유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

요약

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

초록

유비퀴틴(ub) 및 유비퀴틴과 같은 (유블) 단백질의 의존적인 번역 후 변형은 단백질 안정성, 활동, 상호 작용 및 세포내 국소화를 조절함으로써 세포 내에서 근본적인 생물학적 조절 역할을 합니다. 그들은 세포가 신호에 응답하고 환경의 변화에 적응할 수 있게 합니다. 이 기계장치 내의 변경은 신경 퇴행성 질병 및 암과 같은 가혹한 병리상황으로 이끌어 낼 수 있습니다. 여기에 설명된 기술의 목적은 배양된 세포주로부터 ub/ubls 종속 PTM 프로파일을 신속하고 정확하게 확립하는 것입니다. 상이한 조건에서 수득된 상이한 프로파일의 비교는 예를 들어 치료에 의해 유도된 것과 같은 특정 변경의 식별을 허용한다. 렌티바이러스 매개 세포 트랜스덕션은 수식어(SUMO1 또는 Nedd8와 같은 유비퀴틴 또는 유블)의 2태그(6His 및 Flag) 버전을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하기 위해 수행된다. 이 꼬리표는 세포에서 유비퀴틴 및 그러므로 유비퀴틴 단백질의 정제를 허용합니다. 이것은 2 단계 정제 과정을 통해 수행됩니다 : 첫 번째는 6His 태그를 사용하여 변성 조건에서 수행되고 두 번째는 플래그 태그를 사용하여 기본 조건에서 수행됩니다. 이것은 이후에 확인되고 액체 크로마토그래피에 의해 반정화되고 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS) 기술에 선행되는 수정된 단백질의 고도로 특이하고 순수한 격리로 이끌어 냅니다. Excel 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터의 쉬운 정보학 분석을 통해 배경 신호를 제거하여 PTM 프로파일을 구축 할 수 있습니다. 이 단면도는 표준 생화학 기술에 의하여 그들의 검증으로 시작하여 그 때 더 구체적으로 공부될 특정 변경을 확인하기 위하여 각 조건 사이 비교됩니다.

서문

여기에서 제안된 방법은 특정 조건 (처리, 분화 등)와 관련되었던 잠재적인 변경을 확인하기 위하여 배양한 포유류 세포에서 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 중재된 PTM을 공부하기 위하여 전념합니다. PTM은 단백질의 기능 조절의 마지막 단계를 나타냅니다^1. 실제로, 일단 번역 기계에 의해 생성된, 대부분의 경우 모든 단백질은 그들의 활동, 분자 상호 작용 및 세포내 위치^1을조절하는 PTM의 다른 종류를 겪는다. PTM의 과다 중에는 단백질의 유비퀴틴 패밀리에 의해 매개되는 것들, 유비퀴틴 자체 및 모든 유비퀴틴-좋아하는 것들, 모든 세포내 또는 부분적으로 세포질 단백질을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고^{있다 2.} 그(것)들은 그들 자신 단백질이기 때문에, 그(것)들은 각각 특정 조절 기능과 관련되었던 다양한 topologies의 균질하고 이질적인 사슬을 형성하는, 서로 공액될 수 있습니다^2. 이 복잡한 기계를 해독하고 이해하려면 도구가 필요합니다. 많은 접근법은 그들의 자신의 장점과 단점을 가지고, 전 세계적으로 개발되었다, 여기에서 우리는 배양 세포에 적합한 고성능 하나를 제안한다.

이 방법의 주요 장점은 정확성입니다. 실제로, 분리된 변형 된 단백질의 순도는 두 개의 태그 (6His 및 Flag)와 두 단계 절차의 조합 사용에 의해 매우 향상되므로 단일 태그 융합 Ub / Ubl^3,4보다훨씬 더 선택적입니다. 6His 태그의 존재는 유비퀴틴 결합 도메인 또는 유비퀴틴 에 결합하는 다른 단백질을 함유하는 단백질의 공동 정제를 피함으로써 완전히 변성 조건에서 정제의 첫 번째 단계를 가능하게 한다. 이는 특정 항체⁵ 또는 탠덤 유비퀴틴 결합 요소(TUBEs)^6을사용하여 유비퀴틴화 된 프로테오옴의 친화도 정제에 기초한 여러 가지 다른 접근법에 의해 발생하는 기술적 문제이다. 중요한 것은, 이 기술은 모노와 다른 종류의 폴리쿼터시네이션이 모두 확인되었기 때문에, 다른 접근법의 경우일 수 있기 때문에, 특정 유형의 유비퀴틴화의 정제에 찬성하여 편향되지 않는다^7. 따라서, 일단 발견되면, 유비퀴틴의 변경은 관련시킨 유비퀴틴의 정확한 종류를 확인하기 위하여 표준 생화확적인 접근에 의해 더 상세한 에서 공부되어야 할 것입니다.

마지막으로, 이 프로토콜의 또 다른 기술적 이점은 렌티바이러스를 사용하여 정상적인 세포 거동을 방해하지 않고 적절한 수준의 태그된 수정자의 발현을 통해 안정적이고 빠르게 세포주를 발현하는 것을 용이하게 생성합니다.

유비퀴틴화의 한 가지 중요한 역할은 프로테아소말 분해를 위한 단백질을 표적으로 하는 것이지만, 이제는 잠재적으로 대부분의 세포내 또는 부분적으로 세포내 단백질에 대한 많은 다른 조절 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다^1. 이 기능의 수는 단백질 같이 많은 유비퀴틴의 존재에 의해 더 증강되고, 거의 모든 세포 기계장치를 통제하는 단백질의 가족을^{형성합니다 1.} 그들의 변경은 세포 생물학에 과감한 영향을 미칠 수 있고 암^9와같은 병리학적인 상황^8을지도하거나 참여할 수 있습니다. 그러므로, 공구는 이 광대한 풍경을 탐구하고 새로운 치료 표적으로 봉사할 수 있는 병리학적인 상태와 관련되었던 변경을 확인하기 위하여 필요합니다.

이 프로토콜은 외인성 태그Ub/Ubl을 표현하기 위해 변환되어야 하기 때문에 배양되는 세포에 전념합니다. 일단 생성되면, 이러한 안정한 세포주는 2D 또는 3D 또는 이종이식에서 배양으로부터 Ubl 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있으며, 따라서 PTM 프로파일을 연구하기 위해 적용될 수 있는 다양한 실험 모델의 지평을 확장할 수 있다.

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프로토콜

1. 6His-Flag-Ubl을 발현하는 안정적인 세포주 생성

참고 : pCCL-6HF-Ubl, pVSVG 및 델타 도우미와 HEK-293T 세포의 공동 변환.

1. 일 0: 종자 293T 세포는 6웰 플레이트에서 50-70% 합류를 다음날 얻었다.
2. 1일차: 50-70% 동시 세포를 pCCL-6HF-Ubl 또는 pCCL-GFP 1 μg, pVSVG 1 μg 및 델타 헬퍼 벡터 1 μg를 혼합하여 렌티바이러스 생산을 위한 트랜스펙션 시약 및 프로토콜을 사용한다. 6시간 의 형질전환 후, 환전될 세포에 해당하는 새로운 배지로 배지를 변경한다. 종자 세포는 다음날 10-20% 합류(형질전환개시일)을 얻기 위해 6웰 플레이트에서 트랜스듀렉될 수 있다.
3. 2일째: 24시간 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 회수하고 0.45 μm 필터를 사용하여 필터를 사용한다. 필요한 경우, 렌티바이러스의 두 번째 배치를 생산하기 위해이 시점에서 신선한 매체를 추가합니다. 렌티바이러스를 함유한 세포(10-20% 합류)를 시차할 세포의 배지를 대체한다.
   참고: 렌티바이러스 배지는 전향 전 며칠 동안 +4°C에서 보관하거나 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 표준 인큐베이터 (37 °C, 5 %_CO2)에서24 시간에서 72 시간 사이의 렌티 바이러스로 세포를 인큐베이션 한 다음 신선한 표준 인큐베이터에 대한 배지를 변경합니다. 가능하면, 반전형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하여 세포 발현률과 세포당 상대적 발현 수준인 형질전환의 효율을 평가합니다. 형광이 검출되지 않으면, 형질전환할 세포 유형에 따라 발현이 더 오래 걸릴 수 있기 때문에 추가로 2-3일을 기다린다.
5. GFP 대조가 양성인 경우, 항기항체를 사용하여 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의한 6HF-Ubl의 발현 조절을 충분히 수행할 때까지 모든 세포를 성장시다.

2. 변형 된 단백질의 이중 정제

참고 : 버퍼 1 : 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/ NaH₂PO_4,pH 8.0, 0.5 % 트리톤 X-100.
버퍼 2 : 50 mM NaH₂PO_4,150 mM NaCl, 1 % Tween20, 5 % 글리세롤, pH 8.0.
버퍼 3: 100 mM NH₄HCO_3,pH 8.0.

1. 세포 용해: 일단 준비되면, 실온(RT)에서 인산완충식염수(PBS)로 배양설을 적어도 한 번 씻고 세포 용해또는 액상_N2에 플래시 동결을 진행하여 -80°C에 보관합니다. 용해의 경우 RT에서 15cm 접시당 2 mL의 버퍼 1을 추가하십시오.
2. 용해를 30초 동안 3회 초음파 처리하여 1분 동안 일시 정지합니다.
3. 15 분 동안 15,000 x g에서 초음파 처리 된 용해기를 원심 분리합니다.
4. 세포 스트레이너 (40 μm)를 사용하여 상구체를 새로운 튜브로 옮김.
5. 샘플의 농도를 결정하고 필요한 경우 동일한 양의 단백질과 동일한 부피를 얻기 위해 조정합니다. 50~100 mg(MiaPaCa-2 세포의 경우 직경 15cm의 10가지 요리)의 총 양의 단백질을 사용하십시오.
6. Ni²⁺-NTA 구슬을 넣고 단백질 1 mg당 2 μL의 구슬을 사용하십시오.
7. RT에서 2.5 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오.
8. 500 x g에서 5 분 동안 구슬을 펠렛하십시오.
9. 버퍼 1의 1 mL로 구슬을 세척하고 샘플을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮은 다음 튜브를 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 합니다. 얼음 이나 4 °C에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.
10. 10 mM imidazole를 함유 한 얼음 차가운 버퍼 2 1 mL로 두 번 씻으하십시오.
11. 결합 된 단백질을 용출하려면 250 mM 이미다졸을 함유 한 완충액 2 600 μL을 추가하고 4 °C에서 2 시간 동안 회전하십시오.
12. 500 x g에서 원심분리하여 1분 동안 구슬을 펠렛.
13. 4°C에서 2.5시간 동안 30rpm에서 회전한 다음 완충2 500 μL로 2회 세척한 다음 버퍼 3의 500 μL로 2회 세척합니다.
14. 최종 용출의 경우, 0.1 μg/μL에서 플래그 펩타이드를 함유한 완충3의 100 μL을 추가하고 1.5시간 동안 4°C에서 회전합니다.
15. 500 x g의 원심분리기를 1분 간, 초자연자를 새로운 사전 냉각 된 튜브로 옮긴다.
16. SDS-PAGE에 10% (10 μL)를 적재하고 젤의 은 염색을 수행하여 정제 품질을 제어합니다. 정제가 양호해 보이는 경우 LC-MS/MS가 남긴 90%를 분석합니다.

3. Ub/Ubls PTM의 프로파일을 생성하고 이들 PTM 간의 중요한 차이점을 식별하기 위한 질량 분석 데이터 처리

참고: MS 분석의 결과는 각 샘플에서 확인된 각 단백질에 대한 피크 면적 값(TOP 3 펩티드 영역^10의평균)뿐만 아니라 총 펩티드 수를 포함한 많은 정보를 포함합니다. 이들 데이터는 펩티드 카운트 수 또는 피크 영역 값, 또는 둘 다를 사용하여 처리될 수 있다. 피크 영역을 사용하여 계산하려면 이러한 값은 일반적으로 10⁶의 범위에 있으므로 아래와 동일한 수식을 적용하기 전에 이 순서로 분할해야 합니다. 두 가지 계수 방법론을 모두 사용하여 얻은 결과는 일반적으로 와 같이 강한 상관 관계를 보여야 합니다. 확인된 각 단백질에 대해 다음 포뮬러를 사용하십시오.
비처리 된 유비퀴틴 샘플에서 v1 펩티드 값 (예를 들어, Ub - 약물)
젬시타빈 처리 된 유비퀴틴 샘플에서 v2 펩티드 값 (예를 들어, Ub + 약물)
비처리 대조군 GFP 샘플에서 k1 펩티드 값(예를 들어, GFP - 약물)
젬시타빈 처리된 대조군 GFP 샘플에서 k2 펩티드 값(예를 들어, GFP + 약물).

1. 정규화: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴과 GFP에 대한 약물 처리 된 세포와 치료되지 않은 세포 사이의 값을 정상화하십시오. 정규화된 v = V 및 정규화된 k = K.
   V1=v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2=v2. (v1+ v2) / (2. v2)
   K1=k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2=k2. (k1+ k2) / (2. k2)
2. 배경 제거: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴 샘플의 값에서 대조군 샘플(GFP)의 값을 빼서 두 조건에서 확인된 각 단백질에 대한 특정 값(V'1 및 V'2)을 얻습니다.
   V'1=V1-K1 경우 V1-K1≥0; V'1=0 경우 V1-K1<0
   V'2=V2-K2 경우 V2-K2≥0; V'2 =0 인 경우 V2-K2<0
3. 유비퀴틴의 변형(Var). 약물에 의해 유도된 PTM의 양성 및 음성 변화에 대한 점수(-100에서 +100 사이)를 얻으려면, 치료된 샘플과 미처리 된 샘플의 특정 값 간의 차이를 포함 하 여 모든 값의 합계로 나누어 다음 공식을 사용 하 여 제어 (또한 제어 GFP에서 확인 된 단백질을 처벌하기 위해), 100곱.
   Var = (V'2-V'1)//(V1+K1+V2+K2)*100; -100-50(PTM의 억압) 이하 또는 50(PTM의 유도) 이하의 변화는 일반적으로 유의한 것으로 간주됩니다.
4. 신뢰 (Conf). 다음 수식을 사용하여 0에서 100% 사이의 신뢰도 값을 얻습니다.
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0의 경우 <0
   50을 초과하는 값은 일반적으로 확신하는 것으로 간주됩니다.
5. 유도/억압 값의 더 좋은 분포를 얻고 변형 및 신뢰도 매개 변수를 모두 고려하려면 다음 공식을 사용하여 Var 및 Conf 값을 곱합니다.
   =SI(V2>0;0;(((V2*C2)^2)//(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
   참고: 피크 면적 값은 일반적으로 펩타이드 계수보다 더 정확하기 때문에, 다음 의 Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)와 같은 데이터의 이러한 종류의 해석에 전념하는 특정 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 사용 권장 사항.

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결과

GFP 및 6HF-Ub 발현 세포를 생성하기 위해 배양 포유류 세포의 전이
나중에 MiaPaCa-2 세포를 변환하는 데 사용될 렌티바이러스를 생산하기 위해, 70% 콘립쿠스 HEK-293T 세포는 pCCL-6HF-유비퀴틴 또는 GFP/델타-도우미/pvSvG의 동일한 양으로 병입된다. 생산의 24 시간 후에, 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배지는 회수되고 여과된다. 이 시점에서 반전된 현미경상에서 293T...

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토론

우리는 주요 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 변형 된 단백질의 프로파일을 생성하는 강력하고 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 실제로, 우리는 성공적으로 유비퀴틴에 의해 PTM의 프로파일을 생성하기 위해이 프로토콜을 적용하고, 또한 SUMO와 Nedd8에 의해, 및 치료와 관련된 변경을^감지하기위해 7 , 특정 유전자의 과잉 발현 또는 녹다운에 대한 응답으로 (데이터는 다양한 화?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag