초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

요약

이 프로토콜은 초음파 화상 진찰에 의하여 형성된 종양의 정량화뿐만 아니라 마우스에 있는 KRAS 폐 종양을 유도하기 위하여 취한 단계를 기술합니다. 작은 종양은 B 선으로 초기 시간대에 시각화됩니다. 이후 시점에서 상대 종양 부피 측정은 초음파 소프트웨어의 측정 도구에 의해 달성됩니다.

초록

매년 160만 명의 피해자가 있는 폐암은 전 세계적으로 암의 부담에 크게 기여하고 있습니다. 폐암은 폐암 케이스의 ~ 25%를 구성하는 KRAS 종양유전자와 같은 종양 유전자에 있는 유전 변경에 의해 부분적으로 구동됩니다. KRAS 구동 폐암을 치료적으로 표적으로 하는 어려움은 부분적으로 실험실에 있는 질병의 진행을 모방할 수 있는 가난한 모형이 있기에서 유래합니다. 우리는 초음파 화상 진찰을 통해 Cre 유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모형에 있는 1 차적인 KRAS 폐 종양의 상대적인 정량화를 허용하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 폐 자렌치의 밝기 (B) 모드 획득에 의존한다. 이 모형에서 처음에 형성되는 종양은 B 선으로 구상되고 취득한 심상에 있는 B 선의 수를 계수해서 정량화될 수 있습니다. 이들은 마우스 폐의 표면에 형성된 상대적인 종양 수를 나타낼 것이다. 형성된 종양이 시간이 지남에 따라 발전함에 따라 폐 실치내의 깊은 갈라짐으로 인식됩니다. 형성된 종양의 둘레가 잘 정의되기 때문에, 상대적인 종양 부피를 계산하는 것은 종양의 길이 및 폭을 측정하고 이를 종양 캘리퍼스 측정에 사용되는 공식에 적용함으로써 달성된다. 초음파 화상 진찰은 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 수시로 이용되는 비침범성, 빠르고 사용자 친화적인 기술입니다. 비록 유물은 초음파 심상을 취득할 때 나타날 수 있더라도, 이 화상 진찰 기술은 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 화상 진찰과 같은 그밖 화상 진찰 기술에 비교된 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 더 유리하다는 것을 보여주었습니다 생물 발광 이미징 (BLI). 연구원은 마우스의 다른 단 사이 폐 종양 개시 그리고 진행을 비교해서 이 기술을 사용하여 새로운 치료 표적을 조사할 수 있습니다.

서문

전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로, 폐암은 주로 실험실에서 질병을 재현 할 수있는 관련 전임상 모델의 부족으로 인해 치료에 불응성 남아있다^1. 폐암 케이스의 약 25%는 KRAS 종양유전자^2에있는 돌연변이 때문이. KRAS 구동 폐암은 수시로 이 질병에 있는 추가 연구 결과의 중요성을 강조하는 치료에 나쁜 예후 및 낮은 반응과 연관됩니다^2.

KRAS 폐암 유발 면역유능한 마우스에서 폐종양 성장에 대한 상대적 평가를 실시간으로 할 수 있는 방법을 최적화하였다. 우리는 KRAS G12D 종양유전자가 Cre lentiviral 벡터^3,4에의해 발현될 수 있는 록스 스톱 록스 KRAS G12D(LSL-KRAS G12D) 마우스를 사용합니다. 이들 벡터는 탄산 무수드라아제 2에 의해 구동되며, 바이러스 감염이 폐포 상피^{세포5에서}특이적으로 일어날 수 있도록 한다. 또한, 폐 종양의 개시 및 진행을 가속화하기 위해, 렌티바이러스 구조체는 또한 U6/H1 프로모터로부터 P53 shRNA를 발현한다(본명 렌티바이러스구조는 Ca2Cre-shp53)로 지칭될 것이다 6. 이 방법의 생물학적 관련성은 마우스에서 비 정형 종양의 이종이식과 는 반대로 마우스에서 폐 종양 발달의 자연적인 과정에 있다. 정형외피 법을 이용한 장애물은 마우스를 희생시키지 않고 폐종양 성장을 모니터링하는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 이 마우스 모델에서 2차원(2D) 모드에서 폐 종양 진행을 분석할 수 있도록 초음파 영상을 최적화했습니다. 감염 후 7 주에 종양을 시작하면 초음파 이미지에서 B 라인으로 반영되며, 이는 계산 될 수 있지만 폐에 존재하는 정확한 종양 수를 반영하지는 않습니다. B 라인은 폐 실치마^7,8의흉막 선에서 발생하는 레이저와 같은 수직 흰색 라인을 특징으로합니다. 큰 종양은 감염의 18 주 후에 구상될 수 있습니다. 이 종양의 상대적인 부피는 초음파에 행해진 2D 측정에 의해 정량화됩니다.

이 방법은 LSL-KRAS G12D 마우스 모델에서 폐 종양 성장에 대한 약리학적 약물의 효과를 조사하는 연구진에게 최적입니다. 또한, 폐 종양 진행은 상이한 유전계를 가진 마우스 들 사이에서 비교될 수 있고, 폐 종양 부피의 발달에 대한 특정 유전자/단백질의 존재 또는 부재의 중요성을 조사한다.

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프로토콜

동물 연구는 맥길 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행되었으며 절차는 맥길 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다 (동물 사용 프로토콜 # 2009-5754).

1. CA2Cre-shp53 렌티바이러스 티트르의 세대

참고: 다음 프로토콜은 Xia 등^6에설명된 프로토콜과 동일하며 사소한 수정이 있습니다.

1. 렌티 바이러스의 준비 (15cm x 10cm 요리)
   1. 1일째, 건강한 HEK293T 세포(10cm 접시당 7.5 x 10^6세포)와 덜베코의 변형된 독수리 배지 10 mL(DMEM), 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 펜/스트렙. 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양한다.
   2. 칼슘 인산염 형혈 (15 접시 혼합물)에 대한 혼합물을 준비합니다. 렌티바이러스 벡터(Ca2Cre-shp53), PsPAX2 플라스미드(HIV-1 개그 및 HIV-1 폴 유전자 함유), 75 μg(5 μg/plate)의 렌티바이러스 벡터(Ca2Cre-shp53), 75 μg(5 μg/plate)를 함유하는 튜브 A를 준비합니다. 최종 농도0.15 M의 CaCl_2를 증류된_H2O로 최대 3.75 mL로 튜브를 채웁니다. 2x HEPES 완충 식염수 3.75 mL을 포함하는 튜브 B를 준비하십시오 (HBS; 50 mM HEPES, pH 7.05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na₂HPO₄2H₂O, 및 12 mM D-덱스트로오스).
   3. 소용돌이 튜브 A를 연속 소용돌이 하에서 튜브 B에 드롭 와이즈를 추가합니다.
      참고 : 총 볼륨은 7.5 mL입니다.
   4. 20-30 분 동안 어둠 속에서 실온에서 배양하십시오.
   5. 세포를 도금 한 후 약 9 시간, 세포 매체에 500 μL의 형질 전환 혼합물을 드롭 와이즈 (7.5 mL / 15 접시 : 접시 당 0.5 mL)를 추가합니다.
   6. 각 접시를 부드럽게 소용돌이하여 혼합하고 모든 접시를 37 °C, 5 %_CO2에서배양하십시오.
   7. 2일째, 12-18시간 후, 10cm 접시당 10 mL의 항생제 무감회 환원 혈청매체(재료표)로용지를 교체하였다. 접시를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 다시 놓습니다.
   8. 3일째에, Ca2Cre-shp53을 발현하는 렌티바이러스가 함유된 매체를 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 필터한다. 신선한 항생제가 없는 감소된 혈청 매체로 미디어를 보충하십시오.
      참고: 수집된 매체는 3일 이상 4°C에서 보관할 수 있다.
   9. 4일째에, 렌티바이러스를 함유하는 미디어를 2회 동안 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 필터한다. 4 °C (3 일 이상)에서 유지하십시오.
   10. 단계 1.1.8 및 1.1.9에서 바이러스 supernatants를 결합합니다. 4 °C에서 30 분 동안 1,372 x g에서 원심 분리하여 원심 필터 장치(재료 표)를통해 농축하십시오. 수집된 모든 미디어가 열을 통과할 때까지 이 과정을 반복합니다.
       참고 : 각 원심 분리 후, 농축 여과액의 100-200 μL을 수확 할 수 있습니다.
   11. 농축 된 여과액을 15 mL 얼음 차가운 튜브에 모으고 혼합하십시오. 농축 된 렌티 바이러스를 잘 섞은 다음 aliquot (예를 들어, 100 μL / 튜브). -80 °C에서 보관하십시오.
2. 렌티바이러스 적정
   참고: 녹색 형광 단백질(GFP)의 loxP 측면 알레일을 발현하는 불멸화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)는 바이러스 역가의 정량화를 위해 이 프로토콜에 사용된다. 그러나, loxP-GFP 단조를 가진 임의의 세포주에는 이 단계에 적합해야 한다.
   1. DMEM, 10% FBS 및 37°C에서 1% 펜/스트렙을 가진 GFP의 loxP 측면 알레일을 발현하는 배양 세포, 5%_CO2.
   2. 플레이트 2 x 10⁵ 셀을 6 웰 플레이트의 50mm 웰 2 개에 넣습니다.
      참고 : 하나의 우물의 세포는 렌티 바이러스 감염에 사용되는 반면 다른 세포는 부정적인 대조군으로 사용됩니다.
   3. 다음날, 렌티바이러스 감염 전에 2 mL의 DMEM, 10% FBS 및 1% 펜/스트렙 2시간으로 세포를 보충하십시오.
   4. 렌티바이러스 감염에 CA2Cre-shp53 렌티바이러스(필요할 때 부피가 다를 수 있음)의 20 μL을 추가합니다.
   5. 배양 3일 후, 도 1에나타낸 바와 같이 유세포측정에 의한 Cre-유도 GFP 양성 세포의 빈도를 결정한다. 인산완식염수(PBS)로 세포를 세척하고, 트립시네이션에 의해 분리하고 112 x g에서원심분리에 의해 세포를 수집한다.
   6. PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오. 마지막으로, PBS의 100 μL에서 세포를 중단합니다. 세포 분석기(재료표)에의한 GFP 양성 세포의 백분율을 결정합니다.
   7. 다음 공식을 사용하여 렌티바이러스 전염성/기능적 적시를 계산합니다.
      
      여기서 F는 GFP 양성 세포의 빈도를 도 1(F=Fi-Fc)에 도시된 바와 같이 GFP 양성 세포(Background)의 빈도로부터 감염 후 GFP 양성 세포의 빈도를 빼서 계산(F=Fi-Fc), Cn은 도금된 세포의 수(2 x 10^5),V는 접종(mL) 및 DF의 부피이다.
      참고 : 전염성 / 기능 농도 = ~ 2 x 10⁶ TU / mL.

2. LSL-KRAS^G12D 마우스에 있는 렌즈바이러스의 내선 관과

참고: 반디보르트 외^9에의해 출판된 프로토콜에 기재된 바와 같이, 내막 삽관의 방법은 사용되었다. 본 프로토콜에서, C57BL/6 배경의 마우스 LSL-KRAS^G12D 마우스는 6-8주에 사용된다. 집에서 만든 작업 절차 보드는 Vandivort 등^9에설명 된 대로 사용됩니다. 보드는 편리한 작업 공간 (약 1m^2)에서실험자 앞에 배치됩니다.

1. 1 mL 주사기의 플런저를 제거하고 60 μL의 PBS를 주사기에 적재하여 폐활량계를 준비합니다.
2. 22G 카테터 팁을 주사기에 넣고 따로 둡니다.
3. 케타민 (50 mg / mL)/자일라진 (5 mg / mL)/아세프로마진 (1 mg / mL) 칵테일의 마우스 체중 1 μL / g의 복강 내 주입으로 마우스를 마취. 낮은 호흡률(2회마다 1회 호흡)하여 마우스의 적절한 내반응을 확인하십시오.
4. CA2Cre-shp53 렌티바이러스의 20 μL을 피펫터에 넣고 따로 둔다.
5. 상부 앞니를 보드의 실에 연결하여 작업 절차 보드에 진정된 마우스를 놓습니다.
   참고: 마우스의 도르섬은 플랫폼에 대해 평평해야 합니다.
6. 시술 중에 마우스의 정렬을 보장하기 위해 흉강 구멍의 꼬리 부분을 플랫폼에 테이프로 채입니다.
7. 구스넥 일루미네이터를 80-100% 강도로 조정하고 피부 표면에서 빛을 1−2cm 떨어진 곳에 놓습니다.
8. 플랫폼 뒤에서 멸균 집게를 사용하여 마우스의 구강에서 혀를 꺼낸다.
9. 혀를 고정하는 동안, 마우스의 구강에 우울증을 삽입 한 다음 혀를 해제합니다.
10. 주 줄기 기관지위에 구스넥을 배치하여 기관을 비춥시합니다.
    참고 : 기관호흡의 작용을 통해 볼 수 있습니다, 빛의 변동을 일으키는.
11. 기관을 명확하게 볼 때, 준비된 폐활량계(PBS 및 카테터가 있는 주사기)를 기관 경로에 삽입합니다.
12. 우울을 제거하고 각 호흡주사기에서 PBS의 상승과 하강을 관찰하십시오.
    참고 : 이것은 카테터가 기관에 제대로 위치한다는 표시기입니다.
13. 이전 위치로 기관 내부의 카테터를 유지하면서 PBS를 함유하는 주사기를 제거합니다.
14. 20 μL CA2Cre-shp53 렌티바이러스를 카테터 중앙에 입금합니다.
15. 카테터를 제자리에 유지하면서 빈 주사기를 사용하여 카테터에 300 μL의 공기를 주입하여 폐에 렌티바이러스가 적절하게 분포되도록 하십시오.
16. 카테터를 제자리에 두고 폐활량계를 카테터에 다시 삽입합니다.
    참고 : PBS 버블의 상승과 하락은 절차가 성공하도록 합니다.
17. 카테터와 테이프를 제거합니다. 동물이 부활할 때까지 따뜻하고 건조한 곳에 놓습니다.

3. 마우스에 있는 폐 종양의 초음파 화상 진찰

참고 : 초음파 이미징은 재료 표에나열된 시스템을 사용하여 렌티 바이러스 삽관 7 및 18 주 후에 수행되었습니다. 그러나 모든 모델을 해석에 사용할 수 있습니다.

1. 이미징 하루 전에 삽관 된 마우스의 가슴 부위에서 털을 제거하십시오.
   참고 : 마우스는 3 % 이소플루란 과 2L / 분 O_2의유도 챔버에 배치하여이 단계 동안 진정되어야한다.
2. 이미징 당일 그림 2와같이 작업 영역을 설정합니다. 초음파 젤과 온도 모니터를 위한 가열 펌프를 켭니다.
3. 마우스를 화상 진찰 후 배치하도록 따뜻한 33°C 인큐베이터를 설치한다.
4. 3차원(3D) 모터(그림2F)를통합 레일 시스템에 놓습니다.
5. 3D 모터와 트랜스듀서 장착 시스템이 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
6. 기본 트랜스듀서 연결(주파수: 40MHz; 그림 2E 및 3D 모터에 수직인 종양 측정을 위한 재료 표)
7. 초음파 소프트웨어에 대한 새로운 연구를 시작하십시오.
   1. 스터디 브라우저를선택한 다음 화면 하단에서 새 브라우저를 선택합니다.
   2. 새 스터디를선택하면 연구 날짜, 연구원 이름 등에 대한 추가 정보 외에 연구 이름을 추가 할 수있는 새 창이 나타납니다.
   3. 계열 이름,즉 동물 ID, 변형균, 체중, 생년월일 등의 정보를 입력합니다.
   4. 완료를선택하면 프로그램이 B 모드로 변경됩니다.
8. 동물 플랫폼 위의 편리한 위치에 가열 램프를 넣어.
9. 유도 챔버 (3.5 % 이소플루란)에 마우스를 놓습니다.
   참고 : 적절한 마취는 마우스의 무의식과 2 초 당 약 1 호흡의 느린 호흡 속도에 의해 확인된다.
10. 마우스가 진정되면 마취기계의 연결을 동물 플랫폼쪽으로 바꾸고 이소플루란을 2.5%로 줄입니다.
11. 구강이 마취관을 향하여 향하여 미신 복부에 있는 동물 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
12. 마우스의 눈에 윤활제를 바르습니다.
13. 마우스를 등데살에 놓고 손과 발을 동물 플랫폼에 단단히 테이프로 고정시다.
14. 마우스 가슴에 초음파 젤의 작은 층을 적용합니다.
15. 높이 제어 노브를 사용하여 획득 프로브를 낮게 하여 마우스 가슴의 표면을 터치합니다. 마우스의 중심이 거의 중심이 되도록 프로브를 배치합니다.
16. 마이크로 노브를 사용하여 두 사지에서 마우스당 500 프레임을 이상적으로 수집하는 횡방향 방향으로 가슴 전체의 이미지를 수집합니다(프레임 수는 개인의 선택에 따라 다를 수 있음).
17. 이미징이 완료되면 마우스 가슴에서 젤을 제거하고 따뜻한 인큐베이터에 마우스를 놓습니다.

4. 초음파 이미지의 2D 분석

1. 초음파 소프트웨어에서 획득 한 프레임을 연 후 종양프레임을 스캔하십시오.
2. 작은 자극 종양의 경우, 획득 한 500 프레임의 전체 길이동안 주기적으로 10 프레임마다 B 라인의 수를 계산합니다.
   따라서 B 선은 총 50개의 이미지로 계산되고 각 이미지는 10프레임으로 구분됩니다. B 라인은 완전히 화면을 통과 세로 흰색 직선을 특징으로한다.
3. 큰 종양의 2D 측정을 위해, 선형 공구를 선택하고 존재하는 종양의 폭 그리고 길이를 측정하십시오.
4. 종양의 부피를 계산하려면 다음 공식을 사용하십시오.
   
   여기서 L과 W는 각각 종양의 길이와 폭입니다.

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결과

렌티바이러스 전염성 역가를 얻어 ~2 x 10 6 TU/mL(도 1), LSL-KRAS G12D 마우스가 적절한 연령(6-8주)에 도달했을 때 Ca2Cre-shp53 렌티바이러스를 경내 주사하였다(도1). 초음파 화상 진찰은 종양의 개시시 감염의 7 주 후에 수행되었습니다(그림 3B). 이미징은 LSL-KRAS^G12D 마우스 모델에서 발생하는 다양한 유형의 전구체...

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토론

우리는 초음파에 의한 Cre-유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모델에서 폐 종양 성장을 평가할 수 있는 방법을 입증한다. 이 방법은 폐 종양 성장에 대한 약리학적 억제제의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 유전 배경의 마우스 사이 폐 종양 성장을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 특수 한 계산 기술이 필요하지 않지만, 다른 마우스 그룹을 비교하는 데 사...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters	Pall Corporation	PN 4614
100-mm Cell Cultre Plate	CELLSTAR	664 160
6-well Cell Culture Plate	CELLSTAR	657 160
Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units	Merck Millipore Ltd.	UFC910024
BD LSR-Fortessa	BD Biosciences	649225B 3024
CA2Cre-shp53 lentiviral vector			From Dr. I Verma Laboratory
DMEM	Multicell	319-005-CL
FBS	Multicell	80450
LSL-KRASG12D mouse	JAX Mice	8179
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz	FUJIFILM VisualSonics	51070
OptiMEM	gibco	11058-021
Pen/strep	Multicell	450-201-EL
pMD2.G	Addgene	12259
PsPAX2	Addgene	12260
VEVO-3100	FUJIFILM VisualSonics	51072-50