C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

요약

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

초록

C. 예쁜꼬마선충은 배아 발달 중 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 체계적으로 분석하기 위한 최고의 시스템입니다. 한 가지 과제는 배아 발생이 약 13시간 동안 동적으로 전개된다는 것입니다. 이 반나절 긴 기간 척도는 이미지화 할 수있는 배아의 수를 제한하여 실험의 범위를 제한했습니다. 여기에서는 중간 시간 해상도에서 최대 14개의 다른 조건에서 단일 하룻밤 실행에서 80-100개의 배아에서 동시에 3D 시간 경과 이미징을 허용하는 반 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 간단하며 지점 방문 용량을 갖춘 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 세균 층 명세서 및 형태 형성의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 표현하는 두 개의 맞춤형 균주를 이미지화하는 데 사용함으로써 입증됩니다. 데이터를 분석하기 위해 모든 채널, z-스텝 및 타임포인트에서 개별 배아를 더 넓은 시야에서 자르는 사용자 지정 프로그램을 구축하고 각 배아에 대한 서열을 별도의 티프 스택으로 저장합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 이 프로그램은 시각화 또는 자동화된 분석을 준비하기 위해 개별 배아를 분리, 전처리 및 균일하게 방향을 지정하여 데이터 처리를 간소화합니다. 또한 각 배아의 최대 강도 형광 투영 및 각 배아의 밝은 필드 이미지를 표시하는 다중 패널 파일로 개별 배아 데이터를 컴파일하는 ImageJ 매크로가 제공됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜 및 도구는 이전에 기술된 40개의 발달 유전자의 노크다운 에 따른 배아 발달을 특성화하기 위해 이를 사용하여 검증되었다; 이 분석은 이전에 추가된 발달 표현형을 시각화하고 새로운 표현형을 밝혔습니다. 요약하면, 이 작품은 유익한 형광 마커를 표현하는 균주와 결합될 때, 분석하기 위한 실험을 크게 가속화하는 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구와 결합된 반고처리량 이미징 방법을 자세히 설명합니다. 배아 발달.

서문

상기 C. elegans 배아는 기계론적 세포 생물학 및 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건의 분석을 위한 중요한 모델 시스템으로 배아^{발달을 유도하는 1,2,3,4 ,5},^6,7,8,9. 현재까지, 배아에서 세포 수준 사건 및 세포 운명 명세둘 다의 특성의 다량은 상대적으로 높은 시간 별 화상 진찰 실험을 사용하여 달성되었습니다 (즉, 10-100 s마다 취득) 배아발 발현 형광 마커. 초에서 수십 분의 순서로 이벤트에 적합하지만 이 방법은 기술적으로 더 긴 프로세스의 특성화에 대해 몇 시간에서 며칠로 제한됩니다. 연신장의 끝에 첫번째 절단에서 배아 발달은 대략 10 시간 걸립니다. 이 시점에서, 동시 낮은 시간 해상도 이미징을 허용 하는 반 높은 처리량 방법 (즉, 5-20 분 시간 간격에서 취득) 배아의 더 큰 코호트, 다른 조건에서, 실험의 새로운 범위를 열 것 이다; 예를 들면, 체계적인 대규모 검열 노력을 가능하게 하고 분자 섭란의 결과의 비교를 위한 태아의 충분한 수의 분석.

여기에서, 우리는 C. elegans 배아 발생을 감시하기 위한 반 높은 처리량 방법을 기술합니다 80-100배아에 있는 발달의 동시 3D 시간 경과 화상 진찰을 가능하게 하는, 14개의 다른 조건까지, 단 하나 밤새 실행에서. 이 프로토콜은 구현이 간단하며 포인트 방문 기능이있는 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 배아는 관심의 형광 마커를 발현하고 젊은 배아 (2-8 세포 단계)를 화상 진찰을 위한 384 웰 판의 우물로 옮기는 gravid 성인에게서 해부됩니다. 이 형식에서는, 상대적으로 작은 잘 크기는 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 배아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 좁은 지역으로 배영을 깔때기. 배아 의 코호트에 걸쳐 대략 동기 발달을 유지하기 위해, 해부는 차가운 매체에서 수행되고 플레이트는 1 시간 긴 해부 시간 기간 동안 중요한 발달을 방지 얼음에 개최됩니다. 플레이트는 현미경으로 이송되고 배아는 60x 오일 침지 1.35 NA 렌즈를 사용하여 20 분 간격으로 밤새 온도 제어 실에서 촬영되어 2 μm 단계에서 전체 z 범위를 수집합니다. 1-5개의 배아를 포함하는 각각 50개의 필드는, 한 번의 하룻밤 실행에서 심상됩니다. 원하는 실험에 따라 이미지 필드 수를 비례적으로 줄임으로써 시간 해상도(예: 5-10분 간격으로 이미징)를 늘릴 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하면 하룻밤 동안 실행해도 상당한 양의 데이터(50개 필드에 분산된 80~100개의 배아)를 생성하며, 더 큰 실험은 데이터 분석과 관련하여 빠르게 관리하기 가 불가능해질 수 있습니다. 이 데이터의 처리, 시각화 및 분석을 용이하게 하기 위해 배아를 자르고 방향을 조정하고 전처리 단계(선택 사항)를 수행하고 데이터를 컴파일하여 보기를 단순화하는 ImageJ 매크로를 수행하는 프로그램이 구축되었습니다. 이러한 프로그램은 이미징 방법과 무관하므로 단일 브라이트필드 평면만 필요로 하기 때문에 기존의 접근 방식을 사용하여 수집된 이미지를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 프로그램은 여러 배아 (GUI 옵션 또는 소스 코드 embryoCrop.py) 또는 여러 배아 (screenCrop.py)를 포함하는 여러 4D 필드를 포함하는 4D 필드에서, 단단히 배아를 작물과 전방 후방 구성에서 방향을 지정합니다. 또한 이러한 프로그램은 사용자에게 배경 감속, 드리프트 보정 및 감쇠 보정을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다. 결과 파일은 자동화된 이미지 분석으로 수정가능한 각 배아에 대해 균일하게 사전 처리되고 단단히 잘려진 티프 스택입니다. 각 조건에 대한 모든 배아를 더 간단하게 볼 수 있도록 ImageJ 매크로(OpenandCombine_embsV2.ijm)가 작성되어 주어진 상태의 모든 배아를 단일 티프 스택으로 조립하고 밝은 필드 이미지와 최대 강도 프로젝션 색상을 배열합니다. RGB) 각 배아에 대해 나란히 오버레이합니다. 이 방법은 배아 층의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 발현하는 한 쌍의 사용자 정의 내장 균주에서 40 개의 이전에 설명 된 발달 유전자를 노크 한 후 배아 발달을 특성화하는 데 사용함으로써 검증되었습니다. 사양 및 형태 형성^10,11. 함께, 세미 높은 처리량 배아 이미징 프로토콜 및 이미지 처리 도구는 개발 프로세스를 이해하기위한 더 높은 샘플 수 실험및 대규모 선별 노력을 가능하게 할 것이다. 또한, 이러한 균주는 또한 배아 발생에 대한 분자 교란의 효과를 검사하기위한 효율적인 수단을 제공 할 것입니다.

프로토콜

1. 세미 하이 처리량 이미징을 위한 C. 예쁜꼬마선충 배아 준비

참고: 프로토콜의 이 부분의 목표는 반 동기화 (2 to 8 세포 단계) C. 예쁜꼬마선의 집단을 적절한 마커 균주로부터 해부하는 것입니다(그림 2),이미징을위한 유리 바닥 384 웰 플레이트. 그밖 격판덮개 는 또한 작동할 수 있었습니다, 그러나 작은 우물 크기가 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 태아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 상대적으로 작은 지역에 태아의 퍼짐을 제한하기 때문에 384 웰 플레이트는 바람직합니다. 대략 배아를 동기화하는 것은 발달의 전체 과정이 필드에 있는 각 태아를 위해 붙잡히도록 합니다.

1. 얼음 차가운 M9 배지에 용해된 테트라미솔 염산염(TMHC)의 5-10 mL 용액을 준비합니다(0.45 M Na₂HPO₄∙7H₂O, 0.11 M KH₂PO_4,0.04 M NH₄Cl) 동안 사용 해부 및 이미징. 이 매체는 부화한 유충을 움직이게 하는 것이 초기 발달 단계에서 태아의 화상 진찰을 방해하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 마취를 포함합니다.
   참고: 자르기 및 시각화 도구를 사용하여 표준 아가로즈 패드 장착 방법을 사용하여 수집한 데이터를 분석하는 경우 아래 섹션 3으로 건너뜁니다.
2. 유리 바닥 384 웰 플레이트의 개별 웰로 제조된 용액의 Aliquot 70 μL은 각 조건에 대해 하나의 웰을 가지며; 가장자리 효과를 방지하기 위해 플레이트의 바깥쪽 두 행을 피하십시오.
   참고: 접착성 PCR 플레이트 호일을 사용하여 주변 우물을 마스크하는 것이 유용합니다(그림 1D의예 참조)이 향후 실험을 위해 인접한 웰을 보존하고 해부 현미경 아래에서 적절한 웰을 쉽게 찾을 수 있도록 합니다. 용액이 부록이 되면, 판과 남은 용액을 해부 전체에 걸쳐 얼음 위에 보관하십시오.
3. 우울증 슬라이드에서 배아를 전달하기 위한 입 피펫을 생성합니다(gravid hermaphrodites가 해부되는 곳). 모세관 파이펫(25 μL 보정된 파이펫)을 화염 위로 당기고 파손하여 미세한 테이퍼 엔드를 생성합니다(그림1D). 교차 오염을 방지하기 위해 조건당 하나의 파이펫이 필요합니다. 사용 후에는 파이펫을 폐기하십시오.
4. 미세 핀셋을 사용하여 ~ 10 그라비드 성인을 해부 범위 하에서 얼음 차가운 TMHC 용액의 150 μL로 각 조건에 대한 우울증 슬라이드에 aliquoted. 핀셋과 메스를 사용하여 벌레를 해부하여 배아를 풀어 놓습니다.
5. 당겨진 모세관 피펫을 피펫에 포함된 흡기 부착물 로 적재하고, 입 피펫을 모두 2~8세포 단계배아를 제조된 플레이트의 개별 우물로 이송한다(도1D). 후기 배아와 해부 파편을 옮기지 마십시오. 해부 범위에서 검사하고 배아의 응집체가 존재하는 경우, 입 파이펫 위아래로 또는 파이펫 팁과 배아의 덩어리를 두드려 분산.
   참고: 교차 오염을 방지하기 위해 해부 장비를 청소하고 조건 사이를 이동하는 동안 신선한 구강 파이프를 사용하십시오. 해부 사이에 얼음에 접시를 저장합니다.
6. 일단 모든 조건에서 벌레가 해부되고 배아가 적당한 우물에 두면, 배아를 정착시키기 위하여 600 x g에서 1 분 동안 384 웰 플레이트를 돌이기.
7. 에탄올에 적신 물티슈로 플레이트 바닥을 닦아 잔류물을 제거하고 온도 제어 환경에서 플레이트 홀더가 장착된 공초점 현미경에 플레이트를 놓습니다.
   참고: 다음 단계는 랩 설정을 사용하여 이 메서드를 자세히 설명합니다. 실험 요구 및 장비에 맞게 수집 조건을 수정하십시오. 여기서는 마이크로렌즈가 강화된 듀얼 Nipkow 회전 디스크가 장착된 공초점 스캐너 박스, 512 x 512 EM-CCD 카메라, 고정밀 자동 XY-Stage(지정 해상도 0.1 μm) 및 전동 z축 제어(지정 해상도 0.1 μm)가 사용됩니다. 이 시스템은 16°C 방에 보관되며, 이는 밤새 이미징 동안 21~23°C 사이의 현미경 온도를 유지한다.
8. 적합한 배아를 가진 필드를 확인하기 위하여는, 10x 0.4 NA 객관적이고 적당한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 각 우물의 사전 검사를 능력을 발휘합니다. 최적 필드는 다른 배아와 동일한 초점 면에 있는 하나 이상의 초기 단계 배아를 포함하고 이상적으로 인접한 태아 사이 최소한의 접촉을 가질 것입니다. 적합한 영역의 위치를 표시합니다.
9. 이미징 필드를 선택하려면 60x 목표로 전환하고 각 지점 방문시 초점 평면을 조정하여 배아를 적절하게 단면화합니다. 우물당 1-4개의 필드가 이미지화되어 있으며, 14개의 우물에서 총 50개의 필드가 있으며, 각 필드는 1~5개의 배아를 포함할 수 있습니다. 전반적으로, 4 에서 15 배아는 고해상도 화상 진찰을 위한 각 조건에서 선택됩니다.
   참고: 이 단계에서 핵심 변수는 충분한 오일의 사용입니다. 목표에 오일을 배치, 각 우물의 방문 포인트는 모든 우물의 표면 주위에 오일을 확산 한 다음 필드의 선택하기 전에 목표에 오일의 추가 방울을 적용합니다.
10. 60x 1.35 NA 목표를 사용하여 선택한 필드를 이미지화하여 10시간 동안 20분마다 2 μm 간격으로 18z 섹션을 획득합니다. 세균층 및 형태형성 리포터 균주를 이용한 이미징 조건은 다음과 같다: 브라이트필드, 90% 파워, 25 ms, 20% 이득; 488 nm, 100 % 전력, 200 ms, 60 % 이득; 568 nm, 45 % 전력, 150 ms, 60 % 이득.
11. 이미징이 완료된 후, 야간 이미징시작 후 저배율(10x 0.4 NA 목표) 전체 의 밝은 시야 스캔 ~20-24h를 수행하여 배아 치사율을 평가한다.

2. 배아 치사 점수

1. 사후 실행 10x 스캔 필드를 사용하여, 각 우물에 대한 부화 벌레와 해치되지 않은 배아를 계산하여 배아 치사및 애벌레 결함을 평가합니다.
2. 배아 치명적인 으로 부화되지 않은 배아 점수. 젊은 해부 된 배아가 때때로 난자 껍질 형성을 완료하지 못하고 (만이제증 II가 아직 완전하지 않은 경우) 투과성 결함이 처음 두 개 동안 삼투성 합병증으로 이어질 수 있기 때문에 치사 수에서 체포 된 1 - 4 세포 단계 배아를 제외하십시오. 부문.
3. '비정상적인 애벌레'로, 부분적으로 부화하거나 완전히 부화한 벌레의 신체 형태 또는 행동 결함(예: 덤프 또는 마비)을 점수화합니다.

3. 자동 자르기(그림 3A)

참고: 이 소프트웨어는 두 위치에 보관되어 있습니다 : (1) Zenodo는 프로그래밍 전문 지식이 필요하지 않은 소프트웨어^(12)의 사용자 친화적 인 버전을 보유하고 있습니다. (2) Github는 파이썬에 능숙해야 하는 embryoCropUI.py 및 screenCrop.py 소프트웨어^13의소스 코드를 포함합니다. 두 버전의 프로그램을 모두 다운로드하고 운영하기 위한 자세한 지침은 아래에서 확인할 수 있습니다.

1. 배아CropUI 실행 버전을 사용하여 자동 자르기 (사용자 친화적 인 버전)
   1. 배아CropUI 프로그램을 사용하려면 먼저 제노도(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^12에서프로그램을 다운로드합니다.
      1. 프로그램의 MacOS 또는 Windows 형식 버전을 다운로드합니다(MacOS 버전에는 MacOS X10.11 이상이 필요합니다).
      2. 배아CropUI 프로그램을 테스트하고 사용하기 위한 단계별 지침을 제공하는 지침파일(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx)을다운로드합니다.
      3. test_files.zip을 다운로드하여 프로그램이 플랫폼에서 제대로 작동하는지 테스트합니다(지침 참조).
   2. 일단 다운로드, 압축을 풀고 배아를 찾기 위해 탐색자르UI 실행 (...\배아CropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe)또는 (...\배아CropUI\_MacOS\배아CropUI\embryoCropUI\embryoCropUI\exe). 두 번 클릭하여 시작하거나 '열기' 터미널을 선택하고 배아CropUI 실행 을 실행합니다.
   3. GUI 실행 은 한 번에 하나의 4D 시야를 작물. 왼쪽 위 모서리에서 열린 단추를 선택하여 특정 필드를 자르기(다중 티프)로 로드합니다. 여러 차원(예: z, 시간, 채널)을 가진 tiff 계열을 자르는 경우 폴더 내의 시리즈의 첫 번째 이미지만 로드합니다(폴더당 하나의 tiff 계열).
   4. 이미지가 로드되면 z-슬라이스 수(Z), 시간 점 수(T), 채널 수(C), DIC 또는 브라이트필드에 해당하는 채널(첫 번째=1, 두 번째=2 등)을 지정합니다.
   5. 이미지에서 실행하려면 추가 처리를 선택합니다. 이 프로그램은 드리프트 보정, 배경 뺄셈 및 감쇠 보정을 제공합니다.
   6. GUI 프롬프트의 처리 노력을 안내하기 위해 백그라운드 빼기 및 감쇠 보정에 대한 매개 변수를 지정합니다. 배경 빼기의 경우 의미 있는 신호의 크기를 반영하도록 가장 큰 피쳐 크기를 정의합니다. 이 피쳐 크기는 배경으로 간주해서는 안 되며 홀수 값이어야 합니다. 감쇠 보정에 대한 0-1에서 값을 입력합니다. 감쇠 보정 값은 이미지되는 오브젝트의 가장 먼 깊이에 남아 있는 원래 강도의 백분율을 반영합니다.
      참고: 배경 빼기 및 감쇠 보정을 함께 실행해야 합니다.
   7. 이미지 수집 순서(예: 채널-z-시간(czt) 또는 z 채널 시간(zct))을 지정합니다.
   8. 사용 중인 카메라를 기반으로 이미지의 픽셀당 미크론을 지정합니다.
      참고: 픽셀 크기가 제대로 정의되지 않은 경우 이미지 자르기가 잘못 발생합니다.
   9. 왼쪽 하단 모서리에서 실행을 선택합니다. "자르기"라는 새 하위 폴더가 자르지 않은 폴더와 동일한 경로에 만들어집니다. 잘라낸 버전이 이 위치에 저장됩니다. 파일 크기에 따라 자르기는 몇 초에서 몇 분 안에 완료되어야 합니다.
2. screenCrop.py 사용하여 자동 자르기 (전술한 배아작물 GUI에 대한 배치 버전 대안;파이썬에 정통한 사용자만)^10,13
   1. screenCrop.py 사용하려면 Python 소프트웨어 버전으로 더 큰 데이터 세트를 일괄 형식으로 자르거나 Github(github.com/renatkh/embryo_crop.git)에서소스 코드를 복제하거나 다운로드합니다.
   2. 적절한 가상 환경을 구성하기 위한 지침을 읽고 설명된 파일 이름 지정 시스템을 따릅니다. 둘 다 Github 리포지토리의 README 파일에 자세히 설명되어 있습니다: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. 환경 변수와 명명 규칙이 제대로 설정되면 parameters.py 열고 screenCrop.py.
   4. 소스 코드를 건드리지 않고 조정 가능한 매개 변수를 수정하려면 parameters.py 파일을 편집합니다.
      참고: screenCrop.py 헤더 내에서 매개 변수를 직접 변경할 수도 있습니다.
      1. parameters.py 구성 파일을 사용하는 경우 use_configure 설정을 True로 변경합니다. screenCrop.py 내에서 직접 편집을 사용하는 경우 false에서 using_configure 설정을 그대로 둡니다.
      2. parameters.py 파일 내에서 다음 정보를 찾아 원하는 이미징 매개 변수 및 파일 구조에 맞게 수정합니다.
         1. loadFolder(9줄): 파일이 저장되는 드라이브로 변경(예: Z:/, D:// 등)
         2. 날짜(7줄): 이미징 세션에 대한 파일이 포함된 폴더로 변경합니다. CSV 추적 파일에서 '실험 폴더 이름'이라고 합니다(지침 참조).
         3. trackingFile(11줄): 실험 정보가 저장되는 CSV 파일의 경로를 변경합니다.
         4. z(13줄): z 평면의 수로 설정합니다.
         5. nT(line14): 타임포인트 수로 설정합니다.
         6. nWells(19호선): 사용된 웰 수로 설정합니다.
         7. 점방문(20줄): 최대 포인트 방문 횟수(웰당)로 설정합니다.
         8. 10줄에서 현재 'CV1000/'가 차지하는 위치를 찾아 파일 경로에 사용된 외부 폴더를 입력합니다. 문제를 방지하려면 다음 규칙을 사용하십시오.
         9. 줄 12에서 잘라진 데이터에 대한 종횡비 데이터를 저장하기 위한 유효한 파일 경로를 입력합니다.
         10. 줄 15, 16, 17 및 18 입력 True/False에서 이미지가 다음 처리를 거치는지 여부:
             1. 15호선의 드리프트 보정을 위한 트루 또는 거짓 입력.
             2. 배경에 대한 True 또는 False 입력은 16줄에서 뺍니다. 피처 크기는 다양한 마커 변형 및 픽셀 크기에 대해 경험적으로 결정해야 합니다. 여기서 구성에서, 특징 크기는 세균층 균주에 대해 41, 모포제네시스 균주에 대해 201로 정의되었다. 배경 빼기는 감쇠 보정과 함께 수행해야 합니다.
             3. 17호선의 감쇠 보정에 대한 True 또는 False 입력.
             4. 18호선의 전방 후방 회전에 대한 입력 참 또는 거짓.
   5. 모든 변경 사항이 완료되면 자르기 시작할 수 있습니다. 이렇게하려면 screenCrop.py 전환하고 드롭 다운 메뉴에서 실행 으로 실행 > 파이썬 실행을 선택하여 도구 모음에서 재생 아이콘을 선택합니다.
   6. 자르기는 큰 데이터 집합(50포인트 방문 18z 단계, 3채널, 31개 시점)을 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있기 때문에 콘솔 창에서 자르기 진행 상황을 추적할 수 있습니다. 자르기 작업이 완료되면 저장하기 전에 작은 창에 자른 이미지의 미리 보기가 표시됩니다. 각 이미지에는 3가지 옵션이 있습니다.
      1. 저장: 스페이스 바를 눌러 이미지가 잘리지 않고 잘리지 않으면 이미지를 저장합니다.
      2. X: 이미지에 관심 영역이 잘려 있는 것으로 나타나면 X를 누릅니다. 이미지는 이름 앞에 X로 저장되어 다른 이미지와 분리됩니다.
      3. 삭제: 이미지가 제대로 자르지 않거나 배아가 만족스럽지 않은 경우 D를 눌러 자른 이미지를 삭제합니다.
         참고: 이미지는 로드 폴더의 "자른 자른" 하위 폴더에 저장됩니다(프로그램의 9줄에 정의됨).

4. 시각화(그림 4)

참고 : OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12는 특정 변형 및 조건에 대한 모든 이미지에서 티프 파일을 쉽게 볼 수있는 ImageJ 매크로입니다. FIJI/ImageJ^14,15의 설치가 필요합니다. 이 매크로는 파일 구조에 따라 실행됩니다. 다른 파일 구조와 함께 작동하도록 수정해야 합니다. 적절한 파일 구조에 대한 가이드와 중요한 고려 사항에 대한 자세한 설명은 Zenodo 리포지토리의 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx 파일 의 끝에서 찾을 수있습니다. 이 매크로와 가장 잘 인터페이스하기 위해 제대로 이름과 구조 파일을 이미징하기 전에 완전히이 지침을 읽어보시기 바랍니다. 참조하기 위해 파일 위치 구조는 다음과 같습니다.
Z:\크롭\대상\변형률\Emb#\Target_Emb#_15 자리 고유 식별자 _W##F#_T##_Z##_C#.tif
즉, Z:\크롭\EMBD0001\GLS\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. 제노도 (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)에서 OpenandCombine_embsV2 및 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx를 다운로드합니다.
2. 다음 정보를 준비합니다.
   - 이미지 폴더가 저장된 위치 (자르기 다음).
   - 처리될 특정 조건에 대한 이미지 폴더 이름(즉, EMBD0002)입니다. 이를 위의 예에서 "대상"이라고 합니다.
   - 주어진 하룻밤 실험에 특정 15 자리 알파 숫자 고유 식별자-이 식별자는 데이터 수집 폴더 이름 (즉, 20140402T140154) 및 고유 식별자가 개별 tiff 파일 이름 (EMBD0002_Emb1_)에 포함 됩니다. 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) 당일 촬영된 모든 배아에 대해. 매크로는 이 식별자를 사용하여 동일한 날짜에 획득한 배아를 확인하고 별도의 날짜와 함께 반복되는 조건을 별도의 ImageJ 파일로 조합할 수 있습니다.
3. ImageJ를 열고 매크로 파일 OpenandCombine_embsV2.ijm을ImageJ 막대로 끌어서 놓거나 매크로를 직접 엽니다.
4. 매크로가 열리면 3번과 4줄을 찾습니다. 다음 단계에 따라 수집된 정보를 입력합니다(섹션 4.2).
   1. 3번(RNAL)에서 처리할 이미지의 대상 이름을 입력합니다. 입력 다음 구조 newArray("XXXXXXXX/")에 각 대상을 입력합니다. 인용문을 포함합니다. 한 번에 여러 조건을 실행하려면 쉼표로 분리하고 괄호 안에 모든 대상 이름을 유지합니다 (예 : newArray ("EMBD0000/","EMBD0001 /","EMBD0002/").
   2. 4줄(날짜)에서 인용부호에 15자리 알파 숫자 고유 식별자를 입력합니다(예: newArray("20140402T140154").
5. 매크로 창의 왼쪽 하단에서 실행을 누릅니다. 창이 나타나고, 이 프롬프트는 잘라진 이미지 폴더(4.4.1에 지정)를 포함하는 외부 폴더로 이동하라는 메시지를 시작합니다.
6. 일단 선택되면, 이미징 매개 변수의 사양을 허용하는 다른 창이 나타납니다.
   1. 채널 수, Z 조각 수, 컴파일된 이미지에 레이블을 지정하는 데 사용되는 텍스트의 글꼴 크기 및 각 채널의 색상을 입력합니다.
   2. 모든 채널에서 자동 대비를 켜고 끄세요.
7. 모든 매개 변수가 지정되면 창 하단에서 확인을 클릭합니다. 복합 파일이 어셈블되기 시작합니다. 이 작업을 완료하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
8. 완료되면 원하는 경우 열려 있는 파일을 검토합니다. 매크로가 이미 다음과 같은 방식으로 명명 된 새로 만든 폴더에 파일을 저장 으로 저장 하지 않고 닫을 수 있습니다.: 외부 폴더 이름 (섹션 4.5의 프롬프트에 지정) + "-피지 처리 출력" (즉, Z:\ 크롭 피지 처리 출력\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

결과

C. 예쁜꼬마기 배아 발달에 대한 분자 교란의 효과를 특성화하는 데 있어 중요한 과제는 배아가 첫 번째 절단에서 연신기 의 끝에서 20°^16에서진행되기까지 약 10 시간이 걸린다는 것입니다. 배아의 큰 코호트가 동시에 이미지화될 수 있는 세미 하이 처리량 방법은 각 조건에 대한 충분한 앙상블 크기와 병렬로 여러 조건의 이미징을 허용하기 때문에 이 시간 규모의 이벤트?...

토론

이 작품은 C. elegans에있는 배아 발달에 있는 유전자의 기능을 프로파일링하기 위하여 더 큰 규모의 노력을 가능하게 하기 위하여 개발된 공구 및 방법의 제품군을 기술합니다. 우리의 반 높은 처리량 방법은 단일 실험에서 80-100 배아에 대한 20 분 해상도에서 배아 발달의 3D 시간 경과 이미징을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원하는 마커 균주와 함께 사용하도록 적응 될 수 있지만,이 작품은...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832