1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

요약

이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

초록

Neurite 의 성장은 신경계 발달 중에 신경 회로형성에 근본적인 사건입니다. 가혹한 신경염성 손상 및 시냅스 역기능은 각종 신경 퇴행성 질병 및 나이 관련 변성에서 생깁니다. neurite 파생을 조절 하는 메커니즘의 조사 뿐만 아니라 뇌 발달 과정뿐만 아니라 이러한 신경 장애에 귀중 한 빛을 발산 것 이다. 낮은 형질 감염 효율로 인해, 현재 1 차 포유류 뉴런에서 신경 구이 성 성장에 특정 단백질의 효과 연구 하는 도전. 여기서, 우리는 EGFP및 관심 단백질(POI)을 이용한 1차 쥐 피질 뉴런의 공동 형질전환에 의한 뉴라이트 자생의 조사를 위한 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 EGFP 신호를 통해 POI 형질감염된 뉴런의 식별을 허용하고, 따라서 NEUrite 자성장에 대한 POI의 효과를 정확하게 결정할 수 있다. 이 EGFP 기반 분석법은 신경과성 자성장을 조절하는 경로의 조사를 위한 편리한 접근법을 제공한다.

서문

축색과 모수석을 모두 포함한 노이라이트는 신경망 의 확립에 관여하는 뉴런의 돌출부입니다. 신경 신경 발달에 필수적입니다 신경 구이염의 역동적 인 성장. 그러나, 아래 기본 규제 메커니즘 불분명 남아. 특히, 신경성 손상은 다양한 신경 퇴행성 질환과 뇌 손상 후^1. 따라서, 다양한 neurite 파생 규제 경로에서 putative 분자의 역할에 대한 조사는 프로세스의 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 더욱이, 다양한 신경 장애에 대한 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있다. 신경 세포주는 신경세포가 조작하기 쉽고 트랜스펙트^2,3으로neurite 의 성장을 포함한 신경 학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델입니다. 그러나, 유전 드리프트는 그들의 생리적인 반응에 있는 변이로 이끌어 낼 수 있던 몇몇 일반적으로 이용되는 세포주에서 생기기 위하여 보고되었습니다⁴. 더욱이, 차동 단백질 발현은 신경 세포주와 1차 뉴런 사이에 나타났다. 예를 들어, PC12는, 쥐 부신에서 유래된 뉴런 세포주는 뉴라이트^자생을연구하는 데 널리 사용되는^{2, 3,}NMDA 수용체^5를발현하지 않는다. 더욱이, 1차 뉴런에 비해 신경독소에 대한 마우스 신경아세포종 라인 신경-2a의 반응성이 감소된 것은 특정 막 수용체 및 이온^채널(6)의발현 부족으로 인한 것으로 제안되었다. 따라서, 1차 뉴런은 신경외식 의 자생의 조사를 위한 보다 바람직하고 대표적인 모델이다. 그러나, 1 차적인 뉴런의 사용은 그들의 낮은 형질 감염 효율성^7에의해 방해된다.

여기서, 우리는 관심 있는 단백질(POI) 및 EGFP를 1차 쥐 피질 뉴런에 대한 공동 형질감염과 수반하는 방법을 기술한다. EGFP는 성공적으로 형질 감염된 뉴런의 식별을 위한 형태학적 마커로서 작용하고 신경염의 측정을 허용한다. 우리는 neurite 의 성장을 조절하기 위해 보고 된 화합물 / 분자를 사용하여이 방법을 검증했습니다. 더욱이, FE65, 신경조절 단백질은 신경질성 자성장을 자극하는 것으로 나타났으며, 이러한^접근법을설명하기 위해^8,9를사용하였다. 이 프로토콜은 (1) 배아 18일(E18) 래트 배아로부터 1차 피질 뉴런의 분리, (2) EGFP및 POI(본 연구에서 FE65)를 이용한 뉴런의 공동 형질감염 및 (3) 이미지 처리를 이용하여 뉴런의 이미징 및 분석을 포함한다. 소프트웨어 이미지J 와 뉴런J 플러그인^10,11.

프로토콜

이후 모든 절차는 홍콩 중문대학의 동물 실험 윤리 위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다.

1. 커버스립준비

1. 멸균 된 18mm 원형 커버 슬립을 12 웰 조직 배양 판의 각 우물에 놓습니다.
2. 커버슬립을 가습된 37°C 인큐베이터에 5 μg/mL 폴리-D-리신 용액으로 코팅하여 1시간 이상 코팅합니다.
3. 조직 배양 플레이트로부터 폴리-D-리신 용액을 흡인하고 코팅된 커버슬립을 멸균수로 한 번 헹구는다.

2. 쥐 배아 신경 해부

1. 자궁 경부 탈구 또는_CO2 질식에 의해 18 일 (E18)의 임신 나이에 시간 임신 Sprague-Dawley 쥐를 희생.
   참고: 임산부 쥐의 희생에 대해서는 현지 규정을 확인하십시오.
2. 해부 가위로 임신 한 쥐의 복강을 열고 자궁을 10cm 페트리 접시로 옮김하십시오.
3. 작은 해부 가위로 자궁과 양수 낭을 조심스럽게 열고 작은 해부 가위를 사용하여 쥐 배아에서 태반을 제거하십시오. 포도당 (PBS-포도당, 10 mM 나트륨 인산염, 2.68 mM 염화 칼륨, 140 mM 염화 나트륨 및 3 g /L 포도당)으로 보충 된 미리 냉각 된 인산완충 식염수로 10cm 페트리 접시에 전체 배아를 옮기세요.
4. 두개골의 시상 봉합사를 따라 잘라 작은 해부 가위 한 쌍으로 조심스럽게 엽니 다. 작은 평평한 주걱으로 배아 뇌를 얼음 차가운 PBS-포도당으로 10cm 페트리 접시로 옮김을 옮김.
5. 해부 현미경의 밑에 2개의 #5 핀셋을 사용하여 소뇌와 두뇌 줄기에서 2개의 대뇌 반구를 분리하십시오.
   참고: 쥐 뇌의 구조는 참조^12를 참조하십시오.
6. #5 핀셋을 사용하여 수막을 제거합니다.
7. 두 개의 직선 #5 핀셋으로 대뇌 반구에서 피질을 분리합니다.
8. 15 mL 원심 분리기 튜브에서 얼음 차가운 PBS-포도당에 고립 된 피질을 옮김.

3. 1 차적인 피질 신경 문화

참고: 3단계와 4단계의 모든 절차는 Class II 생물안전성 캐비닛 내에서 수행됩니다.

1. 5 분 동안 4 °C에서 중력에 의해 분리 된 피질을 정착하고 PBS - 포도당을 흡인.
2. 분리된 피질에 0.05% 트립신-EDTA 1 mL을 추가하고 효소 소화를 허용하기 위해 37°C 수조에서 조직을 10분 동안 두드리고 배양하여 부드럽게 섞습니다. 튜브를 부드럽게 눌러 2분마다 혼합합니다.
3. 조직/트립신 혼합물에 4 mL의 유지 관리 배지(예: 신경기분저 배지)를 추가합니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 유지 보수 매체는 페니실린 - 스트렙 토마이신과 B-27 보충^13으로보충된다.
4. 1 mL 파이펫을 사용하여 삼조하여 조직을 부드럽게 해리하십시오.
5. 200 x g에서 원심분리에 의해 해리된 세포를 5분 동안 펠렛.
6. 3.5단계에서 3.7단계는 두 번 반복합니다.
7. 유지 보수 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
8. 혈세포계에 의한 생존 가능한 세포의 계수를 위해 10 μL의 0.4% Trypan Blue 용액을 10 μL의 세포 현탁액에 추가하십시오.
9. 12웰 플레이트에서 1mL의 유지 관리 배지에서 65,000/cm2(생존 세포)의 밀도로 뉴런을 플레이트한다.

4. 세포 감염 및 고정

1. 2일 체외(DIV2)에서, EGFP 구제의 트랜스펙트 0.5 μg(pEGFP-C1)을 1 μL의 트랜스펙션 시약(예를 들어, Lipofectamine 2000)을 사용하여 POI의 0.5 μg의 유무에 관계없이 뉴런에 대해 함께 한다. 제조업체의 지침을 사용하십시오.
   참고: 포유류 발현 구슬은 내독소 프리 플라스미드 제제 키트를 사용하여 제조하였다. 화학 물질 /분자 (이 원고 시토 샬라신 D (Cyto D) 및 신경 성장 인자 (NGF)가 사용된 경우) 형질전환 후 6 시간에서 수행 될 수 있습니다.
2. 배양배지 24시간 후 형질감염세포를 37°C PBS(10 mM 인산나트륨, 염화칼륨, 염화나트륨 140m)로 1회 세척한다.
3. PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 고정하십시오.
4. 고정 된 세포를 PBS로 세 번 씻으하십시오.
5. 현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 장착 매체를 추가합니다. 12웰 플레이트에서 시료가 유리 슬라이드를 향하게 하여 장착 매체로 조심스럽게 커버슬립을 옮김을 옮김.
   참고: 수성 마운팅 매체를 사용하는 경우 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다.

5. 노이라이트 자성장 측정

1. 에피형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하는 데 40x 목표를 사용합니다.
2. 적어도 40 개의 손상되지 않은 뉴런에서 형상 변환 당 EGFP 신호로 이미지를 캡처합니다.
3. NeuronJ 플러그인^11을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 캡처된 이미지를 열어 각 이미지 뉴런의 세포체에서 성장 원뿔의 끝까지 가장 긴 신경질의 길이를 측정합니다.
4. 소프트웨어로 얻은 데이터를 분석하여 뉴라이트 의 외성장에 표적 화된 단백질의 효과를 결정한다.

결과

이 방법론을 시험하기 위하여는, 우리는 각각^14,15,16의신경 성 자성장을 억제하고 자극하기 위하여 보인 Cyto D 및 신경 성장 인자^NGF를이용했습니다. EGFP로 형질감염된 뉴런의 뉴라이트 길이는 Cyto D 또는 NGF로 치료한 후 측정되었다. 뉴런에 대한 EGFP의 형질감염 효율은 2.7%(1,068개의 뉴런 카운트)였다.

토론

앞서 언급한 바와 같이, PC12 및 그 서브클론은 형질전환 효율이 우수하기 때문에 뉴라이트 확장을 연구하기 위해 널리 사용된다^2,3. 대조적으로, 1 차적인 뉴런은 형질전환^7에의하여 neurite 파생 조정자를 공부하기 위한 중요한 장애물인 낮은 형질감염 비율을 가시합니다. 여기서, 우리는 1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 정량화하기 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061