관상 동맥 혈관 성형술 후 심혈관 예후의 관상 동맥 전구 세포 및 수용성 바이오마커

요약

관상 동맥 혈관 성형술 후 심장 혈관 예후에 영향을 미치는 주요 불리한 심혈관 사건의 개발은 관상 동맥 손상 및 혈관 수리의 정도에 의해 영향을 받습니다. 새로운 관상 동맥 세포 및 수용성 바이오 마커의 사용은 혈관 손상 및 수리에 반응성으로 MACEs 및 예후의 발달을 예측하는 데 유용합니다.

초록

주요 불리한 심장 혈관 사건 (MACEs) 관상 동맥 허혈성 상해 때문에 관상 동맥 혈관 성형술을 겪고 있는 환자의 심장 혈관 예후에 부정적인 영향을 미칩니다. 관상 동맥 손상의 정도 및 혈관 수선 기전은 MACEs의 미래 발달에 영향을 미치는 요인입니다. 플라크 특성 및 관상 동맥 복잡성과 같은 본질적인 혈관 특징은 MACEs에 대한 예후 정보를 입증했습니다. 그러나 관상 동맥 내 순환 바이오마커의 사용은 관상 동맥 손상 및 수리와 관련된 동적 메커니즘을 보다 밀접하게 반영하기 때문에 MACE의 조기 식별 및 예후를 위한 편리한 방법으로 가정되었습니다. 단핵 전구 세포 (MPC)의 하위 집단의 수뿐만 아니라 염증, 세포 부착 및 수리를 반영하는 가용성 분자의 농도와 같은 혈관 성형술 중 관상 동맥 순환 바이오 마커의 결정은 향후 개발 및 MACEs의 예후 평가 6 개월 후 관상 동맥 혈관 성형술. 이 방법은 MACEs의 예측과 환자의 위험 계층화에 적용 될 수있는 심혈관 예후의 예측에 관한 말초 혈액 순환 바이오 마커보다 번역 특성과 더 나은 성능에 의해 강조된다 관상 동맥 질환이 혈관 성형술을 겪고있습니다.

서문

관상 동맥 혈관 성형술 및 스텐트 삽입은 관상 동맥 질환 (CAD)을 가진 환자를위한 인양 절차를 나타냅니다. 그러나, 심장 혈관 죽음, 심근 경색, 관상 동맥 재협착 및 협심증 또는 보상 심부전의 에피소드를 포함하여 중요한 불리한 심장 혈관 사건 (MACEs는, 관상 동맥 내정간섭 후에 달, 병원에 예정되지 않은 방문을 자극하는 생길 수 있습니다. MACEs는 전 세계적으로 일반적이며, 그들의 morbi 사망률은 높은¹.

관상 동맥 허혈성 상해는 그들의 분화 능력 및/또는 혈관 회복 잠재력 때문에 MPC의 동원을 관련시키는 초기 혈관 반응 및 회복 기계장치를 유도합니다, 세포 간 접착 분자 같이 수용성 분자의 생산 뿐만 아니라 (ICAMs), 매트릭스 금속 loloproteinases (MMPs), 및 반응성 산소 종, 세포 접착, 반사성, 조직 을 반영하는. 플라크 특성 및 관상 동맥 복잡성과 같은 본질적인 혈관 특징이 MACE를 예측하는 데 사용되었지만, 일부 연구는 관상 동맥 내피에서 발생하는 부상 및 수리 메커니즘과 관련된 바이오 마커가 관상 동맥 혈관 성형술^2,4,4에제출 된 CAD 환자의 심장 혈관 사건의 조기 식별 및 예후에 매우 유용 할 수 있다고 제안했습니다.

COR 손상 및 수리의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 지속적인 관심은 관상 동맥 샘플링이 혈관 손상을 더 밀접하게 반영하고 수리하기 때문에 관내 순환 바이오 마커를 연구하는 연구자에게 동기를 부여했습니다^6. 그러나, 인간 연구에서 관상 동맥 바이오 마커의 특성화는 부족했다^7,8,9. 따라서 본 연구의 목적은 관상 동맥 순환 MFC 및 가용성 분자의 양을 결정하고, 혈관 손상 및 수리를 모두 반영하는 방법을 설명하고, 이러한 바이오마커가 MACE및 관상 혈관 성형술을 받은 CAD 환자의 임상 예후와 연관되어 있는지 여부를 보여주기 위한 것이었다. 이 방법은 혈관 손상에 가장 가까운 샘플링 위치에 의해 얻어진 혈관 관련, 순환 MPC 및 수용성 분자의 사용을 기반으로합니다. 그것은 또한 하지 호 혈에 대 한 임상 연구에 대 한 유용할 수 있습니다., 스트로크, 혈관 염, 정 맥 혈전증, 그리고 혈관 부상 및 수리를 포함 하는 다른 부상.

프로토콜

이 프로토콜은 인간 연구 윤리 위원회의 제도적 지침을 충족합니다.

1. 관상 동맥 혈관 조영술, 초음파 및 혈액 샘플링

1. 관상 동맥 개입 전에 기준 임상 및 인구 통계 학적 정보를 요청하십시오. 개인의 데이터를 수집: 나이, 성별, 현재 흡연 상태, 체질량 지수 (BMI), 고혈압, 이상지질혈증, 당뇨병 mellitus, 약물, 현재 관상 동맥 혈관 조영술에 대한 표시.
2. 방사형 접근법을 사용하여 심장 카테터화를 통해 관상 동맥 혈관 조영술을 수행합니다. 이 절차는 전문 심장 전문의가 혈역학 실에서 형광 투시경 가이드하에 수행해야합니다.
   참고: 귀중한 선박을 식별합니다. 본 연구를 위해, 귀중한 혈관은 1.5 mm 보다 큰 단면도및 50% 이상의 루멘 협착을 가진 동맥으로 정의되었습니다.
3. 혈관 내 초음파 카테터를 관심 영역으로 진행하고 이미지를 기록합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 가장 작은 발광 영역을 찾고 측정합니다.
4. 관상 동맥 카테터를 사용하여 플라크에 가장 가까운 위치에서 10 mL의 혈액을 수집하십시오.
5. 환자 퇴원 후, 정기적인 의학적 평가를 예약하여 연구 종점을 추적합니다. 전화 연락이 불가능하거나 의사 방문이 2개월 이상 지연되는 경우, 승인된 사람(이전에 설계)에게 연구 끝점을 확인하도록 요청하십시오.
   참고 : 1) 심혈관 사망, 2) 새로운 심근 경색, 3) 관상 동맥 조영술에 의해 입증 된 바와 같이 24 시간, 4) 스텐트 레스코시스 내 의학적 방문을 자극하는 불안정한 협심증, 5) 보상의 에피소드 를 고려하십시오. 임상주의가 필요한 심부전.

2. 순환 MPC의 결정(그림 2)

1. 수집에서 1 시간 이내에 혈액을 처리합니다. 수집된 혈액의 6 mL을 15 mL 원점 튜브로 옮기고 1x 인산완충식염수(PBS), pH=7.4로 1:1(v/v)을 희석한다.
2. 3개의 시험관에 2mL의 밀도 그라데이션 매체를 추가합니다. 밀도 그라데이션 배지를 포함하는 각 시험관으로 희석된 혈액의 3개의 동등한 부피 aliquots를 주의 깊게 전송합니다.
   참고 : 밀도 그라데이션 배지 및 희석 된 혈액의 총 부피는 시험관 최대 용량의 3/4를 초과해서는 안됩니다.
3. 1,800 x g,4 °C에서 30 분 동안 원심 분리기. 층 사이의 계면에서 밴드를 새로운 튜브로 옮긴다. 1,800 x g,4 °C에서 6 분 동안 2 mL의 PBS 및 원심 분리기를 추가하십시오. 펠릿에는 MPC가 포함됩니다.
4. 펠릿을 여러 번 씻으십시오. 이전 용액을 흡인하고 신선한 PBS에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다. 후속 세차의 경우, 1,800 x g,4 °C에서 원심 분리기를 2 분 동안. 6x 과정을 반복하십시오.
5. PBS의 1 mL에 있는 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 세포 현탁액의 20 μL을 0.4% 트라이판 블루와 혼합하고 1:1(v/v)로 희석하였다. 혈세포계에 한 방울을 바르고 가벼운 현미경으로 얼룩지지 않은 세포를 계산합니다.
6. MpC 결정을 진행합니다. 라벨 5 mL 유세포 분석 튜브 및 알리쿼트 아웃 1 x 10 튜브 당⁶ 세포. 상응하는 이소타입-매칭 대조군 항체를 준비한다. 1,800 x g,4 °C에서 6 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 상급체를 폐기한다.
7. 1x PBS (pH = 7.4), 2 mMM에 의해서인에이페디아미네테트라아세트산(EDTA), 0.05% 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 항체 인큐베이션 용액의 100 μL에서 희석된 1차 항체를 첨가한다. 10 초 동안 다시 중단하고 4 °C에서 20 분 동안 배양하고 빛으로 보호합니다. 프로토콜은 PBS에서 4% 파라포름알데히드에 림프구를 고정하고 4°C에서 최대 24시간까지 샘플을 저장함으로써 이 단계에서 일시 중지될 수 있다.
   참고: 본 프로토콜에 사용된 1차 항체의 최종 농도는 CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50이었다.
8. 1,800 x g,4 °C에서 2 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 상급체를 폐기한다. 1x PBS(pH = 7.4), 2 mM EDTA의 500 μL에서 다시 일시 중단합니다.
9. 유세포 분석 수행. 이색성 일치 대조항체를 사용하여 배경 염색을 설정합니다. 그런 다음 FSC/SSC 플롯에서 확산되는 림프구를 선택하여 잔류 과립구, 세포 파편 및 플롯에서 일반적으로 왼쪽 에 있는 다른 입자를 배제합니다. 이러한 분포는 100 %로 간주됩니다.
10. 일반적인 면역 표현형 CD45⁺ 및 CD34^+와세포의 높은 수를 포함하는 게이트를 사용합니다. 이중 양성 면역 체형의 경우 이전에 식별 된 게이트를 사용하여 CD45⁺, CD34⁺+ KDR (VEGFR-2)^{+ + CD133+}또는 CD184^+를추가하십시오. 특정 셀 표면 마커로 MPC 하위 모집단을 식별합니다. 게이트된 이벤트의 백분율로 보고합니다.
11. MpC의 주요 하위 채우기를 식별합니다. 본 연구에서 주요 면역표현형은 CD45+ CD34⁺CD133+ , CD45⁺CD34⁺CD184⁺CD184⁺CD184⁺, CD45⁺CD34^+KDR+CD133+ 및 CD45⁺CD44 + CD44 +
    참고: 사용된 세포 표면 마커는 CD45 (림프구), CD34 (내피 및 / 또는 혈관 세포), KDR (VEGFR-2, 내피 세포의 막 마커), CD133 (내피 전구 세포), 및 CD184 (조혈 줄기 세포 및 내피 세포)였다.

3. 플라즈마 수용성 바이오마커의 결정

1. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 SICAM-1 및 MMP-9의 농도를 결정합니다(도3,위행).
   1. 혈액 샘플을 3,000 x g,실온에서 5 분 동안 원심 분리하고 플라즈마를 수집합니다.
   2. 표준, 샘플 튜브 및 제어 튜브에 라벨을 지정합니다. ELISA 키트에 제공된 세척 버퍼로 2x세척하여 분석판에 미리 코팅된 웰을 평형화한다.
   3. 표준, 샘플 및 컨트롤을 웰로 전송합니다. 90 분 동안 37 °C에서 밀봉하고 배양하십시오.
      참고: 우물을 완전히 말리지 마십시오.
   4. 내용물 버려서 비오틴 검출 항체를 추가한다. 밀봉 및 60 분 동안 37 °C에서 배양.
   5. 내용물의 것을 버리고 3 x를 씻으십시오. 플라크를 밀봉하고 스트렙타비딘 작업 용액으로 순차적으로 인큐베이션한 다음 37°C에서 테트라메틸벤지딘 기판을 30분 동안 가볍게 보호합니다. 배양 사이에 3x를 씻으소서. 색상이 발생하면 정지 용액을 추가하고 마이크로 플레이트 ELISA 리더에서 광학 밀도 흡광도를 읽습니다.
2. 면역-자기 다중화 분석기를 사용하여 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 및 인터류키친 1 베타(IL-1β)의 농도를 결정한다(도3,하부 행).
   1. 표준, 샘플 튜브 및 제어 튜브에 라벨을 지정합니다.
   2. 30s. 비드 현탁액을 적당한 크기의 튜브로 옮은 다음 멀티플렉싱 분석 판의 우물로 자성 비드 바이알을 소용돌이치게 한다. 주기적인 소용돌이는 구슬의 침전을 피합니다.
   3. 핸드헬드 마그네틱 플레이트 와셔를 단단히 삽입합니다. 구슬이 각 우물의 바닥에 축적될 때까지 2분 간 기다렸다가 싱크대 나 폐용기 위에 휴대용 자기 판 와셔와 플레이트 어셈블리를 빠르게 반전시다. 우물 내부의 구슬을 유지하기 위해 휴대용 자기 플레이트 와셔를 사용하는 것을 기억하십시오.
   4. 각 우물에 150 μL의 세척 버퍼를 추가하고 구슬이 바닥에 축적 될 수 있도록 30 s를 기다립니다. 3.2.3단계에서와 같이 내용을 폐기하십시오. 그런 다음 25 μL의 범용 분석 버퍼(키트에 제공)를 추가하고 준비된 표준, 샘플 및 제어의 25 μL을 추가합니다.
   5. 접시를 밀봉하고 500 rpm에서 일정한 흔들림으로, 빛보호, 실온에서 적어도 60 분 동안 배양. 양자택일로, 4°C에서 밤새 배양하고, 빛으로 보호되고, 가능하면 500 rpm에서 일정한 흔들림을 갖는다.
   6. 세척 버퍼 150 μL을 추가하여 2x세척하고 30s를 기다립니다. 2분 정도 기다렸다가 싱크대 나 폐통을 뒤집습니다.
   7. 검출 항체 혼합물 25 μL로 순차적으로 인큐베이션하고 실온에서 스트렙타비딘-PE 용액 25 μL을 30 분 동안 밀봉하고 500 rpm에서 일정한 흔들림으로 밀봉하고 빛으로 보호합니다. 3.2.6 단계에서 설명한 바와 같이 인큐베이션 사이에 2x를 세척합니다.
   8. 판독값을 가져옵니다. 읽기 버퍼의 120 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 500rpm에서 일정한 흔들림으로 가벼운 보호, 실온에서 5 분 배양. 멀티플렉싱 분석 리더에서 읽기를 실행합니다. 각 측정값에 따라 판독 매개변수를 조정합니다.

결과

관상동맥, 정맥부비동 및 말초혈액을 52명의 환자로부터 채취하여 관상동맥혈관조영술을 시행하였다(도1)와고혈압 및 이상지질혈증의 높은 유병률을 보였다. 임상 후속 조치에서 11명(21.1%)이 MACEs는 관상 동맥 혈관 조영술 후 6 개월 발생 : 죽음 (n = 1), 병원 출석을 필요로하는 협심증 (n = 6), 심근 경색 (n = 2), 및 / 또는 심부전의 증거 (n = 4).

토론

영향 받은 관상 동맥에서 혈액 수집은 어려울 지도 모릅니다. 때로는 관상 동맥에 거의 접근 할 수 없습니다. 이 경우 정맥 부비동에서 샘플링하는 것이 대안이 될 수 있습니다. 우리는 관상 동맥에 있는 순환 biomarkers 대 정맥 부비동에 있는 비교하는 유효성 검사 시험을, 유의한 다름 없이 수행했습니다. 그러나, 순환 바이오마커의 성능은 관상 동맥 샘플링에 대해서만 검증되었다. 따라서 정맥 부...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm