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요약

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

초록

Cytoskeletal 모터는 진핵 세포에 있는 다양한 기능에 책임 있습니다, 유사분열, 화물 수송, 세포 운동성, 및 그 외를 포함하여. 이러한 기능 의 대부분은 앙상블에서 작동 모터가 필요합니다. 개별 cytoskeletal 모터의 메커니즘에 대한 풍부한 지식에도 불구하고, 상대적으로 적은 모터 앙상블의 메커니즘과 출현 행동에 대해 알려져있다, 그 예로 는 앙상블 프로세스성 및 속도에 대한 변화를 포함 모터 번호, 위치 및 구성을 변경합니다. 구조 DNA 나노 기술 및 DNA 종이 접기의 특정 기술은 모터 앙상블의 잘 정의 된 아키텍처의 분자 구조를 가능하게합니다. 화물 구조의 모양뿐만 아니라 구조에 모터의 유형, 수 및 배치를 모두 제어 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 앙상블을 생성하고 총 내부 반사 형광 현미경 검사법을 사용하여 그(것)들을 관찰하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 기술은 특히 세포골격 모터에 적용되었지만, 방법은 자신의 작업을 수행하기 위해 복합체에서 조립하는 다른 단백질에 일반화 할 수 있습니다. 전반적으로, 모터 단백질의 잘 정의된 앙상블을 만들기 위한 DNA 종이 접기 방법은 출현한 운동성 행동으로 이끌어 내는 기계장치를 해부하기 위한 강력한 공구를 제공합니다.

서문

다인과 키네신은 진핵 세포에 있는 무수한 기능에 책임 있는 세포골격 모터 단백질1. ATP 가수분해의 화학 적 에너지를 생산적인 작업으로 변환함으로써, 이 모터는 다양한 세포 내 화물을 운반하고 분배하기 위해 미세 소관에 전이합니다. 그(것)들은 또한 염색체의 위치 그리고 분리에 기여하는 편케한 힘을 전시하는 유사분열과 관련되었던 거대한 세포내 재배열에서 조정합니다. 단일 분자 관찰을 포함한 구조적, 생화학적 및 생화학적 분석을 통해 개별 수준에서 이러한 모터의 메커니즘이 밝혀졌습니다(전작2,3,4에서잘 검토됨). 그러나 모터의 많은 작업은 유사 모터 유형과 혼합 모터 유형의 작은 앙상블에서 작동하도록 요구합니다. 비교적 적은 이러한 앙상블의 활성 및 궁극적 인 출현 운동성을 조정하는 메커니즘에 대해 이해5,6. 이러한 지식 격차는 부분적으로 모터 유형 및 복사 번호와 같은 제어 가능한 기능을 갖춘 앙상블을 만드는 데 어려움이 있기 때문입니다. 지난 10 년 동안, DNA 종이 접기의 분자 건설 기술은이 문제를 해결하기 위해 채택되었습니다. 미세소관 계 모터의 경우, 이러한 조사의 몇 가지 예는 세포질 다인-17,8,9,intraflagellar dynein11의앙상블의 단일 분자 관찰을 포함한다. 다양한 키네신 모터12,13,및 다인및 키네신의 혼합물7,14,15. 여기에, 우리는 효모7,16,17,18,19,20에서모터의 정제 및 올리고 뉴클레오티드 라벨링의 세부 사항을 제공합니다. 접이식 및 정제 분할 된 DNA 종이 접기의 조정 준수8,및 섀시 구조를 추진 효모 모터의 이미징7,18.

시험관 내 단일 분자 관찰을 위한 모터 앙상블을 건설하려면 3차적인 노력이 필요합니다. 첫 번째는 DNA 종이 접기에 부착하기에 적합한 모터 구조의 발현, 정제 및 라벨링입니다. 두 번째는 정의 된 DNA 종이 접기 구조의 생산 및 정제 (종종 "섀시"라고도 합니다). 그리고 세 번째는 전체 내부 반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 관찰한 후 섀시 구조에 모터를 융합하는 것입니다. 여기서, 우리는 효모 사카로마이세스 세레비시아7, 16,17,18, 19. DNA 종이 접기 계 모터 앙상블은 재조합 키네신15 및 다인7,8,18 구성을 모두 사용하여 이 효모 발현 시스템에서 생산된구조(16)를 사용하여 조사되었다. ,17,18,19. 이 프로토콜은 갈락토제 유도 프로모터에 의해 제어되고, 정제(ZZ 및 TEV 프로테아제 링커) 및 DNA 올리고 어버전(SNAPtag)을 위한 동일한 단백질 태그에 융합된다는 점을 감안할 때 이들 구조에 대해 유효하다.

특정 효모 균주는 특정 모터 구조를 생성합니다. 예를 들어, 화물 순응의 역할을 연구하는 데 사용되는 다인은 변형성 RPY10847,8로부터정제되었다. 일반적으로, 발현 및 정제를 위한 적절한 유전자 변형을 갖는 모터 구조를 포함하는 균주는 이들 모터의 사용을 공표한 실험실로부터 요청될 수 있다. 돌연변이 또는 태그와 같은 새로운 특성을 갖는 구조는 리튬 아세테이트형질전환(21) 및 상용 키트와 같은 재조합 유전 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 단일 분자 연구를 위한 효모에서 변형된 모터 단백질을 만들기 위한 상세한 프로토콜은19. SNAPtag에 융합되는 모터 이외에, 모터를 라벨에 사용하는 올리고는 SNAP 기판, 벤질구아닌 (BG)에 공액되어야 합니다; 이전에 출판된 프로토콜은 BG-올리고접합부(18)의형성 및 정제를 기술한다. 여기에 설명된 전체 전략은 액틴 기반 모터(예:22,23,24참조) 및 다른 유기체 및 발현 시스템에서 정제된 모터(이전 참조)에도 사용되었습니다. 예제 7,9,10,11,12,13,14)에서작동합니다.

중합 된 미세 소관 (MTs)은 두 가지 다른 절차에서 이러한 실험에 사용됩니다. 기능성 모터의 MT 친화도 정제는 다른 작용기와 함께 라벨이 부착되지 않은 MT를 필요로 하며, 모터 앙상블 운동성 TIRF 분석법은 비오틴과 형광로광으로 표시된 MT를 필요로 합니다. 모든 경우에, MT는 변이를 방지하기 위해 탁솔으로 안정화됩니다. MT 선호도 정제 단계는 이러한 모터가 섀시에 컨쥬게이션된 경우 앙상블 운동성을 변경할 수 있기 때문에 MT 친화성이 높은 비운동성 모터를 제거하는 데 사용됩니다. 이 과정에서 액티브 모터는 MT를 결합해제하고 용액에 남아 있는 반면, 타이트 바인딩 모터는 MT 펠릿에서 스핀다운됩니다. 이를 통해 섀시에 있는 모든 모터가 활성 집단에서 온 것을 확인할 수 있습니다.

다양한 DNA 종이 접기 구조가 세포골격 모터 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 앙상블 수송의 기계론적인 이해가 증가함에 따라, 실험에서 채택된 DNA 종이 접기 구조물은 복잡성에서 증가했습니다. 원칙적으로, 모든 구조는 모터 및 형광단에 대한 단일 가닥 DNA 부착 부위를 포함하도록 변형되는 경우 이러한 목적을 위해 적응될 수 있다. 특정 섀시 설계 및 특성은 모터 앙상블의 긴급 한 동작에 대 한 특정 질문을 검색하는 데 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 단단한 막대는 카피 수가 다인과 키네신7,15,18및 2D 플랫폼의 팀에 의한 수송에 미치는 영향에 대한 기초 지식을 개발하는 데 사용되어 미오신 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 액틴 네트워크22의네비게이션 . 가변 또는 튜닝 가능한 유연성을 가진 구조는 모터 간의 탄성 결합의 역할을 이해하고 스테핑 동기화가 운동성8,24에미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. 최근에는 구형 구조가 모터 트랙 바인딩에 대한 기하학적 제약조건이 운동성25의역학에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되고 있습니다.

이 프로토콜에서는 가변 강성을 가진 분할된 섀시에 대한 앙상블 실험을 위한 특정 단계를 제공합니다. 섀시에 바인딩 사이트는 때때로 "핸들"이라고, 이러한 핸들을 바인딩 하는 상보적인 DNA 서열 은 "안티 핸들"이라고 합니다. 이 섀시에 있는 모터의 수는 올리고 라벨이 부착된 모터의 안티핸들 올리고에 대한 상보성을 갖춘 확장된 핸들 스테이플을 포함하는 세그먼트에 의해 결정됩니다. 서로 다른 세그먼트에서 서로 다른 핸들 시퀀스를 사용하면 섀시에서 특정 위치에 다양한 유형의 모터를 바인딩할 수 있습니다. 여기에 상세한 섀시는 7 개의 순차적 강성 세그먼트로 구성되며, 각각 2 개의 동심원8에배치 된 12 개의 이중 가닥 DNA 나선으로 구성됩니다. 단단한 세그먼트는 모터 손잡이를 포함하고 "링커" 스테이플의 부재 또는 존재에 따라 유연한 단일 가닥 DNA 또는 단단한 이중 가닥 DNA일 수 있는 지구를 통해 연결됩니다. 섀시 구조의 준수는 이러한 "링커" 스테이플의 유무에 의해 결정됩니다. 자세한 내용 및 특정 DNA서열8에대한 이전 보고서를 참조하십시오. 또한, 여러 가지 방법을 사용하여섀시(26)를정화할 수 있다. 속도-글리세롤 그라데이션 원심분리방법(27)은 여기에 기재되어 있다.

프로토콜

1. 갈락토제 유도 프로모터에 의해 조절되는 모터 단백질의 성장, 발현 및 수확

  1. 효모-펩톤-덱스트로스(YPD) 배양 플레이트 및 멸균 접종 스틱을 사용하여, 30°C에서 3-4일 동안 냉동 효모 균주를 원하고 배양하였다.
  2. 배양 1일차: 오후에 10 mL의 YP 배양 배지를 1" 직경의 유리 배양튜브에 2% 덱스트로스를 넣고 플레이트에서 단일 콜로니로 접종합니다. 밤새 30°C에서 빠르게 회전하는 롤러 드럼에서 성장한다.
  3. 2일차: 오후에 10 mL의 배양액을 2% 라피노스와 함께 YP 배양 배지 50mL를 함유한 250 mL 플라스크로 옮김을 전송합니다. 궤도 셰이커에서 250 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 밤새 배양합니다.
  4. 3일째: 오후에, 60 mL의 배양액을 2% 갈라크토제와 함께 YP 배양 배지 1L를 함유한 3L 플라스크로 옮니다. 궤도 셰이커에서 250 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 밤새 배양합니다.
  5. 4일차: 오전 중반부터 배양물의 광학 밀도(OD)를 2시간마다 600 nm에서 모니터링합니다. 배양이 OD 1.5와 2 사이일 때, 세포를 수확하기 위하여 다음 단계를 계속합니다. 이 OD 범위 밖에서 수확하면 OD 1.5 이전의 낮은 세포 수, 또는 OD 2 이상의 세포 정지 및 단백질 분해로 인해 수율이 감소할 수 있습니다.
  6. 세포 배양을 원심분리기 병으로 데앙하고 4°C에서 ~6200 x g에서 8분 간 회전시키고, 상류물을 부어 버린다.
  7. 이중 증류 H2O (ddH2O)로 병에 있는 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
  8. 4 °C에서 ~ 6200 x g에서 세포를 8 분 동안 돌립니다.
  9. 셀 펠릿의 점도에 따라 최대 2 mL의 ddH2O를 추가하여 파이펫팅에 충분한 용액 유체를 만듭니다.
  10. 10mL 파이펫이 장착된 전동 파이펫 컨트롤러를 사용하여 셀 슬러리를 한 번에 한 방울씩 액체 질소로 천천히 분배합니다. 이것은 효모 세포의 냉동 펠릿을 생성합니다.
  11. 냉동 된 세포를 -80 °C에서 정화 할 준비가 될 때까지 보관하십시오.

2. 효모 세포에서 모터 단백질의 정화

  1. 세포 용해 및 수용성 단백질 추출
    1. 순수 에탄올에 0.1 M PMSF의 신선한 용액 1 mL을 준비합니다. PMSF를 수성 버퍼에 추가할 때까지 기다렸다. 또한 20분 이내(물에 있는 PMSF의 대략적인 반감기)까지 물에 노출되지 않도록 하십시오.
    2. 용해 완충액의 5x 스톡에서 보충제로 얼음에 4x 용해 완충액 50 mL을 준비하지만, 완충제가 효모 펠릿에 적용되기 직전까지 PMSF를 추가하지 마십시오.
    3. 액체 질소 냉동 효모 펠릿을 액체 질소로 미리 냉각시킨 블레이드 형 커피 분쇄기로 미세 한 분말로 분쇄하십시오.
      참고: 이 단백질 추출은 일반적으로 효모 배양 2L에서 수확한 세포 펠릿으로 시작됩니다. 효모 배양의 시작 량은 아래 단계 2.2.2 및 2.3.1단계에서 IgG 비구슬 및 DNA 올리고의 양에 상응하는 조정으로 위 또는 아래로 조정할 수 있습니다.
    4. 얼음에 DTT 및 Mg-ATP와 4x 용해 완충액의 Aliquot 15 mL 및 2 mM의 최종 농도를 달성하기 위해 버퍼에 PMSF를 추가, 보충제와 4 x 용해 완충제의 준비를 완료.
    5. 효모 분말을 미리 냉장된 ~ 100 mL 유리 비커에 얼음에 넣습니다. 버퍼의 최종 농도가 1x를 초과하지 않도록 분말에 보충제와 함께 4x 용해 완충액의 작은 볼륨을 추가합니다. 일반적으로 효모 분말 10 mL마다 완충제의 ~ 1.5 mL를 추가하십시오.
    6. 비커를 주걱을 이용하여 일정한 교반과 함께 37°C 수조에 배치하여 분말을 액체 상으로 빠르게 해동시.
    7. 해동 직후 얼음에 용해의 비커를 놓고, 50 mL 원추형 튜브를 사용하여 용해 부피를 추정하고, 버퍼의 최종 농도가 ~ 1x가 되도록 보충제로 4배 더 용해 버퍼를 추가합니다. 전형적으로, 효모 배양2L은 1x 용해 완충액을 함유하는 용해액의 총 25-35 mL을 산출한다.
    8. 얼음에 원심 분리기에 매해 를 고르게 분배합니다. 각 병이 병 붕괴를 방지하는 데 필요한 최소 부피 이상인지 확인하여 각 병마다 0.01g 이하의 질량 차이로 조심스럽게 균형을 맞추도록 합니다. ~ 290,000 x g에서 4 °C에서 25 분 동안 원심 분리기.
    9. 얼음에 50 mL 원엽 튜브에 수용성 단백질을 포함하는 상급물질을 수집하고 세포 파편과 큰 세포기관을 포함하는 펠릿을 버립니다. 후속 단계에서 사용되는 중력 흐름 열을 막을 수 있기 때문에 상층부의 흐린 부분을 수집하지 마십시오. SDS-PAGE 분석을 위해 상급물의 10 μL을 절약하십시오.
  2. IgG 친화성 정제
    1. 위의 스핀 동안 얼음이나 차가운 방에 중력 흐름 크로마토그래피 컬럼을 설정합니다.
    2. 200 μL의 50% IgG 친화성 비드 슬러리를 면도날로 절단된 P-1000 파이펫 팁컷을 이용하여 컬럼에 전달하여 진입 포트의 직경을 확대한다. 세포 배양 펠릿의 2L 이하를 정화하는 경우, 비드 슬러리의 부피를 100 μL의 최소 부피로 비례하여 조정한다.
    3. Aliquot DTT 및 Mg-ATP를 가진 4x 용해 완충액의 또 다른 15 mL및 2mM의 최종 농도를 달성하기 위하여 완충액에 PMSF를 추가합니다. ddH2O를 추가하여 얼음에 4x 버퍼를 1x로 희석합니다.
    4. 보충제로 1x 용해 완충액 5 mL로 구슬 2x를 씻으소서.
    5. 보충제로 1x 용해 완충액의 200 μL에서 구슬을 다시 중단하십시오.
    6. 원심분리에서 얻은 단백질 추출물에 비드 현탁액을 넣고 부드러운 회전으로 1 시간 동안 4 °C에서 혼합물을 배양합니다.
    7. 인큐베이션 동안, 얼음 위에 세척 완충제 25 mL(표 1에상세히 기미된 레시피)을 얼음 위에 준비하고, 50 mL의 TEV 버퍼(표 1에상세히 기이한 레시피)를 얼음 위에 준비한다.
    8. 1 시간 배양 후, 위의 단계 2.2.2에서 사용되는 동일한 크로마토그래피 컬럼을 통해 얼음 또는 차가운 방에서 용해 비드 혼합물을 걸러. SDS-PAGE 분석을 위해 유동 관통의 10μL을 절약합니다.
    9. 나머지 모터 바인딩 구슬을 5 mL의 세척 버퍼로 얼음 2x에 씻으소서. SDS-PAGE 분석을 위해 첫 번째 세척시 10 μL을 절약하십시오.
    10. 1x TEV 버퍼의 5 mL로 얼음에 구슬을 한 번 씻으소서. 버퍼가 열에서 완전히 드레인되도록 합니다.
  3. DNA 올리고뉴클레오티드 및 TEV 분열로 라벨링
    1. 설정에서 크로마토그래피 컬럼을 제거하고 열의 맨 아래쪽을 덮습니다. 동일한 컬럼 내에서, 10-15분 동안 실온(RT)에서 정제된 BG-올리고의 10-20 μM을 함유하는 1x TEV 완충제의 100 μL로 모터 비드를 배양한다. 세포 배양 펠릿의 2L 이상을 정제하는 경우, 1x TEV 완충액의 부피를 비례적으로 정제하고 정제된 BG-올리고스를 조절한다. 모터 라벨링의 수율과 속도를 높이기 위해 필요한 경우 제조업체의 지침에 따라 배양 시간을 늘리지만, 인큐베이션 시간이 길수록 RT에서 단백질 변성으로 인한 기능 장애 모터의 비율이 증가할 수 있다는 점에 유의하십시오.
    2. 인큐베이션의 매 분마다 구슬을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
    3. 이전과 동일한 크로마토그래피 컬럼 및 설정을 사용하여 라벨이 부착된 모터 비드4x를 1x TEV 버퍼의 4mL로 세척합니다. 마지막 세척이 컬럼에서 완전히 배출되도록 합니다.
    4. 컬럼 의 바닥을 캡하고, 1x TEV 버퍼의 200 μL 이하의 모터 비드를 다시 중단하고, 2 mL 둥근 바닥 미세 원심 분리튜브로 옮김.
    5. 16°C에서 모터 비드 혼합물의 μL당 ~0.3 단위의 TEV 프로테아제로 현탁액을 1시간 동안 부드럽게 회전시킵니다. 튜브는 비드가 접촉하는 튜브의 전체 표면적을 최소화할 수 있도록 장착되어야 한다.
    6. 튜브를 21,130 x g에서 21,130 x g의 미세 원심분리기로 차가운 방에서 30초 동안 튜브의 바닥에 혼합물을 농축한다.
    7. 여전히 차가운 방에서, 절단 P-1000 파이펫 팁을 사용하여 30 s에 대한 21,130 x g에서 스핀 컬럼과 원심 분리기에 혼합물을 전송합니다. TEV 프로테아제는 모터뿐만 아니라 여과액에 있을 것입니다.
    8. SDS-PAGE 분석을 위해 여과액 10μL을 절약합니다. 나머지 여과액은 TIRF 실험에 대해 2 μL의 부피 또는 미세소관 친화도 정제를 위한 50 μL의 부피이다. 플래시는 액체 질소에 aliquots를 동결하고 -80 °C에서 저장합니다.
    9. SDS-PAGE 분석을 위해 필터에 남아 있는 비드를 1x TEV 버퍼로 다시 일시 중단합니다. 위의 2.3.4 단계와 동일한 볼륨의 1x TEV 버퍼를 사용합니다.

3. 미세 소관 (MT) 중합

  1. TIRF 어설보를 위한 tubulin 혼합물의 준비
    1. 차가운 방에서, 각 유형의 호우필화 된 tubulin (라벨이 없는 소 tubulin, 생체 구성 된 tubulin 및 형광 관)을 재구성 완충제 (표 2에자세히 설명 된 조리법)에 별도로 용해하여 10 mg / mL의 최종 농도를 만듭니다. 10 분 동안 얼음에 앉아 보자.
      1. 다음 구성 요소를 혼합하고 차가운 방에서 10 분 동안 얼음에 앉아 (최종 농도는 괄호로 표시됩니다): 소 tubulin의 18 μL (~ 8.2 mg / mL), 생물 질화 된 tubulin의 2 μL (~ 0.9 mg / mL), 그리고 형광 tubulin의 2 μL (0.9 mg / mL).
    2. 튜불린 혼합물의 3 μL aliquots를 준비하고 액체 질소에서 플래시 동결. 혼합물을 -80 °C에 보관하십시오.
  2. MT 친화성 정제를 위한 튜불린 준비
    1. 차가운 방에서, 10 mg/mL의 최종 농도를 만들기 위해 재구성 버퍼에 동호약소 tubulin을 용해. 10 분 동안 얼음에 앉아 보자.
    2. 튜불린 혼합물의 3 μL aliquots를 준비하고 액체 질소에서 플래시 동결. 혼합물을 -80 °C에 보관하십시오.
  3. TTs로 tubulin의 중합
    1. -80°C 냉동고에서 3 μL의 튜불린을 제거하고 튜브의 바닥을 잡고 액체 상으로 매우 신속하고 간략하게 해동한다. 즉시 얼음 위에 놓고 적어도 3 분 동안 배양하십시오.
    2. 2x 중합 믹스의 3 μL을 부드럽게 층 (표 2에상세히 설명된 레시피)를 튜불린 용액 위에 얹어. 튜브를 가볍게 가볍게 두드려 혼합하지만 전단력이 MT 핵 형성과 신장을 방해할 수 있기 때문에 파이펫팅으로 혼합하지 마십시오.
    3. 혼합물을 37°C에서 수조에서 30분 동안 배양한다.
    4. RT 1x BRB80의 6 μL을 보충제(표 2에자세히 설명된 레시피)와 함께 부드럽게 겹쳐서 가볍게 섞어 주세요. 파이펫팅으로 섞지 마십시오.
    5. 혼합물을 37°C에서 적어도 10분 동안 배양한다.
    6. MT 친화도 정제를 진행하거나, TIRF 검정을 수행하는 경우, RT에서 밤새 어둠 속에서 MT를 배양하여 더 긴 MT를 형성한다.
    7. RT에서 어둠 속에서 몇 주 동안 중합 된 MT를 저장하십시오.

4. 미세 소관 (MT) 친화도 정화

  1. 원심분리에 의한 중합되지 않은 튜불린 제거
    1. 60% 글리세롤 쿠션을 만들기 위해 다음 성분을 혼합합니다: 1x BRB80 (보충제 제외; 표 2에자세히 설명된 레시피), 20 μM 탁솔(DMSO에 용해), 1 mM DTT 및 60% 글리세롤.
    2. 글리세롤 쿠션 60 μL을 초원심지 튜브로 옮김. 이전에 중합된 라벨이 부착되지 않은 MT의 12 μL을 쿠션 위에 부드럽게 겹쳐 서 다릅니다. MT의 전단을 방지하려면 절단 파이펫 팁을 사용하여 전송하십시오.
    3. 혼합물을 ~97,300 x g에서 22°C에서 15분 동안 원심분리한다. 스핀 후, 과잉 tubulins는 상단 액체 층에 남아, MTs는 하단에 펠릿을 형성하는 동안. 펠릿이 육안으로 보이지 않을 수 있기 때문에 펠릿을 찾을 수 있도록 스핀 전에 튜브의 바깥 쪽 가장자리를 표시합니다.
    4. 글리세롤 쿠션 위의 액체 층(~12 μL)을 조심스럽게 제거하고 SDS-PAGE 분석을 위해 10 μL을 절약하십시오.
    5. 보충제로 20 μL의 1x BRB80으로 액체 층과 쿠션 사이의 계면을 부드럽게 헹구십시오. 20 μL 헹죄를 제거하고 폐기하십시오.
    6. 글리세롤 쿠션(~60 μL)을 조심스럽게 제거하고 SDS-PAGE 분석을 위해 10 μL을 절약하십시오. MT 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    7. 보충제 (표 2에자세히 설명된 레시피)로 60 μL의 BRB80으로 펠릿을 부드럽게 헹굽니다. MT 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 헹위된 용액을 버리십시오.
    8. 절단 피펫 팁을 사용하여 탁솔 보충 용해 완충제(표 3에상세히 설명된 레시피)의 24 μL에서 MT 펠릿을 다시 중단시켰다.
  2. MT 기반 친화도 크로마토그래피에 의한 기능성 모터 의 정화
    1. -80C 냉동고에서 효모에서 정제된 모터의 50 μL aliquots 두 개를 제거하고 액체 상으로 빠르게 해동합니다. 즉시 얼음 위에 놓습니다.
    2. 표시된 순서로 새로운 초원심분리관에 다음 성분을 추가하고 10분 동안 RT에서 혼합물을 배양합니다: (1) 효모에서 정제된 모터의 100 μL, (2) 5x ATP/Taxol 믹스의 29 μL (표 3에상세히 설명된 레시피), (3) 정제된 MTs 트란의 12 μL 컷 피펫 팁으로 스페리.
    3. 혼합물을 ~97,300 x g 및 22°C에서 15분 동안 원심분리한다. 스핀 후 기능성 모터는 상류에 남아 있고, MT는 펠릿을 형성하고, 그(것)들에 묶인 비기능성 모터는 함께.
    4. 상류를 수집하고, 2 μL aliquots에서 플래시 동결을 수집하고, -80°C에서 저장한다.
    5. SDS-PAGE 분석을 위해 상급물의 10 μL을 절약하십시오. SDS-PAGE 분석을 위해 1x BRB80의 141 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 액틴과 같은 단백질 표준을 사용하여 정제된 모터의 농도를 정량화하기 위한 표준 곡선을 이전에 상세히17로만듭니다.
    6. 6.1.3단계에서 모터를 섀시에 컨쥬게이션할 때 이 농도 정보를 사용하십시오.

5. 분할 된 DNA 종이 접기 섀시 생산

  1. 섀시 형성
    1. 트리스 버퍼에서 250 μM에서 젖은 96개의 웰 플레이트에서 이전에 게시된 표8에 나열된 스테이플 올리고뉴클레오티드를 주문하거나 건조한 다음 Tris 버퍼로 250 μM으로 다시 일시 중단합니다.
    2. 각 코어 스테이플의 5 μL을 혼합하여 코어 스테이플 풀을 만듭니다(드릴러-콜란젤로 20168의S1 표 참조).
    3. 각 링커 스테이플의 5 μL을 혼합하여 링커 스테이플 풀을 만듭니다(드릴러-콜란젤로 20168의링커 스테이플 테이블 참조).
    4. 각 형광포피 핸들 스테이플의 5 μL을 혼합하여 형광결합 스테이플의 풀을 만듭니다(드릴러-콜란젤로 20168의형광단 핸들 테이블 참조).
    5. 다음 구성 요소와 50 μL 접이식 반응을 혼합 : 1x 접이식 버퍼; 100 nM 8064 스캐폴드; 600 nM 코어 스테이플 풀; 600 nM 플루오로포어 스테이플 풀; 9 μM 플루오로포어 가닥 (드릴러 콜란젤로 20168에서형광 방지 핸들 테이블 참조); 각 모터 바인딩 사이트에 대해, 4.2 μM 확장 핸들 가닥 또는 원하는 대로 핸들없이 600 nM 가닥 (드릴러 콜란젤로 20168의모터 핸들 / 안티 핸들 스테이플 테이블 참조); 원하는 대로 600 nM 링커8; 추가 6 mM MgCl2; 및 물.
    6. 다음 프로그램을 사용하여 열 사이클러에 접어 : 80 °C로 급속 가열, 75 분 이상 65 °C로 단일 도 증분으로 냉각 한 다음 17.5 h이상 30 °C로 단일 도 증분으로 추가 냉각.
    7. 분석 은 0.5 x TBE 버퍼에서 2 % 아가로즈 젤에 접는 품질 (레시피는 표 4 참조) 11 mM MgCl2 및 DNA 젤 얼룩으로 보충 (재료 표참조). 0.5x TBE 버퍼에서 11 mM MgCl2를 70 V에서 60-90 분 동안 보충 한 젤을 실행하십시오.
    8. 5.1.7단계에서 사용된 DNA 겔 얼룩에 적합한 조건을 이용하여 겔을 이미지화한다.
  2. 섀시 정화
    1. 정화 전날 늦은 오후에, 원심분리관에서 1회 종이접기 접이식 버퍼에 각각 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 글리세롤을 부드럽게 겹쳐서 글리세롤 그라데이션을 만듭니다(레시피는 표 4 참조). 레이어 사이의 경계는 약간 표시되어야 합니다.
    2. 밤새 4°C에서 배양 구배를 배양한다.
    3. 다음 다음날 아침, 접힌 섀시 용액에 1회 종이 접기 접이식 버퍼에 45% 글리세롤을 넣고 10% 글리세롤의 최종 농도를 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 원심 분리튜브의 그라데이션 상단에 층.
    4. 4 °C에서 130 분 동안 243,000 x g에서 섀시로 그라데이션을 회전시면 됩니다.
    5. 튜브에서 위에서 아래로 50 μL 분획을 모읍시다.
    6. 0.5x TBE 버퍼에 2% 아가로즈 겔을 11 mM MgCl2 및 DNA 겔 얼룩으로 보충시켰다.
    7. 젤에 각 분획의 5 μL을 로드하고 0.5x TBE 버퍼에 젤을 0.5x TBE 버퍼로 보충하여 얼음 수조 또는 차가운 방에서 70 V. Run 젤에서 90-120 분 동안 11 mM MgCl2를 보충하여 과도한 가열 및 섀시 구조의 후속 변성방지를 방지합니다.
    8. 5.2.6단계에서 사용된 DNA 겔 얼룩에 적합한 조건을 이용하여 겔을 이미지화한다.
    9. 통합되지 않은 스테이플이 없는 잘 접힌 단조로운 구조를 나타내는 향후 실험에 대한 분수를 선택합니다.
    10. 260 nm에서 의 UV 흡수와 같은 적절한 분광 방법을 사용하여 선택한 분획의 정량화 농도. 6.1.3단계에서 모터를 섀시에 컨쥬게이션할 때 이 농도 정보를 사용하십시오.

6. 슬라이드 분석 챔버 만들기

  1. 유리 슬라이드에 양면 테이프의 두 스트립을 부착하고 상단에 커버 슬립을 배치하여 슬라이드 분석 챔버를 확인합니다. 챔버는 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이에 끼여 좁은 공간이며, 테이프의 두 스트립에 의해 측면. 도 1은 분석 챔버를 도시한다.
  2. 용액으로 슬라이드를 준비할 때 파이펫을 사용하여 유체를 한쪽에서 챔버로 흐르고 필터 용지 스트립을 사용하여 다른 쪽의 유체 흐름을 수집합니다.

7. 모터 앙상블 운동성 TIRF 분석

  1. DNA 섀시로 모터의 컨쥬게이션
    1. 얼음에, 신선한 준비 1 mL DTT 보충 BRB80, 탁솔 보충 용해 버퍼, 그리고 카제인- 탁솔 보충 용해 버퍼 (표 5에자세히 설명 된 조리법). 각 완충제의 200 μL을 RT 튜브로 옮김.
    2. 여전히 얼음 위에, 차가운 카제인-탁솔 보충 용해 완충제를 사용하여 4x 에너지와 4x 스캐빈저 믹스를 제조합니다(표 5에자세히 설명된 레시피).
    3. ~ 300 nM 정제 모터의 10 μL을 15-30 분 동안 얼음에 ~ 10 nM DNA 섀시 5 μL로 인큐베이션합니다. 이러한 모터 농도는 이 배양 시간 동안 섀시의 모터 결합 부위를 포화하는 것으로 나타났습니다.
      참고 : 모터 점유율은 100 %가 아니며 개별 섀시 구조8,28에서스토스형 손잡이 가 결여되어 있기 때문일 수 있습니다.
    4. 인큐베이션 동안, 비오틴-플루오로포콜-라벨링된 MTs 100x를 RT 탁솔 보충 용해 완충액으로 희석하고, 아래 설명된 절차에 따라 크기 배제 컬럼 크로마토그래피에 적합한 겔 여과 수지를 준비한다.
  2. 크기 배제 컬럼 크로마토그래피에 의한 모터 섀시 접합체에서 과잉 모터 제거
    1. 50 mL 원엽 튜브에서, ddH2O의 45 mL로 겔 여과 수지 2x의 5 mL를 세척한다. 각 세척에 대해, 원원튜브에 있는 물과 수지와 혼합하고, 혼합물을 460 x g에서 1분 동안 돌린다.
    2. 상기와 동일한 방법을 사용하여 수지 2x를 1x 용해 완충제(표 5에상세히 기술된 레시피)의 45 mL로 세척한다.
    3. 세척된 수지를 1:1 비율로 1:1 비율로 세척된 수지를 다시 일시 중단하여 수지가 ~50% 슬러리가 되도록 완충한다. 세척된 수지는 적어도 1개월 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
    4. 수지 현탁액의 800 μL을 스핀 컬럼으로 옮김. 5 분 동안 중력 흐름에 의해 초과 버퍼를 배출. 1,000 x g에서2 s 스핀으로 나머지 버퍼를 제거합니다. 최종 수지 부피는 약 350-400 μL이어야 한다.
    5. 카제인-탁솔 보충 용해 완충액과 모터 섀시 믹스를 50 μL의 최종 부피로 희석합니다.
    6. 6s에 대해 1,000 x g의 스핀 컬럼을 원심 분리합니다(이번에는 가속 및 감속 시간을 포함함). 여과물을 저장하여 순수 모터 섀시 접합체를 수집하고 여분의 모터를 유지하는 컬럼을 버립니다.
  3. 이미징용 슬라이드 준비
    1. 13 μL의 1 mg/mL 의 생체측 생물학적 소 혈청 알부민(비오틴-BSA)을 슬라이드 분석 챔버내로 유입시켰다. BSA를 유리에 결합할 수 있도록 2분 동안 배양합니다.
    2. RT DTT 보충 BRB80의 20 μL로 챔버를 2x 세척하여 챔버의 한쪽에 완충액을 흐르고 여과지 스트립을 사용하여 다른 쪽에서 여분의 유체를 배출합니다.
    3. 0.5 mg/mL 스트렙타비딘의 20 μL의 흐름. BSA상에서 비오틴에 스트렙타비딘의 결합을 허용하기 위해 2분 동안 배양한다.
    4. RT 탁솔 보충 용해 완충액의 20 μL로 챔버를 2x 세척합니다.
    5. 절단 피펫 팁으로 희석 된 MTs의 20 μL에서 부드럽게 흐릅니다. 2 분 동안 배양하여 MTs와 스트렙타비딘에 있는 비오틴 사이에 결합을 허용합니다.
    6. RT 카제인-탁솔 보충 용해 완충액의 20 μL로 2x 세척하십시오. 카제인이 전체 챔버에 침투 할 수 있도록 2 분 동안 배양.
    7. 차가운 카제인-탁솔 보충 용해 완충액으로 정제된 모터 섀시 접합체를 단일 분자 조건(~10-100 pM)으로 5x 에서 10x로 희석합니다. 모터 섀시 희석의 10 μL, 4x 에너지 믹스의 5 μL, 4x 스캐빈저 믹스의 5 μL : 최종 모터 섀시 혼합물을 생산하기 위해 다음 구성 요소를 함께 혼합합니다.
    8. 최종 모터 섀시 혼합물의 20 μL에서 분석 슬라이드 챔버로 흐르고 TIRF 현미경 으로 진행한다.
  4. 이미징 및 데이터 수집
    1. TIRF 현미경으로 슬라이드를 즉시 이미지화합니다. 일반적으로 각 슬라이드는 30~60분 동안 사용할 수 있습니다.
    2. MT 채널에서 스틸 이미지와 섀시 채널의 영화를 수집합니다. 이 프로토콜의 모터의 경우 프레임 속도가 0.5fps이고 노출 시간이 200ms인 10분 동영상이 적합합니다.
    3. 섀시 동영상에서, ImageJ 또는 유사한 이미지 프로세싱소프트웨어(29)의각 MT에 대해 하나의 키모그래피를 생성한다. 모터 섀시 앙상블의 속도 및 주행 길이를기모그래피(30)에서주행의 경사및 수평 거리를 측정하여 분석한다.

결과

모터와 섀시 구조의 성공적인 정제는 겔 전기 동거의 분석되었다. SDS-PAGE 분석은 효모로부터다인의 성공적인 추출을확인(도 2)2.3.7단계에서 수집된 최종 여과액은 ~350 kDa의 위치에서 명확하고 날카로운 대역을 나타내보였다. 예상대로, 이 다인 밴드는 원치 않는 단백질을 제거하는 흐름과 세척에서 결석하고, 다인이 갈라진 구슬. 관측은 IgG 친화성 정...

토론

DNA 종이 접기의 분자 구성 기술은 정의 된 아키텍처, 모터 번호 및 유형으로 모터 앙상블을 구성하는 독특한 방법을 제공하여 특정 모터 구성31에서출현 하는 행동이 어떻게 발생하는지에 대한 연구를 가능하게합니다. 구조 및 세포 연구가 팀에서 작동하는 세포골격 모터의 예를 계속 해명함에 따라 앙상블에서 모터의 생물 물리학 및 생화학 적 메커니즘을 격리하고 조사하는 기...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

우리는 분할 된 DNA 종이 접기 섀시의 기술에 기여 K. 차우, J. 모건, A. 드릴러 - 콜란젤로 감사합니다. 우리는 또한 이러한 기술의 원래 개발에 도움이 토론과 기여에 대한 렉 피터슨과 시 연구소의 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 J. Wopereis와 현미경 검사법 및 화상 진찰을 위한 스미스 대학 센터 및 L. Bierwert 및 분자 생물학을 위한 스미스 대학 센터를 감사합니다. 우리는 TIRF 현미경의 취득을 위한 NSF MRI 프로그램을 감사하게 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
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Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

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