엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

요약

제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.

초록

장 상피는 병원성 미생물및 독소와 같은 발광 체질이 신체의 나머지 부분으로 들어가는 것을 방지하는 장벽 역할을합니다. 상피 장벽 기능은 장 상피 세포의 무결성을 필요로한다. 상피 세포 증식 장벽을 형성 하는 세포의 지속적인 층을 유지 하는 동안, 상피 손상 장벽 기능 장애에 이르게. 그 결과, 발광 내용물제한없는 통로를 통해 장 장벽을 가로 질러 수 있습니다. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환과 같은 많은 장 질환과 관련이 있습니다. 고립 된 마우스 장 지하실배양 및 창 자-villus 같은 구조로 유지 될 수 있습니다., 장 오르가노이드 또는 "엔터 로이드"라고. 엔터로이드는 시험관 내에서 장 상피 세포의 증식 및 세포 사멸을 연구하는 데 이상적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 배양된 장체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화하는 간단한 방법을 기술한다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 및 프로피듐 요오드화물은 장신구의 증식 및 죽은 세포에 라벨을 붙이기 위해 사용되며, 증식 및 죽은 세포의 비율은 유세포측정에 의해 분석됩니다. 이것은 장 상피 세포 증식 및 세포 생존에 대한 약물 치료의 효과를 테스트하는 유용한 도구입니다.

서문

장 상피 세포의 기본 기능은 병원성 박테리아 및 독소와 같은 발광 내용물의 진입을 보호하는 것입니다^1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해, 장줄기세포는 연속적으로 증식하고, 장세포 및 분비세포를 포함한 다양한 상피세포로 분화하며, 이는 단단한 연결을 형성하여 장벽을 형성한다^3. 장 상피 세포의 급속한 갱신은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸의 엄격한^조정을필요로^4,5. 감소된 세포 증식 또는 과도한 세포 사멸은 상피 손상 및 손상된 장벽 기능^1,6. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환^7,8과관련이 있습니다.

장 내 지하실을 배양하는 방법이 이전에 개발되었습니다. 이 기술을 사용하여, 고립 된 마우스 토굴은 구조와 같은 토굴 - 융모를 가지고 모든 장 상피 세포 계보를 포함하는 장 오르가노이드 (enteroids)로 성장,^10. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)은 세포 증식 중에 복제를 받고 있는 DNA에서 티민(T)을 대체할 수 있는 티미딘 유사체이다. 증식 세포는 EdU 염색에 의해 신속하고 정확하게 표지될 수 있다. 프로피듐 요오드화물 (PI)는 이중 가닥 DNA로 삽입시 붉은 형광을 방출하는 에티듐 브로마이드의 유사체입니다. PI는 손상된 세포막을 통해서만 통과하기 때문에 죽은 세포를 구체적으로 감지합니다.

이 프로토콜에서는 먼저 무린 소장으로부터 토굴을 분리한 다음 시험관내 엔터로이드로 배양하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 EdU 및 PI 통합 및 유세포 분석에 의한 장신구의 증식 및 죽은 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 수코 대학의 케임브리지 수다 게놈 자원 센터 (CAM-SU)의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 장 오르가노이드 분리 및 문화

1. 장 지하실과 장 내 문화의 격리
   1. CO2 흡입으로 8주된 야생형 마우스를 안락사시. 티슈 집게와 미세 홍채 가위를 사용하여 약 8cm의 장틀을 해부하십시오.
   2. 약 40 mL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)와 함께 주입식 바늘을 사용하여 주사기를 사용하여 씻어 낸 다음 가위로 세로로 자르고 장틀을 엽니다.
   3. 작은 (0.5-1.0 cm) 조각으로 장수를 잘라. 멸균 된 얼음 차가운 DPBS 5 mL에 15 mL 원추형 튜브에 넣고 얼음에 5 분 동안 바위를 놓습니다.
   4. 파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 10mL의 콜드 버퍼 1(DPBS의 2mM EDTA)으로 교체합니다. 얼음에 30 분 동안 바위.
   5. 파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 1을 흡인하고 10 mL의 콜드 버퍼 2 (54.9 mM D-소르비톨, DPBS에서 43.4 mM 자당)로 교체하십시오. 손으로 2-3 분 동안 흔들어주세요 (~80 쉐이크 / 분).
   6. 흔들은 후 버퍼 2 내용물의 20 μL 방울을 가지고 현미경으로 검사하십시오.
   7. 70 μm 멸균 셀 스트레이너로 2개의 내용을 필터한 다음 50 mL 원엽 튜브로 여과된 버퍼를 수집합니다.
   8. 파이펫 20 μL의 여과액을 슬라이드 상에 토굴을 계산한다. 1.1.7 단계에서 충분한 양의 버퍼 2를 전송하여 ~ 500 개의 토굴 /well이 있는지 확인하십시오.
   9. 4 °C에서 10 분 동안 150 x g에서 아래로 돌입니다. 회전이 끝나면 상월체를 조심스럽게 흡인하십시오.
   10. 지하실 멤브레인 매트릭스(예: 500개 토굴당)의 50 μL(예: Matrigel)에서 토굴을 일시 중단하고, 파이펫을 위아래로(기포를 피하기 위해 조심하다) 한 웰 플레이트의 중앙에 50 μL 의 액적을 놓습니다. 지하 멤브레인 매트릭스를 중합하기 위해 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   11. 중합 30 분 후, 조심스럽게 미니 구트 매체의 600 μL을 추가 (고급 덜베코의 수정 독수리 매체 [DMEM]/F12, 2 mM L-알라닌 - L-글루타민, 펜 / 스트렙 [100 단위 / mL], 10 mM 헤페, N2 보충 [1:100], B27 보충 [1:50] 표피 성장 인자 [EGF; 50 ng/mL], 노긴 [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], 및 Y27632 [10μM]) 각각의 잘, 다음 Cc에 반환. 매일 현미경으로 관찰하고 2-3 일마다 미디어를 변경하십시오.
2. 엔터로이드 패시징
   참고 : 긴 문화의 경우, 엔터로이드는 거의 매주 분할해야합니다.
   1. 엔터로이드를 통과하려면 조직 배양판을 얼음 위에 놓습니다. 미디어를 흡인하고 각 우물에 1 mL의 차가운 DPBS를 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 위아래로 파이펫을 피펫으로 만드실 수 있습니다.
   2. 1 mL 인슐린 주사기 (27 G)를 통해 15 mL 원엽 튜브로 한 번 위아래로 전달하십시오. 4 °C에서 150 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하십시오.
   3. 파이펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다. 지하 멤브레인 매트릭스/웰의 50 μL에서 다시 일시 중단하십시오.
   4. 37°C 인큐베이터에 플레이트를 30분 동안 놓고 지하 막 매트릭스가 중합되도록 합니다. ENR 용지(미니구트 매, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin)로 각 웰을 오버레이한 다음 플레이트를 인큐베이터로 되감습니다.

2. 엔테로이드에서 EdU 양성 세포의 유동 세포 분석

참고: 그림 1은 엔터노이드에서 EdU 양성 세포의 유세포 분석 워크플로우를 보여줍니다.

1. EdU를 가진 장체의 인큐베이션
   1. 5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.
   2. 대조군(치료되지 않은 엔터노이드) 및 실험군(5 ng/mL 인터류키친 22[IL-22])으로 처리된 엔터노이드)를 설정한다. 각 그룹에 대해 적어도 세 개의 복제를 준비합니다.
   3. ENR 배지에 EdU를 첨가하여 50 μM의 농도로 EdU 배지를 준비시다. 600 μL의 EdU 배지를 각 웰에 넣고 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 EdU 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.
2. 지하 멤브레인 매트릭스에서 엔터로이드 수확
   1. 파이펫 컨트롤러를 사용하여 EdU 매체를 흡인하고 DPBS로 1x를 세척합니다. DPBS 1mL를 추가합니다.
   2. 단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 P1000 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하십시오. 15 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 아래로 돌립니다.
   3. 500 μL의 세포 해리 효소(재료 표)를넣고 37 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. P200 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하여 엔터노이드를 단일 셀로 분해합니다.
   4. 10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 3mL를 추가하고 P1000 파이펫 팁으로 반복적으로 파이펫을 추가합니다.
   5. 300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한 매체를 흡인합니다. DPBS의 1 mL로 셀을 다시 일시 중단합니다.
3. 세포의 고정 및 투과
   1. 셀 서스펜션을 1.5 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.
   2. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 1mL로 세포를 다시 일시 중단하고, 실온(RT)에서 15분 동안 고정하고, 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
   3. 0.5 % 요온 계면 활성제의 1 mL로 세포를 다시 일시 중단하십시오. RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
   4. 300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한을 흡인합니다. DPBS로 1x를 씻고 스핀다운하여 상류를 제거합니다.
4. EdU 검출
   1. 사전에 각 구성 요소에 대한 재고 솔루션을 준비 : 1) 알렉사 플루오 아지드의 작업 솔루션, 2) 1 x EdU 반응 버퍼의 작동 솔루션, 3) EdU 버퍼 첨가제의 10 배 재고 솔루션.
   2. 10x 용액을 탈이온수에서 1:10희석하여 1x EdU 완충첨가제를 준비한다. 이 솔루션을 신선하게 준비합니다.
   3. 표 1에따라 반응 칵테일을 준비한다.
      참고: 표에 나열된 순서대로 재료를 추가합니다. 반작용 칵테일을 준비 후 15분 이내에 사용하십시오.
   4. 각 1.5 mL 튜브에 반응 칵테일 100 μL을 추가합니다. 세포를 다시 일시 중단하고 빛으로부터 보호하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
   5. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 파이펫 팁으로 반응 용액을 부드럽게 흡인합니다.
   6. 각 튜브에 0.5% 난오계면활성제 를 추가하여 RT. Centrifuge에서 1x를 5분 동안 300 x g로 세척하고, 피펫 팁으로 상월제를 부드럽게 흡인하고, DPBS 의 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
5. 유세포분석에 의한 세포 분석
   1. 40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링 한 다음 15 mL 원엽 튜브로 필터링 된 세포를 수집합니다. 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다.
      참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다.
   2. 유세포 분석 분석을 위해 적절한 채널(EdU 키트의 Alexa Fluor azide 의 유형에 따라 여기, 빨간색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.
   3. 게이팅 전략
      1. FSC-A(x축) 대 SSC-A(y축) 의사 색 플롯을 그리고 전압을 조정하여 대부분의 셀을 도트 맵의 가시 범위에 분산합니다. 셀 모집단(R1)을 선택하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 셀 파편을 제외합니다.
      2. R1 셀 모집단에서 FSC-A(x축) 대를 설정합니다. FSC-H(y축) 의사색 플롯을 설정하고, 게이트를 설정하여 단일 셀(R2)을 선택하여 셀 덩어리를 배제한다.
      3. R2 세포 집단에서 형광 강도(x축) 대를 설정합니다. 셀 번호(y축) 플롯을 사용하고 음수 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정합니다. 형광 신호의 영역은 양성 세포 영역(R3)이다. 실험군과 대조군 사이의 EdU 양성 세포(R3)의 비율을 비교한다.

3. 엔테로이드의 PI 양성 세포의 유동 세포 분석

참고: 그림 2는 엔터노이드의 PI 양성 세포의 유세포분석 워크플로우를 보여줍니다.

1. PI를 가진 장신구세포의 배양
   1. 5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.
   2. 대조군(미처리) 및 실험군(IL-22 처리)을 설정하고, 각 그룹에 대해 적어도 3개의 복제를 사용한다.
   3. ENR 배지에 PI를 추가하여 3 μM의 농도로 PI 배지를 준비합니다.
   4. 각 웰에 600 μL의 PI 배지를 넣고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 PI 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.
2. 2.2.1-2.2.5 단계 다음 지하 막 매트릭스에서 엔터로이드를 수확하십시오.
3. 유세포분석에 의한 세포 분석
   1. 40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링하고 15 mL 원엽 튜브로 여과 된 세포를 수집합니다.
   2. 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다.
      참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다.
   3. 유세포분석해석을 위해 적절한 채널(여기, 적색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.
   4. 섹션 2.5.3에 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 사용합니다.

결과

소장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장내 세균으로 분리되고 배양되었다. 엔터로이드는 격리 후 2 일 싹을 형성하기 시작했다. 6 일째에 엔터로이드는 루멘에 많은 파편 (죽은 세포)이많은 싹을 가지고 있었습니다. 엔터로이드는 이 단계에서 통과될 준비가되었다(그림 3).

수많은 연구에 따르면 염증성 사이토카인은 장 상피 항상성의 유지에 필수적입니...

토론

이 프로토콜은 유세포측정에 의한 장내 EdU-및 PI 양성 세포의 시험관 내 및 정량화 및 엔테로이드의 배양에 필요한 단계를 상세히 설명한다. 이 전략에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, EdU 라벨링은 장체에서 증식 세포를 검출하는 데 사용됩니다. 기존의 BrdU 분석법에 비해 EdU 라벨링 방법은 더 빠르고 민감하며 더 정확합니다. EdU는 세포 분열 도중 DNA 종합에 있는 티민을 대체하는 티민 (T)와 아주...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049