PET 트레이서 생산을 위한 고체 상 11C-메틸화, 정제 및 제형

요약

당사는 고체 상 추출 카트리지를 사용하여 양전자 방출 단층 촬영(PET)에 대한 임상적으로 관련된 추적기를 생산하기 위해 효율적인 탄소 11 방사성 라벨링 기술을 보고합니다. ^11세 C-메틸화제는 전구체와 연속용출로 미리 로드된 카트리지를 통과하여 높은 방사성 화학적 수율에서 화학적 및 방사성 화학적으로 순수한 PET 트레이서를 제공합니다.

초록

양전자 방출 단층 촬영에 사용되는 방사성 추적기의 일상적인 생산 (PET) 주로 방사성 신디톤용액에 비 방사성 전구체와 반응 젖은 화학에 의존. 이러한 접근법은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 트레이서의 정제를 필요로 하고 인간 투여를 위한 생체 적합성 용매에서 재제형이 뒤따릅니다. 우리는 최근 합성, 정화 및 일회용 "3-in-1"단위로 고체 상 카트리지를 활용하여 탄소 11 표지 PET 방사성 의약품의 고효율 합성을위한 새로운 ¹¹C-메틸화 접근법을 개발했습니다. 트레이서의 재구성. 이 접근법은 예비 HPLC의 사용을 없애고 전사 라인과 방사성 붕괴로 인한 트레이서의 손실을 줄입니다. 또한 카트리지 기반 기술은 합성 신뢰성을 향상시키고 자동화 프로세스를 단순화하며 GMP(우수 제조 관행) 요구 사항을 준수합니다. 여기에서, 우리는 PET 추적자 피츠버그 화합물 B^([11C]PiB)의 생산의 예에 이 기술을 보여줍니다, 인간의 두뇌에 있는 아밀로이드 플라크를 위한 생체 내 화상 진찰 에이전트에 있는 금 본위제.

서문

양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 생화학 적 과정, 신호 및 변형의 생체 시각화를 가능하게하기 위해 생물학적 활성 분자에 부착 된 동위원소의 방사성 붕괴를 감지하는 데 의존하는 분자 이미징 양식입니다. . 탄소 11 (t_1/2 = 20.3 분)은 유기 분자가 풍부하고 짧은 반감기로 인해 PET에서 가장 일반적으로 사용되는 방사성 동위 원소 중 하나이며 동일한 인간 또는 동물 대상체에 대해 동일한 날에 여러 추적기를 투여 할 수 있습니다. 방사선 부담을 줄입니다. 이 동위원소로 표지된 많은 트레이서는 임상 연구 및 생체 내 PET 이미징을 위한 기본 건강 연구에 사용되며, 생물학적으로 관련된_D2/D3 수용체에 대한^[11C]raclopride,^[11C] 아밀로이드 플라크에 대한 PiB,^[11C]PBR28 트랜스로케이터 단백질-단지 몇 가지 이름을 지정합니다.

탄소-11 표지 PET 추적기는 주로 -OH(알코올, 페놀 및 카르복실산), -NH(아민 및 아미드) 또는 -SH(티올) 그룹을 함유하는 비방사성 전구체의 11C-메틸화를 통해 생산됩니다. 간략하게, 동위원소는^[11C]CO2의 화학적 형태로 ¹⁴N(p,α)^11C핵 반응을 통해 사이클로트론의 가스 표적에서 발생된다. 후자는 젖은 화학 (LiAlH_4로 ^[11C]CH₃OH로 감소)를 통해 ^[11C]CH3 I)로 변환된 후^HI로 담금질하거나 1 또는 건조합니다. 화학^([11C]CH_4에 촉매 환원 후 분자 I_2를가진 급진적 인 이오디네이션²⁾ 【¹¹C 】 _CH3는 실버 트라이플랫 컬럼^3을통해 전달함으로써 보다 반응성 ^11C-메틸트리플랫([11 C]CH₃OTf))으로 더 변환될 수 있다. ¹¹C-메틸화는 유기 용매에서 비방사성 전구체의 용액으로 방사성 가스를 버블링하거나 보다 우아한 포로 용매 "루프" 방법^4,5를 통해 수행된다. ¹¹C-추적자는 HPLC를 통해 정제되고 생체 적합성 용매로 재조화되고 인간 피험자에게 투여되기 전에 멸균 필터를 통과합니다. 이러한 모든 조작은 탄소 11의 짧은 반감기를 감안할 때 빠르고 신뢰할 수 있어야 합니다. 그러나 HPLC 시스템을 사용하면 트레이서와 생산 시간의 손실이 크게 증가하고 종종 독성 용매의 사용이 필요하고 자동화가 복잡해지고 때로는 실패한 합성으로 이어집니다. 또한 반응기와 HPLC 컬럼의 세척이 필요하면 후속 트레이서 배치의 합성 사이의 지연이 연장되고 방사선에 대한 인력의 노출이 증가합니다.

불소-18(t_1/2 = 109.7분)의 방사성 화학은 다른 널리 사용되는 PET 동위원소로, 최근 HPLC 정제의 필요성을 없애주는 카세트 기반 키트의 개발을 통해 발전되었습니다. 고체 상 추출 (SPE) 카트리지를 채택함으로써,이 완전히 일회용 키트는^[18F] FDG,^[18F] FMISO,^[18F] FMC 등을 포함하여 ¹⁸F-추적기의 신뢰할 수있는 일상적인 생산을 허용, 짧은 합성 인력 의 참여감소 및 장비 유지 보수를 최소화할 수 있습니다. 탄소-11이 PET 이미징에서 덜 인기 있는 동위원소로 남아 있는 이유 중 하나는 11C-tracers의 일상적인 생산을 위한 유사한 키트의 부족입니다. 이들의 개발은 합성 신뢰성을 크게 향상시키고, 방사성 화학 수율을 증가시키고, 생산 모듈의 자동화 및 예방 유지 보수를 단순화할 것입니다.

현재 사용 가능한 생산 키트는 반응되지 않은 방사성 동위원소, 전구체 및 기타 방사성 및 비방사성 부산물에서 방사성 추적자를 분리하기 위해 HPLC 기둥 대신 저렴한 일회용 SPE 카트리지를 활용합니다. 이상적으로, 방사성 라벨링 반응은 또한 동일한 카트리지에서 진행; 예를 들어,^[18F]의디메틸아미노에탄올을 기체로^[18F]CH2BrF를 전립선암 이미징 PET 트레이서[18F]의 생산에서 양이온 교환 수지 카트리지에서 발생 ⁶. 카트리지에 여러 ¹¹C 추적기의 방사성 라벨링에 대한 유사한 절차가보고되었지만^7,8 및^[11C]콜린^9의 방사성 합성에 특히 강력해졌습니다. 및^[11C]메티오닌(10)은, 이들 예는 전구체로부터의 분리가 종종 필요하지 않은 종양학적 PET 트레이서에 한정된 채로 남아 있다. 우리는 최근에^[11C]CH₃I¹¹ 및 후속 ¹¹C-메틸화의 생산을위한^"[11C]키트"의 개발뿐만 아니라 고체 상 지원 합성^12의 개발을보고우리의 노력에 11C-추적기의 일상적인 생산을 단순화합니다. 여기서, 우리는 2003년에 처음 개발되었을 때 알츠하이머병(AD) 이미징 분야에 혁명을 일으킨 Aβ 이미징용 방사선 추적기인^[11C]PiB의 고체 상 지원 방사성 합성의 예를 사용하여 우리의 진전을 보여주고자 합니다. 그림 1) ^13,14. 이 방법에서, 휘발성^[11_C]CH3OTf(bp 100°C)는 일회용 카트리지의 수지에 증착된 6-OH-BTA-0 전구체를 통해 전달된다. PET^{트레이서[11}C]PiB는 생체 적합성 수성 에탄올과 카트리지로부터 용출에 의해 전구체 및 방사성 불순물로부터 분리된다. 또한, 원격으로 작동하는 방사성 화학 합성 모듈과 일회용 카세트 키트를 사용하여^[11C]PiB 방합성의 이 방법을 자동화했습니다. 특히 표준 20mL 일회용 플라스틱 주사기, 가스 흐름 컨트롤러, 진공 펌프 및 게이지에 맞는 주사기 드라이브(디스펜서)가 장착된 20밸브 방사성 화학 모듈에 이 방사능 합성을 구현했습니다. 이 방법의 단순성으로 인해, 우리는 카세트 기반 또는 고정 밸브가 장착 된 대부분의 상업적으로 사용할 수있는 자동화 된 신디사이저로 수정 할 수 있다고 확신합니다. 이 고체 위상 지원 기술은^[11C]PiB 생산을 우수 제조 관행(GMP) 규정을 준수하고 합성 신뢰성을 향상시킵니다. 여기에 설명된 기술은 또한 방사성 합성에 필요한 전구체의 양을 감소시키고, "녹색" 생체 적합성 용매만을 사용하고 연속생산 배치 사이의 시간을 감소시킨다.

프로토콜

1. 버퍼 및 용리산의 준비

1. 100 mL의 물에 2.72 g의 아세테이트 트리하이드레이트 나트륨을 용해하여 0.2M 나트륨 아세테이트 용액 (용액 A)을 준비하십시오.
2. 11.4 mL의 빙하 아세트산을 물 1 L에 용해하여 0.2 M 아세트산 용액 (용액 B)을 준비하십시오.
3. 용액 A의 50 mL을 450 mL의 용액 B와 결합하여 버퍼 레퍼런스^{센터(15)에}따라 pH 3.7(buffer 1)에서 아세테이트 버퍼를 준비한다. pH 스트립 또는 pH 측정기로 버퍼의 pH를 확인합니다.
4. 절대 에탄올 12.5 mL과 87.5 mL의 버퍼 1을 결합하여 100 mL 병에 12.5 % 수성 EtOH 용액 (세척 1)을 만듭니다.
5. 절대 에탄올 15mL와 85 mL의 버퍼 1을 결합하여 100 mL 병에 15 % 수성 EtOH 용액 (세척 2)을 만듭니다.
6. 절대 에탄올 5mL와 5 mL의 버퍼 1을 결합하여 50% 수성 EtOH 용액(최종 용리액)을 만들고 이 용액의 2.5 mL을 10 mL 주사기에 그립니다.

2. 전구체를 카트리지에 적용

1. 10 mL의 물을 통과한 다음 tC18 카트리지를 통해 5 mL의 아세톤을 통과하여 사전 컨디셔닝합니다.
2. 1 분 동안 50 mL / min에서 질소 스트림으로 카트리지를 건조.
3. 무수 아세톤의 1 mL에 전구체 6-OH-BTA-0 의 2 mg을 용해.
4. Luer-tip 250 μL 정밀 유리 주사기를 아래쪽으로 잡고 전구체 용액의 100 μL과 액체 위에 50 μL의 에어 쿠션을 인출합니다. 바늘을 제거하고 천천히 아래로 플런저를 밀어 여성 끝에서 tC18 카트리지에 전구체 용액을 적용합니다. 더 이상 솔루션을 밀어하지 마십시오!

3. 자동 합성을 위한 매니폴드 설정

1. 합성 모듈상에서 표준 5포트 일회용 매니폴드를 고정하고 아래 그림 2 및 단계 3.2 - 3.5에 따라 조립합니다.
   참고: 아세톤 내성 매니폴드를 사용하는 것이 좋습니다(재료 표참조).
2. 포트 1에는 두 개의 위치가 있습니다. 수평 입구를 20mL 주사기가 장착된 자동 디스펜서에 연결합니다. 수직 입구를 세척 1로 병에 연결합니다.
3. [11C]CH3 OTf를 생성하는 모듈의 출력을 매니폴드의 포트 2에 연결합니다.
4. 포트 3과 4 사이에 전구체 6-OH-BTA-0이 장착된 tC18 카트리지를 설치합니다.
5. 포트 5에는 두 개의 위치가 있습니다. 수평 콘센트를 200mL 이상 보관해야 하는 폐병에 연결합니다. 멸균 필터를 통해 트레이서 수집을 위해 수직 출구를 멸균 바이알에 연결합니다.

4.^[11C]PiB의 방합성

주의: 방사성 동위원소와 관련된 모든 조작은 방사성 물질로 작업할 수 있는 적절한 교육을 받은 직원이 납 보호 핫 셀에서 수행해야 합니다.
참고: 이 프로토콜은 방사화학 모듈을 사용하여 [11 C]CH3 OTf로의 전환 및사이클로트론에서^[11C]CO2의 생산의 세부 사항을 다루지 않는다. 이러한 절차는 방사성 화학 실험실의 개별 장비에 따라 달라지며 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 우리의 PET 센터는 가스에 N₂/O 2 가스 혼합물 (99.5:0.5)와 ¹⁴N (p,α) 11 C 핵 반응을통해 ^[11C]CO2의 화학 형태로 탄소^11을생산하는 IBA 사이클로트론이 장착되어 있습니다. 표적, 및^[11C]CH3 I의생산을 위한 시판되는 모듈은 "건조 방법"(촉매 환원^[11C]CH4 및 라디칼 이오디네이션)을 통해 한다. 【¹¹C 】 _CH3OTf는^[11C]CH3 I를 20 mL/min에서 175°C로 가열된 은 삼중팽창 컬럼위에 통과시킴으로써 제조된다.

1. [11C]CH3OTf를 포트 2를 통해 매니폴드에 전달하고^[11C]CH₃OTf 모듈에 의해 조절된 20 mL/min 출력 흐름에서 로드된 tC18 카트리지를 통과하고, 포트 3과 4를 통해 폐기물 병에 그림 2A.
2. 모든 방사능이 카트리지 홀더 뒤의 방사능 검출기에 의해 모니터링되는 tC18 카트리지에 전송되고 트랩되면 포트 2를 닫아 가스의 흐름을 중지합니다. 카트리지가 2분 동안 앉아 서 서 반응을 완료 합니다.
3. 그림 2B에도시된 바와 같이 100 mL 병에서 100 mL 병에서 포트 1을 통해 디스펜서 주사기로 19 mL의 세척 1용액(단계 1.4참조)을 인출한다.
4. 도 2C에표시된 대로 포트 3과 4를 통해 tC18 카트리지를 통해 디스펜서에서 세척 1 8.5 mL을 분배하고 50 mL / min에서 폐병에 분배하십시오. 분리 효율을 떨어뜨릴 수 있기 때문에 매니폴드에 기포가 없는지 확인합니다.
5. 4.3단계와 4.4번을 4회 반복하여 매번 18.5 mL의 세척 용액을 인출하고 분배합니다. tC18을 통과한 세척 1 용액의 총 부피는 92.5 mL; 그러나, 사용되는 특정 합성 모듈에 따라 90- 100 mL 범위 내에서 달라질 수 있다.
6. 포트 1의 입력 라인을 세척 1에서 세척 2 용액으로 전환합니다(1.5단계 참조).
7. 4.3단계와 4.4번을 세 번 반복하여 매번 18.5 mL의 세척 2용액을 인출하고 분배합니다. tC18을 통과한 세척 2 용액의 총 부피는 55.5 mL입니다. 그러나, 사용되는 특정 합성 모듈에 따라 50- 60 mL 범위 내에서 달라질 수 있다.
8. 그림 2D에표시된 대로 밸브 5를 최종 바이알쪽으로 전환합니다. 디스펜서에서 라인을 분리하고 최종 용리액 의 2.5 mL을 포함하는 10 mL 주사기에 연결하십시오 (50 % 수성 EtOH, 단계 1.6 참조) 및 공기 7.5 mL.
9. 주사기를 아래쪽으로 잡고, 최종 용리액 용액(2.5mL)을 수동으로 밀어내고, 그 다음에 공기(7.5 mL)를 포트 3과 4를 통해 tC18 카트리지를 통과하고 그림과 같이 멸균 필터를 통해 트레이서 수집을 위한 멸균 바이알로 2D.
10. 빈 주사기를 분리하고 멸균 인산완충액 10mL를 함유한 10mL 주사기를 연결하고(레시피는 다를 수 있으므로 포함되지 않음) 전술한 바와 같이 tC18 카트리지를 통해 전체 부피를 멸균 바이알에 밀어 넣습니다(그림2D ). 주사기를 분리하고 동일한 주사기를 사용하여 10mL의 공기로 라인을 세척합니다.
11. 최종 트레이서 제제의 0.7 mL을 철회하고 품질 관리 절차 (0.1 mL), 세균 내독소 테스트 (0.1 mL) 및 멸균 (0.5 mL)에 대한 샘플을 수집합니다.

5. 품질 관리 절차

주의: 방사성 추적기의 각 배치는 인간 또는 동물 대상체로 투여하기 위해 PET 이미징 부위에 방출되기 전에 적절한 품질 관리 절차(QC)를 거쳐야 합니다. 이 원고의 저자는 지역 보건 당국 규정과 다른 센터에서 생산 된 방사성 추적기의 준수에 대한 책임을지지 않습니다.

1. 제형의 잔류 용매 함량 및 pH뿐만 아니라 추적자의 방사성 화학적 정체성 (RCI), 방사성 화학 적 순도 (RCP), 화학 적 순도 및 대구치 활성에 대한 테스트를 포함해야하는 시험판 QC 절차를 수행하십시오.
2. UV(350nm에서 모니터링) 및 방사능 검출기 및 역위상 컬럼이 장착된 분석 HPLC 시스템을 통해 RCI, RCP, 화학적 순도 및 대구치 활성을 결정합니다. 6-OH-BTA-0 및 6-OH-BTA-1의 유지 시간을 결정하고 각 화합물의 함량을 정량화하기 위해 계측기를 보정합니다.
3. 모세관 컬럼이 장착된 분석 가스 크로마토그래피 시스템을 통해 잔류 용매 함량을 결정합니다. 아세톤과 에탄올의 유지 시간을 결정하고 각 용매의 함량을 정량화하기 위해 계측기를 보정합니다.
4. 적합한 카트리지가 장착된 카트리지 리더기를 사용하여 세균 내독소 테스트를 수행합니다.
5. 세균 성장의 부재를 보장하기 위해 합성 후 적어도 14 일 샘플의 멸균 분석을 수행하거나 지역 보건 당국에 의해 공인 된 실험실에 멸균 샘플을 보냅니다.

결과

^[11C]PiB의 전형적인 방사성 합성을 요약하기 위해, 기체^[11C]CH3 OTf는 먼저 전구체의 용액으로 미리 로드된 tC18 카트리지를 통과한다(도1). 반응 혼합물의 분리는 다음과 같이 수성 에탄올 용액을 가진 연속적인 용출에 의해 달성된다. 먼저, 12.5% EtOH는 대부분의 미반응^[11_C]CH3OTf 및 6-OH-BTA-0을 용해시키고, 15% EtOH는 ?...

토론

플로베타피르, 플로르베타벤 및 플루메타몰과 같은 ^18개의F 라벨이 부착된 PET 트레이서의 최근 출현 및 FDA 승인에도^{불구하고[11}C]PiB는 빠른 뇌 섭취와 낮은 비특이성 으로 인해 아밀로이드 이미징을 위한 골드 표준 트레이서로 남아 있습니다. 바인딩. 현재 이 트레이저는 습식 화학^16을 통해 합성되거나 "드라이 루프" 접근법^4,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525