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요약

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

초록

3차원 스페로이드 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 생체의 세포 미세 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 세포 실험에서 더 유용한 결과를 얻을 수 있다. 이 연구에서는 높은 원심력을 구현하는 3차원(3D) 세포 스페로이드를 만들기 위해 원심 미세유체 기반 스페로이드(CMS) 배양 시스템이라고 하는 전기 모터 구동 실험실 온 어 CD(소형 디스크) 플랫폼을 제작했습니다. 이 장치는 회전 속도가 다양하여 1 x g에서 521 x g까지의 중력 조건을 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 직경이 6cm이며, 100 400 μm 마이크로웰을 가지고 있으며, 컴퓨터 수치 제어 기계에 의해 미리 만들어진 폴리 카보네이트 금형에서 폴리 디메틸 실록산으로 성형하여 만들어집니다. CMS 시스템의 채널 입구의 장벽은 원심력을 사용하여 칩 내부에 세포를 고르게 퍼질 수 있습니다. 채널의 끝에는 세포가 마이크로웰에 들어갈 수 있는 슬라이드 영역이 있습니다. 시연으로, 스페로이드는 시스템을 사용하여 높은 중력 조건 하에서 인간 지방 유래 줄기 세포 및 인간 폐 섬유아세포의 단일 배양 및 공동 배양에 의해 생성되었다. CMS 시스템은 동심, 야누스 및 샌드위치의 다양한 구조의 공동 배양 스페로이드를 생산하기 위해 간단한 작업 방식을 사용했습니다. CMS 시스템은 단일 또는 다중 세포 유형의 스페로이드 및 오르가노이드 배양을 필요로 하는 세포 생물학 및 조직 공학 연구에서 유용할 것입니다.

서문

2차원(2D) 세포 배양(예: 기존의 페트리 접시 세포 배양)보다 3차원(3D) 스페로이드 세포 배양으로 생체 내 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 생리적으로 현실적인 실험을 생성하는 것이 더 쉽습니다. 결과1. 현재 이용 가능한 스페로이드 형성 방법은 매달려 낙하 기술2,액체 오버레이 기술3,카르복시메틸 셀룰로오스 기술4,자기 힘 기반 미세 유체 기술5,및 의 사용을 포함한다 생물 반응기6. 각 방법은 고유한 이점이 있지만 재현성, 생산성 및 공동 배양 스페로이드 생성의 추가 개선이 필요합니다. 예를 들어, 자기력 기반 미세 유체 기술5는 상대적으로 저렴하지만 살아있는 세포에 대한 강한 자기장의 영향을 신중하게 고려해야합니다. 스페로이드 배양의 이점은, 특히 중간엽 줄기세포 분화 및 증식의 연구에서, 여러 연구에서7,8,9에보고되었다.

또한 실험실에 CD (컴팩트 디스크)로 알려진 원심 미세 유체 시스템은 쉽게 내부 유체를 제어하고 기판의 회전을 악용하는 데 유용하고, 따라서 면역 분석과 같은 생체 의학 응용 프로그램에 활용되고있다10, 생화학적 마커11,핵산 증폭(PCR) 분석법, 자동 혈액 분석 시스템12,올인원 원심 미세유체 장치13. 유체를 제어하는 구동력은 회전에 의해 생성되는 구심력입니다. 또한 이 단일 CD 플랫폼에서 혼합, valving 및 샘플 분할의 여러 기능을 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 전술한 생화학적 분석 방법에 비해, 배양 세포, 특히스페로이드(14)에CD 플랫폼을 적용하는 시험이 적어왔다.

본 연구에서, 우리는 인간 지방 유래 줄기 세포 (hASC) 및 인간 폐 섬유 아세포 (MRC-5)의 단일 배양 또는 공동 배양에 의한 원심 미세 유체 기반 스페로이드 (CMS) 시스템의 성능을 보여줍니다. 이 백서에서는 그룹의 연구 방법론15에대해 자세히 설명합니다. 따라서, 스페로이드 배양 실험실-온-어-CD 플랫폼은 용이하게 재현될 수 있다. CMS 배양 칩, 칩 홀더, DC 모터, 모터 마운트 및 회전 플랫폼을 포함하는 CMS 생성 시스템이 제시된다. 모터 마운트는 아크릴로니트리리 부타디엔 스티렌 (ABS)으로 3D 인쇄됩니다. 칩 홀더와 회전 플랫폼은 PC(폴리카보네이트)로 가공된 CNC(컴퓨터 수치 제어)입니다. 모터의 회전 속도는 펄스 폭 변조에 기초한 PID(비례-적분-유도체) 알고리즘을 인코딩하여 200rpm에서 4,500rpm으로 제어됩니다. 크기는 100mm x 100mm x 150mm이며 무게는 860g으로 취급이 용이합니다. CMS 시스템을 사용하여 스페로이드는 1 x g에서 521 x g까지다양한 중력 조건하에서 생성 될 수 있으므로 고중력하에서 세포 분화 촉진에 대한 연구는 2D 셀16,17에서 3D로 확장 될 수 있습니다. 스페로이드. 다양한 유형의 세포의 동배도 생체 내 환경을 효과적으로 모방하는 핵심 기술이기도합니다(18). CMS 시스템은 다양한 구조 유형(예: 동심, 야누스 및 샌드위치)의 공동 배양 스페로이드뿐만 아니라 단일 배양 스페로이드를 쉽게 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 간단한 스페로이드 연구뿐만 아니라 인간의 장기 구조를 고려하기 위해 3D 오르가노이드 연구에서도 활용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 원심 미세 유체 기반 의 스페로이드 (CMS) 배양 칩 제조

  1. CNC 가공에 의해 CMS 배양 칩의 상부 및 하부 레이어용 PC 금형을 만듭니다. 칩의 자세한 치수는 그림 1에있습니다.
  2. PDMS 베이스와 PDMS 경화제를 10:1(w/w)의 비율로 5분 동안 혼합하고 기포를 제거하기 위해 1시간 동안 건조기안에 놓습니다.
  3. CMS 배양 칩의 금형에 PDMS 혼합물을 부은 후, 기포를 1시간 더 제거하고 80°C에서 2시간 동안 열 챔버에서 경화한다.
  4. 면이 위로 향하도록 표면이 있는 진공 플라즈마 클리너에 놓고 30s용 18W의 힘으로 공기 보조 플라즈마에 노출시십시오.
  5. CMS 배양 칩의 두 층을 결합하고 접착 강도를 높이기 위해 30 분 동안 80 °C의 열 챔버에 놓습니다.
  6. 121°C 및 15psi에서 오토클레이브 소독기에서 CMS 배양 칩을 살균합니다.

2. 세포 준비

  1. 5× 105-1×106 hASCs 또는 MRC-5s 세포를 함유하는 바이알의 1 mL을 36.5°C에서 수조에서 2분 동안 해동한다.
  2. 1 mL의 덜베코 수정 된 독수리 매체 (DMEM)를 바이알에 넣고 1,000 μL 파이펫과 부드럽게 섞습니다.
  3. 36.5°C로 미리 온 DMEM의 15 mL을 파이펫을 사용하여 150 mm 직경의 페트리 접시에 넣고 바이알로부터 세포를 첨가한다.
  4. 1 일 후, DMEM을 흡인하고 신선한 DMEM의 15 mL로 교체합니다. 그 후, 2 일 또는 3 일마다 미디어를 변경합니다.
  5. 페트리 접시에서 세포를 분리하려면, 페트리 접시에 트립신 4 mL을 추가하고 36.5 °C에서 인큐베이터에 놓고 4 분 동안 5 %CO2.

3. 단일 배양 스페로이드 형성

  1. 2.5 mL의 4%(w/v) 플루론성 F-127 용액을 CMS 배양 칩의 입구 구멍에넣고(그림 2A)칩을 500-1,000 rpm에서 회전한 다음 CMS 시스템을 사용하여 3분 동안 4,000 rpm에서 칩을 회전시다(그림2B).
    참고: 플라우론티드 코팅은 칩이 회전하는 동안 입구 포트에 셀 부착을 방지합니다. 공기가 마이크로웰에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.
  2. 5%CO2에서36.5°C에서 밤새 플루론액으로 채워진 CMS 배양 칩을 배양한다.
  3. pluronic 용액을 제거하고, DMEM으로 나머지 pluronic 용액을 씻어 내고, 깨끗한 벤치에서 12 시간 동안 칩을 건조시면됩니다.
  4. CMS 배양 칩에 2.5 mL의 DMEM을 추가하고 칩 내부를 예열하기 위해 3 분 동안 ~ 4,000 rpm에서 칩을 회전시다.
  5. 회전을 멈추고 100 μL의 DMEM을 꺼내 셀 서스펜션을 주입할 공간을 마련합니다.
  6. 5 × 105 hASCs 또는 8 × 105 MRC-5s를 포함하는 셀 서스펜션 100 μL을 파이펫팅하여 재서스펜션을 위해 3-5x를 파이펫팅하여 셀을 균일하게 분배합니다.
  7. 칩을 3,000rpm에서 3분 동안 회전시켜 각 마이크로웰의 세포를 원심력으로 트랩합니다.
    참고: 회전 속도가 과도하면 용액 배출 구멍을 통해 셀이 빠져나갈 수 있습니다.
  8. 36.5°C, >95% 습도, 및 5%CO2에서인큐베이터에서 3일 동안 세포를 배양하고, 1,000-2,000 rpm에서 회전한다. 매일 문화 매체를 변경합니다.

4. 공동 배양 스페로이드 형성

  1. 동심 스페로이드 형성
    1. 첫 번째 셀인 2.5 × 105 hASC를 추가하고 칩을 3,000 rpm에서 회전시다. 3분 후, 두 번째 세포를 4× 105 MRC-5s를 추가하고 3 분 동안 3,000 rpm에서 칩을 회전시고 파이펫팅에 의해 총 100 μL의 셀 현탁액을 주입합니다. 세포가 주입될 때, 회전 속도를 500-1,000 rpm으로 옮기.
    2. 인큐베이터내세포를 36.5°C, >95% 습도%, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 동심 스페로이드는 24 시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.
  2. 야누스 스페로이드 형성
    1. 칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 첫 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액을 2.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.
    2. 칩을 36.5°C, >95% 습도에서, 5%CO2를 3시간 동안 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 배양합니다.
    3. 칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 두 번째 셀 세트인 4 × 105 MRC-5s를 포함하는 셀 현탁액의 100 μL을 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.
    4. 인큐베이터내 세포를 36.5°C, >95% 습도, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 야누스 스페로이드는 24시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.
  3. 샌드위치 스페로이드 형성
    1. 칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 첫 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 1.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.
    2. 칩을 36.5°C, >95% 습도에서, 5%CO2를 3시간 동안 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 배양합니다.
    3. 칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 두 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 3 × 105 MRC-5를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.
    4. 칩을 36.5°C, >95% 습도% 및 5%CO2에서 1,000-2,000 rpm에서 3시간 동안 회전하여 배양합니다.
    5. 칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 세 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 1.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.
    6. 인큐베이터내세포를 36.5°C, >95% 습도%, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 샌드위치 스페로이드는 12 시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.

5. 세포 염색

  1. 세포 형광 염료를 실온 (20 °C)으로 데우다.
  2. 바이알당 무수 디메틸설산화물(DMSO)의 20 μL을 첨가하여 1 mM 용액을 만듭니다.
  3. DMEM을 사용하여 1 μM의 최종 작업 농도로 형광을 희석한다.
  4. 셀 현탁액에 형광을 추가하고 파이펫을 사용하여 부드럽게 다시 중단합니다.
  5. 36.5 °C에서 20 분, 습도 >95 %, 및 5 %CO2에서배양하십시오.

결과

6 cm 직경 CMS 배양칩(도 2)은상기 프로토콜에 따라 성공적으로 이루어졌다. 먼저, 칩을 상부 층 및 하부 층으로부터 별도로 만든 다음 플라즈마 결합에 의해 함께 결합하였다. 생성 된 스페로이드는 칩을 분리하여 쉽게 수집 할 수 있습니다. CMS 배양 칩의 채널은 입구 포트및 중앙, 슬라이드 및 마이크로웰 영역을포함한다(도 3). 세포, 배지 및 플루로닉 솔...

토론

CMS는 모든 주입 된 세포가 폐기물없이 마이크로 웰에 들어가는 폐쇄 시스템으로 기존의 마이크로 웰 기반 스페로이드 생성 방법보다 효율적이고 경제적입니다. CMS 시스템에서, 매 12-24시간마다 칩 내의 매체를 제거하도록 설계된 흡입 구멍을 통해 미디어가 교체된다(도3A). 미디어 흡입 과정에서, 거의 모든 매체는 마이크로웰의 매체와 벽 사이의 표면 장력으로 인해 마이크?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 NRF의 기초 과학 연구 프로그램(2016R1D1A1A1A1B0333418)과 NRF의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램(2018M3A9H1023141)에 의해 지원되었으며, 한국 정부, MSIT의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
3D printerCubicon3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)ATCCPCS-500-011
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDAThermo Fisher ScientificC292510 mM
CellTracker Red CMTPXThermo Fisher ScientificC3455210 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraverRoland DGAEGX-350
DC motorNurielectricity Inc.MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)ATCC30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)ATCC30-2200
Fetal bovine serumATCC30-2020Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)ATCCCCL-171
Inventor 2019Autodesk3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mmJetBiofillCAD010150Surface Treated
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Pluronic F-127Sigma Aldrich11/6/9003Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)AcrylmallAC15PC200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)DowcorningSylgard 184
TrypsinGibco12604021

참고문헌

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  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

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