동적 광 산란 입자 크기 분석에 전압 적용

요약

여기서, 폴리머 응집에 대한 전압 및 온도 변화의 효과를 탐구하고자 하는 의도로 동적 광 산란 입자 크기 측정 시 용액에 전압을 적용하는 프로토콜이 제시된다.

초록

동적 광 산란(DLS)은 중합체, 단백질 및 기타 나노 및 미립자의 크기 분포를 특성화하는 일반적인 방법입니다. 현대계측은 시간 및/또는 온도의 함수로 입자 크기를 측정할 수 있지만, 현재 는 인가 된 전압이 있는 경우 DLS 입자 크기 분포 측정을 수행하는 간단한 방법이 없습니다. 이러한 측정을 수행하는 능력은 감지, 소프트 로봇 공학 및 에너지 저장과 같은 응용 분야에 대한 전기 활성, 자극 반응 폴리머의 개발에 유용 할 것입니다. 여기서, 전기활성 단량체가 유무에 관계없이 열반응 폴리머의 응집 및 입자 크기의 변화를 관찰하기 위해 DLS 및 온도 램프와 결합된 인가 전압을 사용하는 기술이 제시된다. 이러한 실험에서 관찰된 응집 거동 변화는 전압 및 온도 제어의 결합 된 적용을 통해서만 가능했습니다. 이러한 결과를 얻기 위해, potentiostat는 용액에 전압을 가하기 위해 수정된 큐벳에 연결되었다. 폴리머 입자 크기의 변화는 일정한 전압이 있는 경우 DLS를 사용하여 모니터링되었습니다. 동시에 현재 데이터와 입자 크기 데이터를 비교할 수 있는 현재 데이터가 생성되어 현재 및 입자 동작 간의 관계를 이해할 수 있습니다. 중합체폴리(N-이소프로필라크릴라미드)(pNIPAM)는 온도에 대한 pNIPAM의 반응이 잘 연구됨에 따라 이 기술에 대한 시험 중합체로서 사용하였다. pNIPAM 및 폴리(N-isopropylacrylamide)의 저임계 용액 온도(LCST) 응집 거동에서의 변화는-블록-폴리(ferrocenylmethylmethacrylate), 전기화학적 활성 블록-공중합체, 인가된 전압의 존재 하에서 관찰된다. 인가 된 전압이있는 경우 가역적 인 폴리머 구조를 달성하려고 할 때 이러한 변화의 뒤에 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다.

서문

동적 광 산란(DLS)은 용액^1을통해 산란된 빛의 강도에 임의의 변화를 사용하여 입자 크기를 결정하는 기술이다. DLS는 입자 크기를 결정하여 폴리머의 응집을 측정할 수 있습니다. 본 실험에서, DLS는 낮은 임계 용액 온도(LCST)^2,3을초과하는 것을 나타내는 중합체 응집체때 관찰하기 위해 제어된 온도 변화와 결합되었다. LCST 아래에는 하나의 균질성 액체 상이 존재합니다. LCST 위에, 중합체는 용해성, 응집체 및 용액에서 응축됩니다. 적용 된 전압 (즉, 적용 된 전위 또는 전기장) 응집 동작 및 LCST에 전기장의 영향을 관찰 하기 위해 산란 필드에 걸쳐 도입 되었다. 입자 크기 측정에서 전압을 적용하면 센서, 에너지 저장, 약물 전달 시스템, 소프트 로봇 등 다양한 분야에서 입자 거동 및 후속 애플리케이션에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이 프로토콜에서, 2개의 예시 중합체가 사용되었다. 폴리(N-isopropylacrylamide) 또는 pNIPAM은, 광수분자 사슬 에 친수성 아마이드 기 및 소수성 이소프로필 기 모두를 포함하는 열에 민감한 중합체이다^4,5. pNIPAM과 같은 열 반응 성 폴리머 재료는 최근^3,4에서통제 약물 방출, 생화학 적 분리 및 화학 센서에 널리 사용되어 왔다. pNIPAM의 LCST 문헌 값은 약 30-35 °C^4입니다. pNIPAM은 전형적으로 전기화학적으로 활성화되지 않습니다. 따라서, 제2 샘플 중합체로서 전기화학적 활성 블록을 중합체에 첨가하였다. Specifically, ferrocenylmethyl methacrylate was used to create a poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate) block-copolymer, or p(NIPAM-b-FMMA)^6,7. 두 예 중합체 모두 제어 된 사슬 길이^8,9,10을가진 가역 적 첨가 단편화 사슬 전달 중합에 의해 합성되었다. 비전기화학적 활성 폴리머인 pNIPAM을 100 머퓨어 pNIPAM으로 합성하였습니다. 전기화학적 활성 중합체p(NIPAM-b-FMMA)는 또한 100메르 사슬 길이였으며, 이는 4% 페로세닐메틸 메타크릴레이트(FMMA) 및 96% NIPAM을 함유하였다.

이 문서에서는 중합체 응집에 대한 인가 전압의 영향을 연구하는 프로토콜 및 방법론이 입증되었습니다. 이 방법은 또한 단백질 접기/전개, 단백질 단백질 상호 작용 및 정전기로 충전된 입자의 응집 분석과 같은 DLS의 다른 응용 분야로 확장될 수 있습니다. 샘플을 20°C 에서 40°C로 가열하여 1V 적용 필드의 부재 및 존재 시 LCST를 식별하였다. 이어서, 샘플을 임의의 히스테리또는 평형 효과를 연구하기 위해 적용된 필드를 방해하지 않고 40°C 에서 20°C로 냉각시켰다.

프로토콜

1. 예시 중합체 제제

1. pNIPAM 폴리머 합성
   참고 : 이 준비는 3-4 실험에 충분한 1 g / L 용액의 10 mL을 생성합니다.
   1. 슐렌크 라인 장치를 준비합니다. 콜드 트랩 Dewar 플라스크가 드라이 아이스와 아세톤의 슬러리로 채워져 있는지 확인하거나 기계식 냉동 트랩을 사용하는 경우 트랩이 적절한 온도에 도달했는지 확인하십시오.
   2. 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 N-이소프로필라크릴라미드(NIPAM) 모노머 0.566 g을 추가, 0.016 g의 가역적 첨가 단편화 사슬 전달 중합 (RAFT) 제제 (프탈리미도메틸 부틸 트리티오카보네이트), 0.0008 g의 2,2-아조비스 (2-메틸 프로피온리트릴) 및 1,4-다이옥산의 10 mL. 플라스크에 볶은 막대를 넣습니다. 플라스크를 고무 중격으로 밀봉하고 비닐 테이프로 감싸고 단량체를 1,4-다이옥산에 녹입니다.
   3. 다음과 같이 동결 펌프 해동 탈기 수행: 드라이 아이스와 메탄올 슬러리를 함유한 Dewar 플라스크에 둥근 바닥 플라스크를 침지하여 용액을 동결합니다. 모든 물질이 동결되면 슐렌크 라인의 진공 매니폴드를 사용하여 플라스크를 100 kPa 미만의 내부 압력으로 배출합니다. 플라스크를 분리하고 따뜻한 물을 사용하여 정적 진공 하에서 해동합니다. 슐렌크 라인의 질소 매니폴드를 사용하여 플라스크를 대기압으로 되돌린다.
   4. 내부 산소 농도를 최소화하기 위해 1.1.3 단계를 세 번 반복합니다.
   5. 질소로 용액을 분리하여 대기압력의 균형을 맞추세요. 오일 욕조를 사용하여 혼합물을 85°C로 가열하고 36시간 동안 200 rpm에서 저어줍니다.
   6. 50 mL 비커에 헥산 40 mL를 추가하십시오. 그런 다음 중합체 혼합물을 헥산에 드롭와이즈로 첨가한다. pNIPAM은 백색 응고로 침전시켜야 합니다.
      참고 : NIPAM 단량체는 헥산에 용해되지만 pNIPAM은 헥산에서 용해도가 좋지 않습니다.
   7. 흐린 혼합물을 뷔흐너 깔때기에 붓고 흰색 pNIPAM 분말을 수집합니다. 분말을 20 mL 바이알로 옮기고 남은 용매를 제거하기 위해 밤새 진공 오븐에 넣습니다. 필요할 때까지 실온에서 밀봉된 용기에 보관하십시오.
2. pNIPAM-블록-폴리 (페로세닐 메틸 메타 크릴레이트) 블록 공중합체 (p (NIPAM-b-FMMA)) 합성
   참고 : 이 준비는 3-4 실험에 충분한 1 g / L 용액의 10 mL을 생성합니다.
   1. 슐렌크 라인 장치를 준비합니다. 콜드 트랩 Dewar 플라스크가 드라이 아이스와 아세톤의 슬러리로 채워져 있는지 확인하거나 기계식 냉동 트랩을 사용하는 경우 트랩이 적절한 온도에 도달했는지 확인하십시오.
   2. 50 mL 라운드 바닥 플라스크에 0.057g의 페로세닐메틸 메타크릴레이트(FMMA) 모노머, 래프팅 제약0.016 g, AIBN 0.0008 g, 1,4-다이옥산 10 mL을 추가합니다. 플라스크에 볶은 막대를 넣습니다. 플라스크를 고무 중격으로 밀봉하고 비닐 테이프로 감싸고 단량체를 1,4-다이옥산에 녹입니다.
   3. 다음과 같이 동결 펌프 해동 탈기 수행: 드라이 아이스와 메탄올 슬러리를 함유한 Dewar 플라스크에 둥근 바닥 플라스크를 침지하여 용액을 동결합니다. 모든 물질이 동결되면 슐렌크 라인의 진공 매니폴드를 사용하여 플라스크를 100 kPa 미만의 내부 압력으로 배출합니다. 플라스크를 분리하고 따뜻한 물을 사용하여 정적 진공 하에서 해동합니다. 슐렌크 라인의 질소 매니폴드를 사용하여 플라스크를 대기압으로 되돌린다.
   4. 내부 산소 농도를 최소화하기 위해 1.2.3 단계를 세 번 반복합니다.
   5. 질소로 용액을 분리하여 대기압력의 균형을 맞추세요. 오일 욕조를 사용하여 혼합물을 85 °C로 가열하고 10 시간 동안 저어줍니다.
   6. 니팜 0.543 g과 AIBN 0.0002 g을 3 mL의 1,4-다이옥산에 녹입니다. 용액을 질소 하의 플라스크에 넣고 30 분 동안 스파지. 오일 욕조를 사용하여 혼합물을 85 °C로 가열하고 다른 36 시간 동안 200 rpm에서 저어줍니다.
   7. 50 mL 비커에 헥산 40 mL를 추가하십시오. 그런 다음 중합체 혼합물을 헥산에 드롭와이즈로 첨가한다. P (NIPAM-b-FMMA)는 FMMA 단색이 진한 노란색을 가지고 있기 때문에 갈색 분말로 침전시켜야합니다.
      참고 : NIPAM 및 FMMA 단량체는 헥산에서 용해되지만 p (NIPAM-b-FMMA)는 헥산에서 용해도가 좋지 않습니다.
   8. 갈색 흐린 혼합물을 뷔흐너 깔때기에 붓고 갈색 p(NIPAM- b-FMMA) 분말을 수집합니다. 분말을 20 mL 바이알로 옮기고 남은 용매를 제거하기 위해 밤새 진공 오븐에 넣습니다. 필요할 때까지 실온에서 밀봉된 용기에 보관하십시오.

2. DLS 샘플 및 큐벳 준비

참고: 이 섹션에서는 적용된 전압에 대한 큐벳과 DLS 측정을 위한 샘플을 준비합니다.

1. 10 mg의 폴리머 분말을 측정하고 여과 된 탈이온화 (DI) 물 10 mL에 용해하십시오. 혼합물을 밤새 냉장고에 넣습니다. 실험을 시작할 준비가 되면 샘플을 얼음 위에 두십시오.
   참고: 이러한 실험에 사용된 중합체 농도는 1 g/L이었지만 각 시료에 대한 최적의 농도 범위는 고유합니다. 또한 테스트준비가 완료될 때까지 중합체를 LCST 아래에 두는 것이 가장 좋습니다.
2. 6.3 mm x 7cm 단면 구리 테이프 2 개를 잘라냅니다(그림 1). 핀셋을 사용하여 각 조각을 DLS 샘플 큐벳 내부의 반대쪽에 고정하고 라이트 경로에 수직으로 고정합니다. 테이프의 바닥은 큐벳 의 바닥 근처에 도달해야합니다. 구리 테이프의 가장자리를 큐벳 상단위로 접습니다. 구리 테이프가 좋은 전기 접촉을 보장하기 위해 샘플 큐벳의 상단에 가까이 / 포장되어 있는지 확인하십시오. 또한 구리 테이프가 Zeta 전위 측정에 사용되는 DLS 장비와 관련된 금속 접점으로 연결되지 않았는지 확인하십시오.
3. 큐벳을 DI 물로 세 번 씻은 다음 킴스 와이프로 여분의 물을 떨어 빼냅니다.

3. DLS 계측기 제어 및 설정

참고: 각 DLS 실험을 실행하기 전에 세 가지 컨트롤을 완료하는 것이 좋습니다: (1) 빈 물 솔루션; (2) 크기 표준; (3) 온도 램프 또는 인가 전압이 시작되기 전에 폴리머의 측정. 샘플 준비, 설정 선택, 샘플 및 데이터 품질 평가에 대한 지침은 작동 전에 계측기 설명서를 참조하십시오.

1. 여과된 용매 1.5 mL을 큐벳으로 옮김. DI 물을 사용하십시오.
2. 큐벳 홀더에 큐벳을 삽입하여 큐벳 상단의 작은 화살표가 큐벳 홀더와 정렬되도록 합니다. 뚜껑을 닫습니다.
3. Zetasizer 소프트웨어 내에서 도구 모음에서 측정을 선택합니다. 컨트롤에 대한 수동 측정이 설정되었습니다. 온도를 실험 시작점으로 설정합니다. 이 실험의 경우 20°C를 선택합니다.
4. 창 아래쪽에 있는 텍스트가 표시되면 셀을 삽입하고 시작할 준비가 되면화면 상단의 녹색 삼각형 시작 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 실험이 시작되고 큐벳 홀더를 열면 안 됩니다.
5. 실시간 결과를 관찰하려면 다중 보기를 클릭합니다. 카운트 속도와 상관 관계를 관찰하여 샘플 및 데이터 품질을 지속적으로 모니터링합니다. 이 샘플은 용매일 뿐이므로 입자의 존재에 해당하는 명확한 신호를 관찰해서는 안 됩니다.
6. 큐벳에 표준 용액 두 방울을 떨어뜨리거나 물 제어를 사용하고 3.2-3.6 단계를 반복하십시오. 이 실험에 20nm NIST 추적 가능한 폴리스티렌 크기 표준을 사용합니다.
   참고: 물 또는 표준 솔루션 컨트롤이 실행되는 경우 예상 결과와 일치하지 않는 데이터가 표시되면 오류를 해결하고 컨트롤이 예상대로 읽을 때까지 반복합니다.
7. 큐벳을 헹굴린 후 여과된 폴리머/테스트 솔루션을 추가합니다. 3.2-3.5단계를 반복합니다. 초기 테스트 솔루션의 명확한 측정을 준수해야 합니다. 기준선 측정을 위해 온도 램프 또는 적용 전압 전에 이 작업을 수행하는 것이 좋습니다.

4. DLS SOP 설정

참고: 이 섹션은 말번 제타제나제나노ZS DLS 계측기의 온도 램핑 작동을 구체적으로 말합니다. 실험을 시작하기 전에 셀 선택, 샘플 준비, 측정 설정 선택, 샘플 및 데이터 품질 평가에 대한 지침은 계측기 설명서를 광범위하게 참조하는 것이 좋습니다.

1. Zetasizer 소프트웨어(버전 7.11) 내에서 파일을선택한 다음 새 SOP를 설정하려면 새 를 클릭합니다(그림2).
2. 측정 유형을 클릭하여 추세 > 온도 > 크기를선택합니다.
3. 재질에서적절한 재료 및 굴절률을 선택합니다. 본 실험에서 단백질 및 굴절률(RI)을 1.450으로 선택합니다. 체적 분포를 보다 정확하게 계산하기 위해 굴절률에 대한 정확한 값이 필요한 경우 실험자는 샘플의 굴절률을 실험적으로 결정해야 합니다.
4. 분산제에서적절한 용매를 선택합니다. 이 실험에서 물을 용매로 선택합니다.
5. 셀에서사용 중인 큐벳을 선택합니다. 이 실험에서는 일회용 큐벳(DTS0012)을 사용합니다.
6. 순서대로 시작 온도 및 끝 온도를설정합니다. 가열 실험의 경우 시작 온도를 20°C로 설정하고 끝 온도를 40°C로 설정합니다. 냉각 실험의 경우 그 반대를 선택합니다. 시작 온도 로 돌아가기 상자를 선택 취소합니다.
7. 각 온도 단계 변화에 대한 간격을 선택합니다. 이러한 실험의 경우 1.5°C를 선택합니다.
8. 크기 측정에서 평형 시간을설정합니다. 이러한 실험의 경우 지속 시간을 120s로 설정합니다. 측정 기간에 대해 3개의 측정 및 자동 측정을 선택합니다.
9. SOP를 저장한 다음 파일을 닫습니다.
10. 인가된 전압을 사용할 경우, 계속하기 전에 potentiostat(섹션 5)를설정하십시오.
11. potentiostat가 설정되거나 적용된 전압이 사용되지 않으면 Zetasizer 소프트웨어로 돌아가서 도구 모음에서 측정을 클릭한 다음 SOP 시작을클릭합니다.
12. SOP 창 하단의 텍스트가 표시되면 셀을 삽입하고 시작할 준비가 되면화면 상단의 녹색 삼각형 시작 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 실험이 시작되고 큐벳 홀더를 열면 안 됩니다.
13. 실시간 결과를 관찰하려면 다중 보기를 클릭합니다. 카운트 속도와 상관 관계를 관찰하여 샘플 및 데이터 품질을 지속적으로 모니터링합니다. 대표적인 실험 결과는 그림 3-5를 참조하십시오.

5. 포텐티오스타트 설정

참고: 입자 크기와 적용 전압 작업에 동일한 컴퓨터를 사용하여 데이터를 시간 동기화하여 나중에 쉽게 평가할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 배선 설정, 소프트웨어 상담 및 적절한 파라미터 선택에 대한 지침은 적용 전압 계측기 매뉴얼을 참조하십시오. 감리 전위치가 이러한 실험에 사용되었다.

1. DLS 큐벳 홀더 영역의 오른쪽 상단 가장자리에 있는 작은 틈새를 통과할 수 있을 만큼 얇은 두 개의 와이어를 준비합니다(그림6). 준비 된 와이어의 한쪽 끝에, potentiostat에 연결을 허용하기 위해 절연을 제거합니다. 반대쪽 끝에짧은 악어 클램프를 와이어에 납땜하고 큐벳에 연결합니다. DLS 샘플 덮개가 닫혀 있는지 확인합니다.
2. 흰색 참조 potentiostat 리드와 빨간색 카운터 potentiostat 준비 된 와이어 중 하나에 함께 리드를 고정합니다. 녹색 작업 potentiostat 리드와 파란색 작업 감각 potentiostat 다른 준비 된 와이어로 이어질 클램프. 이 실험에서는 주황색 카운터 센스와 검은색 접지 potentiostat 리드를 사용하지 말고 부동 상태로 두지 마십시오. 회로가 짧지 않도록 하기 위해 이러한 와이어는 다른 납 또는 전도성 표면에 닿지 않아야 합니다.
   참고: 각 잠재 리드가 어느 쪽에 연결되어 있는지는 중요하지 않습니다.
3. 소프트웨어 도구 모음 내에서 실험을클릭한 다음 옵션 E 물리적 전기 화학을클릭하고 크로노암페로미터를선택합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 시간에 따라 측정된 전류 응답으로 단일 전압을 가하여 간단한 적용 전압을 사용하십시오(즉, 크로노암페로미터트리). 특정 전기화학적 방법론에 관계없이 시간이 지남에 따라 시스템 응답을 모니터링하는 것이 좋습니다.
   1. 사전 단계설정 , 1단계및 2단계 전압 대 참조. 이것은 전체 필드 /큐벳에 걸쳐 적용 된 전압이 될 것입니다. 세 단계 모두에 대해 전압을 1V 대 레퍼런스로 설정합니다.
   2. 사전 단계 지연 시간을설정합니다. 이러한 실험의 경우 신호를 기록하기 전에 시스템이 원하는 전압에서 안정적인지 확인하기 위해 0.5s로 설정합니다.
   3. 1단계 및 2단계모두 의 시간을 설정합니다. 이렇게 하면 전압이 적용되는 시간이 제어됩니다. DLS 실험 전반에 걸쳐 적용된 전압이 계속 되도록 둘 다 14,400s로 설정합니다.
   4. 샘플 기간을 설정합니다. 그래프가 전류 및 전압 값을 읽고 기록하는 빈도입니다. 이 실험에서 10.0s를 사용합니다.
      참고: 여기에 제시된 데이터에 대해 다른 설정은 중요하지 않습니다. 시스템의 기본값이 사용되었습니다.
4. 확인을 클릭합니다. 상단 도구 모음에 전압이 적용되고 있음을 나타내는 활성 기호가 표시됩니다. 전류는 적당한 반응 (μA)을 제공해야하며, potentiostat을 과부하시키지 않아야합니다. 신호나 과도한 신호가 관찰되지 않으면 시스템이 잘못 연결될 수 있으므로 오류를 해결하고 예상 전류가 관찰될 때까지 반복합니다.
5. DLS SOP를 시작하려면 4.10 단계로 돌아갑니다.

6. 데이터 분석

참고: 이 섹션에서는 얻은 데이터를 이해하기 위한 예비 분석을 자세히 설명합니다.

1. 데이터를 기본 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어로 가져옵니다.
2. 지정된 온도에서 측정 세트 내에서 각 실행에 대해 가장 큰 부피 백분율로 피크의 입자 체적 크기를 결정합니다.
3. 주어진 온도에서 기록된 세 측정값에 대한 체적 크기의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
4. 각 실험에 대해 y축(로그 스케일)과 x축의 온도(선형 축)에 대한 평균 크기 ±표준 편차를 플롯합니다.
5. 분석을 위해 Gamry 현재 데이터를 가져옵니다. y축의 x축 및 전류(마이크로암페어)에 시간으로 현재 데이터를 플로팅합니다.
6. 현재 데이터를 입자 크기 데이터와 연관시키기 위해 Zetasizer 데이터의 타임스탬프를 Gamry 현재 타임스탬프와 비교합니다. 이는 두 가지 유형의 데이터가 동일한 컴퓨터에서 수집되는 경우 가능합니다. 그렇지 않으면 기록된 시간을 가능한 한 가장 잘 일치시다.

결과

온도 램프에서 실행되는 각 실행의 실시간 파일 출력은 그림 3과같이 표로 표시됩니다. 각 레코드는 볼륨크기(도 4)및 상관 계수(도5)를확인하기 위해 독립적으로 선택할 수 있습니다. 체적 입자 크기 분포(PSD)는 전체 분포 및 LCST를 해석하는 가장 정확한 데이터이지만 데이터 품질은 상관 관계

토론

pNIPAM 또는 p(NIPAM-b-FMMA) 용액에 전압을 가하여 온도에 반응하여 중합체 응집 거동을 변화시켰습니다. 두 재료 모두 인가된 전압이 있을 때 용액이 LCST 이하로 냉각된 경우에도 폴리머의 부피 크기가 높게 유지되었습니다. 전압이 없는 시험에서 중합체가 원래 크기로 돌아오는 것을 보여주었기 때문에 이것은 예상치 못한 결과였습니다. 이러한 실험을 통해 우리는 온도 범위와 적용된 전압을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600