항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제

요약

우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.

초록

천연 물 추출물에서 새로운 항생제에 대 한 검색에 주요 과제 중 하나는 일반적인 화합물의 재발견. 이 문제를 해결하기 위해 알려진 화합물을 식별하는 프로세스인 복제 해제가 관심 있는 샘플에서 수행됩니다. 분석 분리와 질량 분석과 같은 복제 를 위한 방법은 시간이 많이 걸리고 리소스집약적입니다. 복제 를 개선하기 위해 항생제 내성 플랫폼 (ARP)을 개발했습니다. ARP는 대장균에 개별적으로 복제된 약 100개의 항생제 내성 유전자의 라이브러리입니다. 이 균주 수집은 항생제 복제를 위한 비용 효과적이고 허구적인 방법을 포함하여 많은 응용을 가지고 있습니다. 이 과정은 고체 배지를 포함하는 직사각형 페트리 접시의 표면에 항생제 생산 미생물의 발효를 수반하여 매체를 통해 이차 대사 산물의 분비 및 확산을 허용합니다. 6일 발효 기간 이후에 미생물 바이오매스를 제거하고, 얇은 한천 오버레이를 페트리 접시에 첨가하여 매끄러운 표면을 만들고 대장균 표시기 균주의 성장을 가능하게 한다. ARP 균주의 우리의 컬렉션은 다음 항생제 함유 페트리 접시의 표면에 고정된다. 플레이트는 오버레이의 표면에 대장균 성장을 허용하기 위해 밤새 배양된다. 특정 항생제 (또는 클래스)에 대한 내성을 포함하는 균주만이 이 표면에서 성장하여 생성된 화합물을 신속하게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 알려진 항생제의 생산자의 식별및 새로운 화합물을 생산하는 사람들을 식별하는 수단으로 성공적으로 사용되었습니다.

서문

1928년 페니실린이 발견된 이래, 환경 미생물에서 유래한 천연물은 항균 화합물의 풍부한 공급원인 것으로 입증되었다^1. 천연물 항생제의 약 80%는 연쇄상 구균 과 다른 액티노마이세테 속의 박테리아에서 유래하며, 나머지 20%는 곰팡이 종^1에의해 생성됩니다. β-락탐, 테트라사이클린, 리파마이신 및 아미노글리코시드와 같은 클리닉에서 사용되는 가장 일반적인 항생제 스캐폴드 중 일부는 원래 미생물^2로부터분리되었다. 그러나, 다중 약 저항하는 (MDR) 박테리아의 상승 때문에, 항생제의 우리의 현재 패널은 처리에 있는 보다 적게 효과적이되었습니다^3,4. 이들은 "ESKAPE" 병원체 (즉, 반코마이신 내성 장구균 및 β-락탐 내성 황색포도상구균, Klebsiella pneumoniae, 슈도모나스 aeruginosa, 아신토박터 보만니,및 Enterobacter sp.), 이는 세계보건기구(WHO)^3,4,5와같은 다수의 주요 공중 보건 당국에 의해 가장 높은 위험과 연관된 것으로 간주되는 박테리아의 하위 집합이다. 이 MDR 병원체의 출현 그리고 세계적인 퍼짐은 새로운 항생제^3,4,5를위한 지속적인 필요 귀착됩니다. 유감스럽게도, 지난 2 년간은 미생물 근원에서 새로운 항생제의 발견이 점점 더 어렵다는 것을 보여주었습니다^6. 약물 발견에 대한 현재의 접근법에는 천연물 추출물 라이브러리를 포함한 생리 활성 화합물의 높은 처리량 스크리닝이 포함되며, 주어진 시간에 수천 개의 추출물을 테스트 할 수 있습니다^2. 그러나, 일단 항균 활성이 검출되면, 다음 단계는 활성 성분을 식별하고 공지된 또는 중복^화합물을함유하는 것을 제거하기 위해 원유 추출물의 함량을 분석하는^7,8이다. 복제를 복제라고 하는 이 프로세스는 알려진^{항생제7,9의}재발견에 소요되는 시간을 방지 및/또는 현저하게 줄이는 데 필수적입니다. 천연물 신약 발견에 필요한 단계이지만, 복제 는 악명 높고 자원 집약적^{인 10입니다.}

Beutler 등은 "복제"라는 용어를 처음 만든 이래로 알려진 항생제^11,12의신속한 식별을 위한 혁신적인 전략을 개발하기 위한 광범위한 노력이 이루어졌습니다. 오늘날 복제에 사용되는 가장 일반적인 도구는 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 핵 자기 공명 기반 검출 방법^11,13과같은 분석 크로마토그래피 시스템을 포함한다. 안타깝게도 이러한 각 방법은 값비싼 분석 장비와 정교한 데이터 해석을 사용해야 합니다.

전문장비 없이 도신속하게 수행할 수 있는 복제방법을 개발하기 위해 항생제 내성 플랫폼(ARP)^10을구축하였다. ARP는 항생제 보조제의 발견, 알려진 내성 메커니즘에 대한 새로운 항생제 화합물의 프로파일링 및 액티노박테리아 및 기타 미생물에서 유래한 추출물에서 알려진 항생제의 복제에 사용될 수 있다. 여기에서는 항생제 복제에 대한 적용에 중점을 둡니다. ARP는 가장 일반적으로 재발견된 항생제^14,15에대하여 효과적인 개별 저항 유전자를 발현하는 이소제닉 대장균 균주의 라이브러리를 이용한다. 대장균 라이브러리가 이차 대사산물 생산 유기체의 존재 내에서 성장될 때, 화합물의 정체성은 관련 저항 유전자^10을발현하는 대장균 균주의 성장에 의해 추론될 수 있다. ARP가 처음 보고되었을 때, 도서관은 16개의 항생제 클래스에 저항성을 부여하는 >40 유전자로 구성되었습니다. 본래의 복제 템플릿은 복제 과정 동안 항생제 하위 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 항생제 클래스당 저항 유전자의 하위 집합을 포괄하도록 설계되었습니다. 오늘, ARP는 18개의 항생제 클래스에 저항을 부여하는 >90 유전자로 이루어져 있습니다. 저항 유전자의 우리의 광대한 컬렉션을 사용하여, 이차 복제 템플릿은 개발되고 최소한의 항생 저항 플랫폼으로 알려져 있다 (MARP). 이 템플릿은 유전자 중복성을 제거하고 단순히 복제 된 대사 산물과 관련된 일반적인 항생제 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 만들어졌습니다. 또한 MARP 템플릿은 ARP의 원래 화신과 비교하여 대장균 BW25113(대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC)의야생 유형 및 과다 투과성 /유출 성 균주를 모두 보유하고 있습니다. 과다 투과성 변형을 활용합니다. 이 독특한 양상은 그람 음성 박테리아의 외부 막을 교차하는 화합물 능력을 나타내는, 복제 를 하는 동안 추가 표현형을 만듭니다. 여기서는 ARP 및/또는 MARP로 복제할 때 따라야 할 강력한 프로토콜을 설명하고 따라야 할 가장 중요한 단계를 강조 표시하고 다양한 가능한 결과를 논의합니다.

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프로토콜

1. 대장균 도서관 글리세롤 주식 준비 (한천 슬랜트에서)

1. ARP/MARP 대장균 균주를 리소제니 국물(LB)에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 페트리 접시에 비스듬히 기울게한다(표 1).
2. 단일 콜로니와 함께 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 LB의 3 mL을 접종하여 각 대장균 균주에 대한 배양을 준비한다. 폭기 (250 rpm)로 37 °C에서 하룻밤 성장.
3. 배양 800 μL과 멸균 80% 글리세롤 200 μL을 1.8 mL 극저온으로 결합합니다. 튜브를 3-4회 반전시켜 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.

2. ARP / MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트 준비

1. 섹션 1에서 제조된 글리세롤 스톡에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 포함하는 새로운 페트리 접시 세트에 ARP/MARP 균주를 줄무늬. 37 °C에서 하룻밤 성장.
2. 무균 기술을 사용하여, 양이온의 피펫 500 μL은 멸균 저수지로부터 뮬러 힌튼 국물(MHB)을 멸균 된 96 개의 깊은 웰 플레이트의 각 우물로 조정하였다.
3. 2.1단계에서 제조된 플레이트를 사용하여, ARP/MARP 맵에 따라 96개의 딥 웰 플레이트를 접종하기 위해 어플리케이터 스틱을 사용한다(보충도 1 및 보충 도 2). 각 웰에 적절한 선택 가능한 마커가 추가되었는지 확인합니다. 통기성이 좋은 밀봉 막을 깊은 웰 플레이트의 표면에 놓고 37°C(250 rpm)에서 밤새 배양합니다.
4. ARP/MARP 맵을 참조하여 오염된 우물이 없는지 확인합니다. 오염된 경우 반복합니다. 멀티 채널 파이펫터를 사용하여, 깊은 웰 플레이트의 각 웰로부터 100 μL을 멸균 된 96 웰 라운드 바닥 판으로 옮김. 이 단계를 반복하여 고정된 스톡 라이브러리 플레이트를 여러 개 작성합니다.
   참고: 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염의 경우 2.1-2.4 단계를 반복하지 않도록 한 번에 적어도 5 개의 라이브러리 플레이트를 준비하는 것이 가장 좋습니다.
5. 멸균 50% 글리세롤 100 μL을 각 우물에 파이펫팅하여 ARP/MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트를 만들고 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다.
6. 멸균 알루미늄 씰로 플레이트를 덮고 각 우물이 개별적으로 밀봉되었는지 확인하십시오.
7. 플레이트번호와 지정된 시간에 새 템플릿을 접종하기 위해 하나의 냉동 재고 라이브러리 플레이트만 바칩니다. 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염시 나머지를 백업으로 보관하십시오.
8. 플레이트 뚜껑을 알루미늄 씰 위에 놓고 -80°C에 보관하십시오.

3. 종자 문화 및 복제 플레이트 준비

1. 어플리케이터 스틱을 사용하여, 제조 균주와 함께 1개의 멸균 유리 비드(균사체를 분해하기 위해)를 포함하는 시험관에서 연쇄상 구균 항생제 배지(SAM) (또는 시험중인 유기체에 대한 다른 적절한 배지)의 3 mL을 접종합니다. 복제되지 않습니다. 연쇄상 구균의 경우 식민지 표면에서 포자를 부드럽게 긁어 냅니다.
2. 동일한 나무 어플리케이터 스틱을 사용하여 베넷의 한천이 들어있는 페트리 접시에 멸균 컨트롤을 적용합니다.
3. 종자 배양을 30°C에서 6일(250 rpm) 동안 배양하고 6일 동안 30°C에서 멸균 대조판을 배양한다.
   참고: SAM 및 베넷의 미디어 레시피는 표 2를 참조하십시오. 위의 지침은 대부분의 actinomycetes에 적합합니다. 다른 박테리아와 곰 팡이에 대 한 필요에 따라 성장 매체를 변경.
4. 따뜻한 베넷의 한천 23mL를 세레큘러 피펫에 흡인하여 복제 플레이트를 준비하고 직사각형 페트리접시(재료 표)의표면을 가로질러 20 mL을 고르게 분배하고 나머지 배지를 파이펫에 남겨두는 것을 방지합니다. 기포 형성.
   참고: 접시를 붓는 데 사용되는 표면이 수평인지 확인하고 한천이 너무 많이 냉각되기 전에이 단계를 수행해야합니다. 평평한 표면은 다음 단계에서 라이브러리 고정에 필수적입니다.
5. 중간 부분이 플레이트의 모든 영역을 덮을 때까지 플레이트를 부드럽게 돌리고 한천이 완전히 설정될 때까지 접시를 방해하지 마십시오.
6. 시트가 복제플레이트의표면에 맞도록 직사각형 페트리 접시 뚜껑을 추적 템플릿으로 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 시트(재료 표)를 준비한다. 시트를 자르고 멸균 파우치에 오토 클레이브.
   참고: 이 막은 유기체가 그것의 표면에 sporulated 수 있습니다., 보조 대사 산물 아래 매체로 배설 될 수 있습니다 하는 동안. 일단 성장하면, 멤브레인은 복제를 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위하여 제거됩니다. 멤브레인 용지가 베넷 의 한천 표면에 있는 것과 더 가까울수록 복제 를 더 깨끗하게 합니다.
7. 멸균 제어 판을 확인하여 6일 간의 배양 후 오염물질이 없는지 확인하십시오. 오염이 없는 경우, 직사각형 페트리 접시의 뚜껑을 제거하고 200 μL의 종자 배양체를 베넷의 한천 표면에 제거한다.
8. 멸균 면봉을 사용하여 전체 플레이트의 표면에 균일하게 배양을 확산시다.
9. 3.6단계에서 제조된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 페트리 접시의 표면에 배양 위에 놓는다. 멤브레인의 아래쪽 가장자리를 페트리 접시의 하단 가장자리에 정렬하여 시작하고 아래쪽 가장자리에서 플레이트의 위쪽 가장자리까지 멤브레인을 천천히 적용합니다.
10. 멸균 면봉을 사용하여 멤브레인-한천 인터페이스 사이에 형성되었을 수 있는 기포를 매끄럽게 하여 막이 한천에 플러시되도록 합니다.
11. 뚜껑을 다시 직사각형 페트리 접시에 올려 놓고 밀봉된 비닐 봉지에 거꾸로 놓습니다. 6 일 동안 30 °C에서 배양하십시오.

4. 복제 플레이트 MHB 오버레이 및 ARP / MARP 라이브러리 플레이트 준비

1. 6일 후, 30°C 인큐베이터로부터 복제 플레이트를 제거한다. 멸균 핀셋(70% 에탄올로 철저히 토클라브 또는 분무)을 사용하여 베넷 의 한천 표면에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다.
   참고: 이 단계는 4.2 단계를 용이하게 하는 복제를 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 멤브레인의 표면상에서 자란 소수성 포자 및 균수를 제거할 것이다.
2. 3.4 단계에 대해 설명된 바와 같이, 작업 표면이 수평인지 확인하고 23 mL의 따뜻한 양이온 조정 MHB 한천을 흡인하기 위해 혈청학적 파이펫을 사용한다. 복제 플레이트 의 표면을 균일하게 분배하여 오버레이를 만들고, 나머지 배지를 파이펫에 남겨 두어 기포 형성을 방지합니다.
3. 중간 부분이 모든 영역을 덮을 때까지 접시를 부드럽게 돌리고 한천이 완전히 설정될 때까지 접시를 방해하지 마십시오. 일단 냉각되고 고화되면, 복제 판을 밀봉된 비닐 봉지에 반납하고 밤새 4°C에서 거꾸로 보관하십시오.
   참고: 이 단계는 발효 된 베넷의 배지에서 MHB 한천 오버레이로 이차 대사 산물의 확산을 허용합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인이 제대로 제조되지 않은 경우 MHB 한천을 격퇴하는 소수성 특성을 가지는 플레이트의 가장자리 주위의 포자 성장이 있을 것이다. 오버레이의 오염을 초래할 수 있으므로 이러한 포자의 상단에 오버레이를 붓지 마십시오.
4. 오버레이가 부어지는 당일, 100 μL의 양이온을 피펫팅하여 96웰 플레이트의 각 웰에 MHB를 주입하여 신선한 ARP/MARP 템플릿을 접종합니다.
   참고: 복제 중에 오염이 확산될 가능성을 줄이려면 단일 ARP/MARP 라이브러리 플레이트를 사용하여 2−3 복제 플레이트만 복제합니다. 따라서, 복제될 균주의 수에 따라 충분한 96웰 ARP/MARP 플레이트를 접종한다.
5. -80°C 냉동고에서 냉동 재고 ARP/MARP 라이브러리 플레이트를 꺼낸다. 응축이 시작되기 전에 알루미늄 씰을 제거하여 밑면에 형성되어 라이브러리 플레이트의 주변 우물을 오염시킬 가능성을 줄입니다.
6. 멸균 96웰 고정 도구(또는 다른 형태의 접종 장비)를 사용하여 냉동 재고 ARP/MARP 라이브러리 플레이트에서 조심스럽게 고정하고 96웰이 함유된 신선한 MHB 함유 플레이트를 접종합니다. 복제 중 오염을 최소화하려면 라이브러리 플레이트당 2−3 복제 플레이트만 복제하는 데 필요한 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트를 최대한 준비합니다. 각 플레이트를 접종하는 사이에 고정 도구를 살균합니다.
7. 새로운 멸균 알루미늄 씰을 냉동 템플릿에 놓고 -80°C 냉동고로 되돌려 놓습니다. 밀봉된 비닐 봉지 내부에 접종된 96웰 플레이트를 넣고 37°C에서 폭기(250 rpm)를 18시간 동안 배양합니다.
   참고: 오염이 없는지 확인한 후 이 단계에서 새로운 냉동 스톡 라이브러리 플레이트를 제조할 수 있습니다. 2.5단계에서 설명한 대로 -80°C에서 보관하기 전에 플레이트에 글리세롤을 첨가합니다.

5. ARP/MARP를 사용하여 복제 복제

1. 인큐베이터에서 ARP/MARP 템플릿을 제거하고 오염 물질이 없는지 확인합니다. 냉동 된 스톡에서 직접 준비되지 않고 새로 준비된 템플릿을 사용하여 항상 복제를 제거합니다.
2. 4°C에서 복제 플레이트를 제거하고 실온에 평형화하십시오. 결로가 있는 경우 뚜껑을 열고 멸균 된 환경에서 건조시키십시오.
3. 멸균 고정 도구(또는 기타 접종 장비)를 사용하여 ARP/MARP 라이브러리 플레이트의 핀을 복제 플레이트의 MHB 한천 오버레이 표면에 고정합니다. 한천을 관통하지 않도록 주의하십시오. 각 복제 플레이트를 접종하는 사이에 고정 도구를 살균합니다.
4. 복제 플레이트의 표면에 템플릿을 고정한 후 템플릿 접종을 3-5 분 동안 건조시키십시오. 접종 된 복제 판을 밀봉 된 비닐 봉지에 거꾸로 놓고 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
5. 복제 플레이트의 성장을 ARP/MARP 맵에 해당하는 웰과 비교하여 다음 날 의 복제 결과를 분석합니다(표3 및 표 4).

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결과

다음 결과는 관심의 항생제 생산 긴장의 집합이 ARP 및/또는 MARP를 사용하여 복제될 때 장악되었습니다.

ARP/MARP 복제 워크플로의 다이어그램은 그림 1에나와 있으며 라이브러리 플레이트 맵은 추가 그림 1 및 보충 그림 2에표시됩니다. 도 2는 환경 추출물 WAC 8921이 클로람페니콜 생산자로 확인되는 것을 통해 ...

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토론

전술한 프로토콜은 그들의 활성을 구출하기 위해 기존 항생제와 함께 사용될 수 있는 신규한 항균 화합물 및 보조제의 발견 모두에 적용될 수 있다. 이 플랫폼은 내성 메커니즘과 동종 항생제의 높은 기질 특이성을 활용하여 원유 천연 물추출물 내에서 화합물을 복제합니다. 복제 플레이트를 준비하는 데 필요한 시간이 길지만(~2주), 복제 프로세스 자체는 단일 하룻밤 잠복기 후에 완료되며, 이는...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2