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요약

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.

초록

다중 지역 신경 기록은 다중 두뇌 지구 사이 정밀한 기간 상호 작용을 이해하는 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 기존의 마이크로 드라이브 설계는 단일 또는 다중 영역에서 한 유형의 전극만 사용하여 단일 단위 또는 깊이 프로파일 레코딩의 수율을 제한합니다. 그것은 또한 수시로 표적 통로 및/또는 세포 모형 특정 활동을 표적으로 하는 광유전학 공구와 전극 기록을 결합하는 기능을 제한합니다. 여기에 제시된 하이브리드 마이크로드라이브 어레이는 자유롭게 마우스를 이동하여 수율을 최적화하고 마이크로드라이브 어레이의 제조 및 재사용에 대한 설명을 제시합니다. 현재 디자인은 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시에 두 개의 서로 다른 뇌 영역에 이식 된 9 개의 테트로데스와 하나의 광 실리콘 프로브를 사용합니다. 테트로데스 와 광실리콘 프로브는 뇌의 등쪽 축을 따라 독립적으로 조절할 수 있어 단위 및 진동 활동의 수율을 극대화합니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 장거리 신경 회로의 지역 또는 세포 유형 별 반응 및 기능을 조사하기 위해 광, 광유전학 적 조작을 중재하는 설정을 통합합니다. 또한, 광실리콘 프로브는 각 실험 후에 안전하게 회수및 재사용할 수 있다. 마이크로 드라이브 어레이는 3D 인쇄 부품으로 구성되어 있기 때문에 다양한 설정을 수용하기 위해 마이크로 드라이브의 디자인을 쉽게 수정할 수 있습니다. 먼저 설명된 마이크로드라이브 어레이의 설계및 광섬유를 광유전학 실험을 위한 실리콘 프로브에 부착하는 방법, 이어서 테트로드 번들의 제조 및 마우스 뇌에 어레이의 이식이 있다. 광유전학 적 자극과 결합 된 국소 필드 전위 및 단위 스파이크의 기록은 자유롭게 움직이는 마우스에서 마이크로 드라이브 어레이 시스템의 타당성을 보여줍니다.

서문

신경 활동이 학습 및 기억과 같은 인지 과정을 어떻게 지원하는지 이해하는 것이 중요합니다. 인지 작업의 근간이 되는 신경 활동의 역학을 해명하기 위해, 마이크로드라이브 어레이1,2,3의도움으로 동물에게 자유롭게 움직이는 대규모 세포외 전기생리학이 진행되고 있다. 4. 지난 2 년 동안, 마이크로 드라이브 배열의 여러 유형은 쥐에 대한여러 뇌 영역으로 전극을 이식하기 위해 개발되었다 5,6,7,8 및마우스9, 10개 , 11세 , 12. 그럼에도 불구하고, 현재의 마이크로 드라이브 설계는 일반적으로 여러 프로브 유형의 사용을 허용하지 않기 때문에 연구원은 특정 이점과 한계가있는 단일 전극 유형을 선택해야합니다. 예를 들어, tetrode 배열은 등쪽 해마 CA11,13과같은 인구 밀도가 높은 뇌 영역에 적합하며 실리콘 프로브는 해부학 적 연결을 연구하기위한 더 나은 기하학적 프로필을 제공합니다14 , 15.

테트로데스와 실리콘 프로브는 생체 내 만성 기록에 자주 사용되며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. Tetrodes는 비용 효율성 및 기계적 강성 외에도 단일 전극16,17보다더 나은 단일 장치 절연에서 상당한 이점을 갖는 것으로 입증되었습니다. 또한 마이크로 드라이브8,18,19,20과결합 할 때 단일 단위 활동의 높은 수율을 제공합니다. 신경 회로의 기능을 이해하기 위해 동시에 기록된 뉴런의 수를 늘리는 것이 필수적이다21. 예를 들면, 많은 수의 세포는 시간 관련22 또는 보상 코딩23 세포와 같은 기능적으로 이질적인 세포 모형의 작은 인구를 조사하기 위하여 필요합니다. 훨씬 더 높은 셀 번호는 스파이크 서열13,24,25의디코딩 품질을 향상시키는 데 필요합니다.

그러나 테트로드는 피질이나 시상과 같이 공간적으로 분포된 세포를 기록하는 데 단점이 있다. 테트로데스와 는 달리, 실리콘 프로브는 로컬구조(14,26)내에서 로컬 필드 전위(LFP) 및 스파이크 활동의 공간 분포 및 상호작용을 제공할 수 있다. 다중 생크 실리콘 프로브는 기록 사이트의 수를 더욱 증가시키고 단일또는 인접 구조물(27)에 걸쳐 기록을 허용한다. 그러나 이러한 어레이는 테로데스에 비해 전극 부지의 위치 지정에서 덜 유연하다. 또한, 복잡한 스파이크 정렬 알고리즘은 테트로데스28,29,30에의해 획득된 데이터를 미러링하기 위해 인접 채널의 동작 전위정보에 대한 정보를 추출하기 위해 고밀도 프로브에 요구된다. 따라서 단일 단위의 전체 수율은 종종 테트로데스보다 적습니다. 또한 실리콘 프로브는 취약성과 높은 비용으로 인해 불리합니다. 따라서, 테트로데스 대 실리콘 프로브의 선택은 기록의 목적에 따라 달라지며, 이는 기록 사이트에서 단일 단위 또는 공간 프로파일링의 높은 수율을 얻는 것이 우선순위에 있는지의 문제이다.

신경 활동을 기록하는 것 외에도 광유전학적 조작은 특정 세포 유형 및/또는 경로가 신경 회로 기능에 어떻게 기여하는지 조사하는 신경 과학에서 더 강력한 도구 중 하나가 되었습니다13,31, 32,33. 그러나 광유전학적 실험은 자극 광원34,35,36에섬유 커넥터를 부착하기 위해 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려가 필요하다. 종종 광섬유를 연결하려면 상대적으로 큰 힘이 필요하며, 이는 뇌의 프로브의 기계적 변화로 이어질 수 있습니다. 따라서 이식형 광섬유를 기존의 마이크로드라이브 어레이에 결합하는 것은 사소한 일이 아닙니다.

위의 이유로, 연구원은 전극의 유형 선택을 최적화하거나 기록의 목적에 따라 광섬유를 이식해야합니다. 예를 들어 테트로드는 해마1,13에서더 높은 단위 수율을 달성하기 위해 사용되며, 실리콘 프로브는 내측 내측 피질(MEC)37과같은 피질 영역의 층상 깊이 프로파일을 조사하는 데 사용된다. 현재, 테트로데스와 실리콘 프로브의 동시 이식을 위한 마이크로드라이브는 랫트5,11에대해 보고되었다. 그러나 마이크로 드라이브의 무게, 마우스 헤드의 제한된 공간 및 다른 프로브를 사용하기 위해 마이크로 드라이브를 설계하기위한 공간 요구 사항으로 인해 마우스에 여러 테트로데스 및 실리콘 프로브를 이식하는 것은 매우 어렵습니다. 마이크로 드라이브없이 실리콘 프로브를 이식 할 수 있지만,이 절차는 프로브의 조정을 허용하지 않으며 실리콘 프로브 회수(12,38)의성공률을 낮춥습니다. 또한 광유전학 적 실험은 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려 사항이 필요합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 만성 기록을 위한 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여 주며, 이를 통해 독립적으로 조절 가능한 9개의 테트로데스와 1개의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있습니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 실리콘 프로브의 광유전학 적 실험 및 회수를 용이하게합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 텍사스 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 마이크로 드라이브 어레이 부품 의 준비

  1. 치과 모델 수지(그림1A,B)를 사용하여 3D 프린터를 사용하여 마이크로드라이브 어레이 부품을 인쇄합니다. 개별 3D 인쇄 레이어의 두께가 50 μm 미만인지 확인하여 인쇄된 부품의 작은 구멍을 선명하고 실행 가능한 상태로 유지합니다.
    참고 : 마이크로 드라이브 어레이는 5 부분으로 구성되어 있습니다 (그림1C): (1) 마이크로 드라이브 어레이의 본체, 테트로드를위한 9 개의 마이크로 드라이브 나사와 실리콘 프로브용 나사 1 개가 포함됩니다 (그림1Ca-d). 하단에 있는 광실리콘 프로브에 대한 테트로드 번들 및 구멍의 조정은 표적 뇌 영역의 좌표에 따라 달라집니다(도1Cd); (2) 실리콘 프로브 또는 옵트로드를 부착하는 셔틀 (도1Ce); (3) 실리콘 프로브 커넥터를 고정하는 프로브 전기 커넥터 마운트 (도1Cf); (4) 광섬유 커넥터를 연결/분리할 때 이식된 광실리콘 프로브의 원치 않는 움직임을 방지하기 위해 신체의 중앙 부분에 클램프하는 섬유 페룰 홀더(도1Cg); 및 (5) 안정적인 기록을 위해 마이크로드라이브 어레이에 물리적 및 전기적차폐를 제공하는 차폐 콘(도 1Ch). 마이크로드라이브 어레이의 총 중량은 차폐 원뿔을 포함하여5.9 g이다(표 1). 인쇄된 부품에 구멍이 막힌 경우 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫습니다: 내부 구멍에 대한 #76, 테트로드 마이크로드라이브 나사의 외부 구멍에 대한 #68, 테트로드 마이크로드라이브 나사 지지대 #71, 하단의 가이드 포스트 구멍에 대한 #77 몸을.
  2. 마이크로 드라이브 어레이 본체에 가이드 포스트삽입.
    1. 26-Ga 스테인레스 스틸 와이어의 두 16mm 길이를 잘라. 로터리 그라인더를 사용하여 와이어 팁을 부드럽게 선명하게 합니다.
    2. 바디의 아래쪽 구멍에 와이어를삽입합니다(그림2A). 가이드 포스트를 고정하기 위해 몸의 바닥에 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 바친다.

2. 광 실리콘 프로브 준비

  1. 실리콘 프로브를 위해 마이크로 드라이브 나사를 준비합니다.
    참고: 실리콘 프로브용 마이크로드라이브 스크류는 맞춤형 나사(300 μm 피치)로 구성되며, 지지 튜브와L자형 튜브(그림 2B)로 구성됩니다.
    1. 마이크로 드라이브 헤드에 대한금형을 준비합니다 (그림 2C). 금형을 구성하려면 마이크로 드라이브의 3D 인쇄 플라스틱패턴을 준비합니다(그림 2Ca). 이어서, 패턴 주위에 테이프를 넣어 임시 벽을 만든 후 액체 실리콘 젤을 부어. 부드럽게 흔들어 서 기포를 제거 하 고 경화 될 때까지 기다린 다음패턴에서 실리콘 젤 금형을 제거 (그림 2Cb).
    2. 회전 식 분쇄기를 사용하여 23G 스테인레스 와이어의 18mm 및 9.5mm 길이를 잘라냅니다. 치과 아크릴의 접착력을 향상시키기 위해 회전 분쇄기로 와이어의 상단 2-3mm를 거칠게합니다.
    3. 하나의 사용자 정의 나사를 가지고 치과 아크릴과의 마찰을 줄이기 위해 실리콘 오일의 소량을 적용합니다. 와이어와 사용자 정의 나사를 금형에 설정합니다.
    4. 전선과 나사 주위의 기포를 제거하기 위해 주사기를 사용하여 금형에 치과 아크릴을 붓습니다. 기포 오염으로 인해 마이크로 드라이브가 깨지기 쉽습니다. 치과 아크릴이 완전히 경화 될 때까지 기다린 다음 금형에서 마이크로 드라이브 나사를 벗습니다. 펜치를 사용하여 60° 각도로 긴 와이어 팁의 6mm를 구부립니다.
    5. 마이크로 드라이브 나사의 품질을 확인 (예를 들어, 균열, 기포, 및 마찰) 나사를 회전합니다. 마찰이 높은 경우, 마이크로 드라이브 나사와 결합하는 맞춤형 드라이버 팁이있는 전기 나사 드라이버를 사용하여 부드러워질 때까지 나사를 회전하십시오.
    6. 마이크로 드라이브 나사를 마이크로 드라이브 어레이 본체에 설치하여 나사를 돌려 위아래로 원활하게 움직이는지 확인하십시오. 나사를 본체 구멍에 삽입할 때 나사용 나사가 자동으로 생성됩니다.
  2. 셔틀을 준비합니다(그림3Aa).
    1. 날카로운 가위를 사용하여 폴리에테더케톤(PEEK) 튜브 2개를 5mm 길이로 자른다. 셔틀의 양쪽에 튜브를 정렬합니다. 에폭시를 사용하여 튜브와 셔틀을 붙입니다.
    2. 가이드 포스트에 소량의 실리콘 오일을 바하십시오. 마이크로 드라이브 어레이 본체의 가이드 포스트에 삽입하여 셔틀의 품질을 확인합니다. 과도한 마찰 없이 셔틀이 원활하게 움직이는지 확인하십시오.
  3. 광도를 준비합니다(그림3Ab). 광유전학 실험이 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    1. 루비 커터를 사용하여 광섬유를 길이 21mm로 절단합니다. 섬유 팁을 갈아서 팁을 평평하고 빛나게 만듭니다.
    2. 실리콘 프로브의 전면에 광섬유를 부드럽게 놓습니다. 섬유 팁은 전극 부위 의 상단 위에 200-300 μm 위치에 배치됩니다. 투명 테이프로 섬유를 일시적으로 잡습니다.
    3. 소량의 에폭시를 사용하여 실리콘 프로브의 베이스에 광섬유를 붙입니다. 에폭시가 완전히 완치될 때까지 적어도 5시간 동안 기다립니다.
      참고: 광섬유를 전극 부위와 같은 쪽에 부착하는 것이 좋습니다. 뒷면에 섬유를 부착하면 빛이 녹음 사이트를 제대로 비추는 것을 방지할 수 있습니다.
  4. 실리콘 프로브에 셔틀을 부착 (그림3Ac):실리콘 프로브의 베이스 뒤쪽에 소량의 에폭시를 적용합니다. 셔틀의 하단 부분을 실리콘 프로브의 베이스에 부착하고 에폭시의 초기 경화 시 셔틀과 실리콘 프로브 베이스 사이의 간격이 형성되지 않도록 2-3 분 동안 자세를 유지합니다. 에폭시가 완전히 완치될 때까지 적어도 5시간 동안 기다립니다.
  5. 조심스럽게 현미경 (그림 3B)에서 본체의 가이드 게시물에 셔틀튜브를 삽입합니다. 이 절차 동안, 미세 핀셋으로 셔틀의 홈을 잡으하십시오.
  6. 나사를 돌려 마이크로 드라이브 나사를 나사 구멍에 삽입합니다. L자형 와이어의 팁을 셔틀 헤드의 홈에 삽입하여 실리콘 프로브와 마이크로드라이브 나사를 끼쳐 넣습니다(그림3C).
  7. 프로브 전기 커넥터 홀더를 마이크로드라이브 어레이본체에 부착합니다(그림 3D).
    1. #0 나사 두 개를 3.5mm 나사 길이로 자른다. 팁을 갈아서 버를 제거합니다.
    2. 프로브 커넥터 홀더를 본체에 놓습니다. 실리콘 프로브 전기 커넥터를 홀더에 넣습니다.
    3. 에폭시를 사용하여 홀더에 실리콘 프로브 커넥터를 고정하고 실리콘 프로브의 회수 절차를 허용하기 위해 마이크로 드라이브 어레이 본체에 붙이지 않도록하십시오. 나사를 삽입하여 프로브 커넥터 홀더를 고정합니다.
  8. 페룰 홀더를 광실리콘 프로브 및 마이크로드라이브 어레이본체에 부착합니다(그림 3D).
    1. 나사 2개 #0 6mm 나사 길이로 자른다. 팁을 갈아서 버를 제거합니다.
    2. 2개의 #0 기계 나사 너트의 외부를 연마하여 2.5-3.0mm의 외경을 가진 작은 육수 너트를 만들어 무게와 공간을 줄입니다.
    3. 나사를 홀더의 구성 요소 A에 삽입합니다. 에폭시를 사용하여 나사 헤드를 붙입니다.
    4. 부품 A와 B에 소량의 실리콘 그리스를 적용하여 본체와의 마찰을 줄입니다. 부품 A를 본체에 삽입한 다음 역 핀셋을 사용하여 일시적으로 유지합니다.
    5. 부품 B를 부품 A의 나사에 놓습니다. 사용자 정의 너트를 나사에 나사로 나사로 연결합니다. 펜치를 사용하여 견과류를 조여 몸에 페룰 홀더를 고정하십시오.
    6. 섬유 페룰 홀더(성분 B)의 홈에 섬유 페룰을 삽입합니다. 섬유 페룰이 홀더에서 4-5mm 밖으로 달라붙는지 확인하십시오.
    7. 페룰과 홀더 홈 사이에 소량의 에폭시를 바하십시오. 에폭시가 완전히 치유될 때까지 기다렸다가 페룰이 움직이지 않는지 확인합니다. 마이크로 드라이브 나사를 돌리기 전에 너트를 풀어 셔틀과 ferrule 홀더에서 부드러운 움직임을 확인하십시오.
    8. 프로브의 작동 거리를 확인합니다. 셔틀 튜브가 가이드 포스트와 여전히 연결되어 있는 동안 ferrule-holder가 맨 위 위치에 있을 때 프로브 팁이 바디로 완전히 후퇴해야 합니다. 최대 작동 거리는 실리콘 프로브의 길이와 표적 뇌 영역의 길이에 의해 결정됩니다.
    9. 마이크로 드라이브 나사가 느슨한 경우, 지원을 위해 더 많은 스레드를 추가하기 위해 나사 주위에 치과 아크릴의 소량을 적용합니다. 경화되면 나사를 회전하여 압박감과 안정성을 확인합니다.

3. 테트로드 준비

참고: 이 절차는 이전에 게시된문서 8,19,20,39와유사합니다.

  1. 테트로드를 위해 마이크로 드라이브 나사를 준비합니다. tetrode용 마이크로 드라이브는 맞춤형 나사와 23G 튜빙(그림2B)으로구성됩니다. 이 절차는 섹션 2.1과 유사합니다.
  2. 내부에 5.5 mil 와이어가있는 30G 스테인레스 스틸 튜브 번들을 만듭니다. 이 경우 총 9개의 30G 튜브(8개의 레코딩 테트로데스 및 1개의 기준 전극)를 사용하였다.
  3. 드라이브 본체 의 바닥에서 30G 번들을 스레드하고 본체에 20G 얇은 벽 튜브로 고정하십시오. 회전 분쇄기로 번들의 바닥을 다듬어 팁을 고르게 만들고 플러시합니다. 30G 튜브가 본체에서 약 0.5mm 튀어나오게 되도록 로터리 그라인더로 30G 튜브의 상단 부분을 다듬습니다.
  4. 5.5 mil 폴리이미드 절연 튜브를 30G 튜브에 적재하십시오. 테트로드 와이어를 준비하고 32채널 전기 인터페이스 보드(EIB)에 로드합니다. 최종 정밀 절단 전에 임피던스 테스터와의 전기 연결을 확인하십시오.
  5. 골드 도금 솔루션으로 250-350kΩ으로 낮은 전극 팁 임피던스. 슈퍼 접착제로 모든 테트로데스를 수정하십시오.
  6. 밀봉 및 윤활을 위한 미네랄 오일로 폴리이미드 튜브와 테트로드 사이의 과도한 간격을 채웁니다. 접지선을 EIB로 라우팅합니다.
    참고: 필요한 경우, 광섬유는 테트로드와이어(12)를따라 통합될 수 있다.

4. 차폐 콘 부착

  1. 인쇄 된 원뿔의 내부에 페인트 실버 전도성 차폐 페인트. 원뿔 내부에 마이크로 드라이브 배열을배치합니다(그림 3E).
  2. #0 나사 두 개를 3.5mm 나사 길이로 자른다. 마이크로 드라이브 어레이를 제자리에 고정하기 위해 콘 의 외부에서 나사를 고정합니다.
  3. 스크류 헤드 주위에 실버 페인트를 적용하여 차폐 콘을 전기 접지와 전기적으로 연결합니다. 접지 선과 원뿔 사이의 전기 연결을 확인합니다. 마이크로 드라이브 어레이 본체와 차폐 콘 사이에 소량의 에폭시를 적용하여 본체를 단단히 부착합니다.
    참고 : 차폐 콘을 제조하는 또 다른 방법은 알루미늄 테이프(40)를 사용하는 것입니다 (그림3F). 먼저, 알루미늄 호일을 종이에 붙인 후 차폐 콘용패턴 용지를 준비한다(도 3Fa). 그런 다음 종이를 롤액을 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 마이크로드라이브 본체에 부착합니다(그림 3Fb). 이 원뿔의 무게는 0.72 g이고 마이크로 드라이브 어레이의 총 중량은 4.7 g(표1)로 감소된다.

5. 임플란트 수술

참고 : 이 절차는 이중 사이트 이식에 대한 이전에 게시 된 기사18,39,41에서 수정됩니다. 수술 후 빠른 회복을 위해 마이크로 드라이브 임플란트의 경우 동물의 무게가 25g을 초과해야 합니다.

  1. 준비
    1. 접지 나사를 준비하려면 실버 와이어를 두개골 나사에 부착하고 실버 페인트를 적용하십시오. 그런 다음 실버 페인트를 사용하여 와이어의 반대쪽에 금핀을 부착합니다.
    2. 마이크로드라이브 어레이를 스테레오택 장치에 고정하도록 드라이브 홀딩 어댑터를 준비합니다. 에폭시를 사용하여 수커넥터를 스테인리스 핸들에 부착합니다. 커넥터와 스테인리스 핸들의 정렬이 직선인지 확인합니다.
    3. 기록 후 조직학적 확인이 필요한 경우, 실리콘 프로브(38)의 테트록 또는후면에 Di-I를 적용한다.
    4. 원하는 깊이로 실리콘 프로브를 아래로 낮춥힙습니다. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 풀고 실리콘 프로브의 마이크로 드라이브 나사를 돌려 실리콘 프로브 (opto-silicon 프로브)를 낮추고 너트를 고정하여 ferrule 홀더를 고정합니다. 해마 부위 CA1과 MEC의 실리콘 프로브에 테트로데스를 이식할 때 테트로드 캐뉼라와 실리콘 프로브 팁 사이의 거리는 3-4 mm입니다.
  2. 스테레오탁스 장치에서 마취 마우스(0.8%-1.5%이소플루란)를 설정합니다. 마우스의 마취 상태는 발가락 핀치 반사의 부재에 의해 확인된다. 건조한 것을 방지하기 위해 눈에 투명한 연고를 바르십시오. 강한 외과 적 빛 노출로부터 보호하기 위해 호일 조각으로 눈을 덮습니다.
  3. 모피를 면도한 후 요오드와 이소프로판올로 마우스의 두피를 소독합니다. 표준 수술 가위를 사용하여 두피에 1.5-2.0 cm 절개를하고 피하 리도카인을 적용 한 후 면봉을 사용하여 두개골 위에 조직을 제거하십시오.
  4. 마우스 헤드를 입체 전적 도구에 맞춥습니다. 브레그마와 람다의 높이 차이가 100 μm 미만인지 확인합니다. 아틀라스를 사용하여 개두술 위치를 확인하고 멸균 된 연필로 이러한 위치를 표시합니다.
  5. 두개골 나사 (0.8 mm 직경, 0.200 mm 스레드 피치)를 두개골에 1.5 회전 (0.3 mm)로 회전시키고 외과 용 핀셋과 스크루 드라이버를 사용하여 두개골에 8-11 구멍을 뚫은 후 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 고정하십시오.
    참고 : 정면 두개골에 2-4 구멍, 정수리 두개골의 양쪽에 2-3 구멍, 그리고 1-2 개 측 두개골에 구멍이 제안됩니다.
  6. 심상 뼈에 구멍을 뚫은 후 지면 나사를 한 턴(0.2mm)으로 회전시켜 구멍에 부착합니다. 이 구멍이 뼈를 통해 뇌 케이스에 침투하지 않도록하십시오. 그렇지 않으면 소뇌 신호가 기록을 오염시것입니다. 임피던스 미터를 사용하여 지면 나사와 두개골 나사 사이의 1 kHz에서 임피던스가 20 kΩ 미만이지 확인하십시오.
    참고: 임피던스가 클수록 레코딩 중에 모션 아티팩트가 도입됩니다.
  7. 표시된 위치에서 개두술을 수행합니다. 경막은 마우스에 그대로 남을 수 있다.
  8. 접지 나사의 수커넥터와 마이크로드라이브 어레이의 접지 커넥터를 연결합니다. 접지 나사와 차폐 를 측정하여 임피던스 미터를 사용하여 연결을 확인합니다.
  9. 마이크로드라이브 어레이를 어댑터에 설정하고 스테레오택시 장치로 설정하고 원하는 깊이까지 실리콘 프로브를 천천히 낮춥힙입니다. 실리콘 프로브가 뇌에 삽입될 때 테트로드 번들이 뇌 표면 위에 있지만 여전히 마이크로드라이브어레이 내부에 있는지 확인합니다(그림 4A).
  10. 실리콘 프로브와 테트로드 번들의 영역을 밀봉하기 위해 실리콘그리스를 조심스럽게 적용합니다(그림 4B). 20G 바늘 의 끝에 소량의 실리콘 그리스를 넣고 바늘을 사용하여 프로브 주위에 그리스를 적용합니다. 실리콘 그리스가 프로브 주변을 완전히 덮을 때까지 반복하여 치과 아크릴이 전극/프로브 위 또는 밑으로 흐르지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 극적으로 기록 사이트의 임피던스를 증가시킬 것이다, 그리스가 전극 사이트를 만지지 않도록주의하십시오.
  11. 치과 아크릴을 적용하여 마이크로 드라이브 어레이를 두개골의 고정 나사에 고정시다.
    참고 : 아크릴경화 중에 발생하는 과도한 열을 피하기 위해 3 층으로 치과 아크릴을 적용하는 것이 좋습니다.
  12. 마이크로드라이브 어레이에서 어댑터를 조심스럽게 분리합니다. 탈수를 방지하기 위해 피하적으로 PBS 1 mL을 주입하십시오. 주입 5 mg/kg 멜 록시캄 피하 진통 치료로.
  13. 실리콘 프로브 커넥터를 테이프로 덮어 먼지가 전기 연결내부로 들어가는 것을 방지합니다. 플라스틱 파라핀 필름을 사용하여 마이크로 드라이브 어레이를 덮고 제자리에 테이프를 놓습니다.
  14. 3 일 동안 적절한 진통 치료를 투여하십시오 (예 : 하루에 한 번 2 mg / kg 멜 록시캄의 피하 주사). 테트로드 조정을 시작하기 전에 회복을 위해 3-5일 간 허용하십시오. 회복 기간 후에 이식된 마우스는 도 4C에도시되어 있다.

6. 실리콘 프로브 회수(그림 4D)

  1. 케타민 (75 mg /kg)과 덱스 메데토미딘 (1 mg / kg) 마취제를 복강 내 로 주입하고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하십시오. 후드를 사용하여 심장을 통해 4 % 파라 포름 알데히드를 직접 교전시켜 마취 된 마우스를 수정하십시오. 설치류에 대한 외과 적 방법은 이전에42에설명되어 있습니다.
  2. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 느슨하게 합니다. 그런 다음 조정 나사를 돌려 실리콘 프로브를 마이크로 드라이브 어레이 본체 내부쪽으로 완전히 후퇴시켜 본체 의 상단으로 조심스럽게 이동합니다. 프로브를 상단 위치에 고정하도록 너트를 고정합니다.
  3. 측면에서 두개골을 균열하여 바닥에서 마우스 뇌를 가져 가라. 마이크로드라이브 어레이가 이제 동물과 분리됩니다.
  4. 실리콘 프로브를 구동하는 L자형 마이크로드라이브 나사를 완전히 제거합니다. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 풀고 꺼내십시오. 페룰 홀더의 구성 요소 A를 꺼낸다.
  5. 프로브 커넥터 마운트를 풀고 드라이브 본체에서 분리합니다. 마이크로드라이브 어레이 본체에서 프로브 커넥터 마운트가 벗겨지을 수 있는지 확인합니다.
  6. 핀셋으로 셔틀의 상단 부분을 잡고 마이크로 드라이브 어레이에서 실리콘 프로브 어셈블리를 조심스럽게 밀어 내십시오.
  7. 콘택트렌즈 클리너(먼저 효소, 과산화수소 3%)로 프로브 팁을 최소 1일 동안 청소합니다. 현미경으로 이소프로판올 패드를 사용하여 전극 팁을 조심스럽게 닦으소. 프로브를 정전기가 없는 저장 상자에 보관하십시오.
    참고: 셔틀 및 프로브 커넥터 마운트는 실리콘 프로브에 부착된 상태로 유지되며 다음 이식시 재사용할 수 있습니다.
    참고: 일부 실리콘 프로브는 과산화수소로 견딜 수 없습니다. 이 경우, 프로테오라틱 효소만을 함유하는 콘택트렌즈 용액을 사용한다.
  8. 다음 수술을 위해 마이크로 드라이브 어레이 본체를 재사용하려면 미세 팁 드릴과 니퍼의 조합을 사용하여 치과 아크릴을 제거하십시오. 그런 다음 제거 된 치과 아크릴을 아세톤에 담그어 두개골 나사를 회수하십시오. 아세톤은 마이크로 드라이브 어레이의 플라스틱 부품을 용해시울 수 있습니다.
  9. 메스를 사용하여 마이크로 드라이브 본체와 차폐 콘 사이의 에폭시를 제거합니다.
    참고: 마이크로드라이브가 파손되지 않은 경우 다음 수술을 위해 추가 부품을 다시 인쇄할 필요가 없습니다.

결과

마이크로 드라이브 어레이는 5 일 이내에 구성되었습니다. 마이크로 드라이브 준비의 타임 라인은 표2에 설명되어 있습니다. 이 마이크로드라이브를 사용하여, 9개의 테트로데스 및 1개의 실리콘 프로브를 마우스의 해마 CA1 및 MEC[21주 령/29 g 체중 남성 pOxr1-Cre(C57BL/6 배경)]에 각각 이식하였다. 이 형질전환 마우스는 MEC 층 III 피라미드 뉴런에서 Cre를 발현한다. 마우스를 AAV5-DIO-ChR2-YFP(7.7...

토론

이 프로토콜은 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 자유롭게 행동하는 마우스에서 실리콘 프로브를 사용하여 두 뇌 영역에서 신경 활동을 기록할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여줍니다. 또한 실험 후 광유전학 적 실험 및 실리콘 프로브의 회수를 보여줍니다. 조정 가능한 실리콘 프로브33 또는 광실리콘 프로브36

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 일본과학해외연구동호회(HO), 부여된 장학생프로그램(TK), 인간개척과학프로그램(TK), 뇌연구재단(TK), 교수과학기술취득, 보존 프로그램 (TK), 뇌 및 행동 연구 재단 (TK), 스미토모 재단 연구 보조금 (JY), 나르사드 젊은 조사자 연구 보조금 (JY). 원고를 준비하는 동안 귀중한 의견과 제안에 대해 W. Marks에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
#00-90 screwJ.I. Morris#00-90-1/8EIB screws
#0-80 nutSmall PartsB00DGB7CT2brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screwSmall PartsB000FMZ57Gbrass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubesSmall PartsSLPT-22-24for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubingSmall PartsHTX-23Rfor tetrode
23 Ga stainless wireSmall PartsHTX-23R-24-10for L-shape/support wire
26 Ga stainless wireSmall PartsGWX-0200for guide-posts
30 Ga stainless wireSmall PartsHTX-30Rfor tetrode
3-D CAD software packageDassault SystèmesSolidWorks 2003
3D printerFormLabForm2
5.5mil polyimide insulating tubesHPC Medical72113900001-012
aluminum foil tapeTycoTyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tapefor the alternative shielding cone
conductive pasteYSHIELDHSF54for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdriveAMTUNM1.25-HalfMoonhalf-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdriveAMTYamamoto_0000-160_9mmslotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylicStoelting51459
dental model resinFormLabRS-F2-DMBE-02
Dremel rotary toolDremelmodel 800a grinder
drill bitFine Science Tool19007-05
electric interface boardNeuralynxEIB-36-Narrow
epoxyDevconGLU-735.905 minutes epoxy
eye ointmentDechraPuralube Ophthalmic Ointmentto prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheetThorlabsLFG5Pfor polishing the optical fiber
fine tweezersProtech International15-368for loading/recovering the silicon probe
gold pinsNeuralynxEIB Pins Small
ground wireA-M Systems7815000.010 inch bare silver wire
headstage preampNeuralynxHS-36
impedance meterBAK electronicsModel IMP-21 kHz testing frequency
mineral oilZONA36-105for lubricating screws and wires
optical fiberDoricMFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording systemNeuralynxDigital Lynx 4SX
ruby fiber scribeThorlabsS90Rfor cleaving the optical fiber
silicon greaseFine Science Tool29051-45
silicon probeNeuronexusA1x32-Edge-5mm-20-177Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probeNeuronexusA1x32-6mm-50-177Fig. 4C
silicon probe washing solutionAlconAL10078844contact lens cleaner
silicone lubberSmooth-OnDragon Skin 10 FASTfor preparation of microdrive mold
silver paintGC electronic22-023silver print II coating, used for ground wires
skull screwOtto Frei2647-10AC0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissorsROBOZRS-5880
stereotaxic apparatusKopfModel 942
super glueLoctiteLOC230992for applying to guide-posts
surgical tweezersROBOZRS-5135
Tetrode TwisterJun YamamotoTT-01
tetrode wiresSandvikPX000004

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