가는 검출된 circRNAs의 증가수에 의해 반영되는 RNase R 전처리의 유용성을 확인합니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette tips	Rainin	GP-L1000F
20 µL pipette tips	Rainin	SR L 10F
200 µL pipette tips	Rainin	SR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)	Agilent Technologies	5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)	Agilent Technologies	5067-5153
Adhesive Film for Microplates	VWR	60941-064
AMPure XP Beads 450 mL	Beckman Coulter	A63882	PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates	VWR	951020401
High Sensitivity D1000 reagents	Agilent Technologies	5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit	Illumina	PE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)	Illumina	FC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing System	Illumina	SY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2	Illumina	PE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)	Illumina	FC-402-4022
Kapa Total RNA Kit	Roche	KK8400
Molecular biology grade ethanol	Fisher Scientific	BP28184
Qubit Assay Tubes	Supply Center by Thermo Fischer	Q32856
Qubit dsDNA High Sense Assay Kit	Supply Center by Thermo Fischer	Q32854
RNA cleanup and concentrator - 5	Zymo	RCC-100	Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beads	Beckman Coulter Genomics		RNA Cleanup beads
Rnase R	Lucigen	RNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units	ThermoFisher (LifeTech)	18064014
TapeStation 2200	Agilent Technologies		Nucleic Acid analyzer
TElowE	VWR	10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit	Illumina	20020596	Kit used in section 3
Two-Compartment Divided Tray	VWR	3054-1004
UltraPure Water	Supply Center by Thermo Fischer	10977-015
Universal control RNA	Agilent	740000