근적외선 민감성 코어 쉘 백신 전달 플랫폼 생산

요약

이 문서에서는 지연된 버스트 릴리스를 가능하게 하기 위해 새로운 백신 전달 플랫폼인 "폴리버블"을 생성하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 폴리에스테르(젖산-공동 글리콜산) 및 폴리카폴락톤을 포함하는 폴리에스테르는 폴리버블을 형성하기 위해 사용되었고 소분자 및 항원은 화물로 사용되었다.

초록

새로운 방출 프로필을 가능하게 하면서 유기 용매에 화물의 노출을 제한할 수 있는 백신 전달 전략은 전 세계적으로 예방 접종 범위를 개선하는 데 매우 중요합니다. 여기서, 새로운 주사용, 자외선-치료 가능 및 지연된 버스트 방출-폴리버블이라는 백신 전달 플랫폼이 도입된다. 화물은 10% 카박스시메틸셀룰로오스-기반 수성 용액으로 형성된 폴리에스테르 기반 의 폴리버블에 주입되었다. 이 백서에는 폴리버블의 구형 형태를 유지하고 화물 배치 및 유지를 최적화하여 폴리버블 내화물의 양을 최대화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 안전을 보장하기 위해 중성자 활성화 분석을 사용하여 폴리버블 내의 염소 처리된 용매 함량을 분석하였다. 방출 연구는 지연 된 버스트 방출을 확인하기 위해 폴리 버블 내의화물로 작은 분자로 수행되었다. 화물의 온디맨드 납품 가능성을 더욱 보여주기 위해, 금 나노로드는 근적외선 레이저 활성화를 가능하게 하기 위해 폴리머 쉘 내에서 혼합되었다.

서문

제한된 예방 접종 적용은 백신 예방 가능한 질환^1로인한 3백만 명의 사망을 초래합니다. 부적절한 저장 및 운송 조건은 기능성 백신의 낭비로 이어지므로 글로벌 예방 접종을 줄이는 데 기여합니다. 또한, 필요한 백신 스케줄을 준수하지 않기 때문에 불완전한 예방 접종은 특히 개발도상국에서 제한된 백신 적용을 유발한다^2. 부스터 샷을 받는 데 권장되는 기간 내에 의료진을 여러 번 방문해야 하므로 완전한 예방 접종을 통해 인구의 비율을 제한할 수 있습니다. 따라서 이러한 과제를 우회하기 위해 통제 된 백신 전달을위한 새로운 전략을 개발할 필요가 있습니다.

백신 전달 기술 개발을 위한 현재의 노력에는 에멀젼 계 중고체 시스템^3,,4가포함된다. 그러나, 화물은 단백질 기반화물^5,,6의맥락에서 잠재적으로 응집 및 데아포화를 일으킬 수 있는 더 많은 양의 유기 용매에 종종 노출된다. 우리는 용매^7에노출되는 화물의 양을 최소화하면서 잠재적으로 여러화물 구획을 수용 할 수있는 새로운 백신 전달 플랫폼인 "폴리 버블"을 개발했습니다. 예를 들어, 폴리버블 코어 쉘 플랫폼에서 직경 0.38mm(SEM)의 화물 주머니 1개가 1mm 폴리버블의 중앙에 주입됩니다. 이 경우 유기 용매에 노출된 화물의 표면적은 약 0.453 mm^2입니다. 구체(화물창고) 내의 구체(마이크로입자)의 포장밀도를 고려한 후, 창고에 들어갈 수 있는 실제 미세먼지(직경 10μm)의 실제 부피는 0.17 mm^3이다. 하나의 미세 입자의 부피는 5.24x10^{-8mm 3이며,} 따라서 창고에 맞을 수있는 입자 미세 입자의 수는 ~ 3.2x10⁶ 입자입니다. 각 마이크로입자의 직경 0.25 μm의 20개의 화물 주머니(이중 에멀젼의 결과)가 있는 경우 유기 용매에 노출된 화물의 표면적은 1274mm^2입니다. 따라서 폴리버블 내의 화물 창고는 미세 입자에서 유기 용매에 노출된 화물에 비해 유기 용매에 노출되는 표면적 ~2800배 이하의 표면적을 갖게 된다. 따라서 폴리에스테르 기반 플랫폼은 유기 용매에 노출된 화물의 양을 잠재적으로 줄일 수 있으므로 화물 응집 및 불안정을 유발할 수 있습니다.

폴리버블은 유기상에서 폴리에스테르를 수성 용액으로 주입하여 구형 버블을 초래하는 위상 분리 원리에 기초하여 형성된다. 수성 상에서화물은 폴리 버블의 중심에 주입 될 수있다. 다른 화물 구획은 다른 화물과 폴리머 쉘을 혼합하여 폴리버블 내에서 잠재적으로 달성될 수 있습니다. 이 단계에서 폴리 버블은 가단될 것이고 중간에화물이있는 고체 폴리 버블 구조를 초래하기 위해 치료됩니다. 구형 폴리버블은 폴리버블의 전체 크기를 최소화하면서 폴리버블 내화물 용량을 늘리기 위해 다른 기하학적 모양에 선택되었습니다. 중앙에 화물이 있는 폴리버블이 지연된 버스트 방출을 시연하도록 선택되었습니다. 폴리버블은 또한 근적외선(NIR)-민감한(즉, 테라노스틱-가능하게 하는) 제제, 즉 금 나노로드(AuNR)와 통합되어 폴리버블의 온도 증가를 야기하였다. 이 효과는 잠재적으로 더 빠른 저하를 용이하게 할 수 있으며 향후 응용 프로그램에서 운동학을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문에서는 폴리버블의 형성 및 특성화, 폴리버블의 지연된 버스트 방출을 달성하고, 폴리버블 내에 AuNR을 통합하여 NIR 활성화를 유발하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

프로토콜

1. 폴리 카펠라시온 삼각삼국 (PCLTA) 합성

1. 건조 3.2 mL 의 400 다 폴리 카프라시온 (PCL) 트리올 은 오픈 200 mL 라운드 바닥 플라스크와 K₂CO_3에서 50 ° C에서 하룻밤 동안 유리 바이알에서 90 °C.
2. 트리오를 6.4mL의 디클로로메탄(DCM)과 4.246 g의 탄산칼륨(K2₂CO_3)과아르곤 산하에 섞는다.
3. Acryloyl 염화물 2.72mL을 DCM 27.2 mL에 혼합하고 5 분 이상 플라스크에서 반응 혼합물에 드롭 와이즈를 추가합니다.
4. 반응 혼합물을 알루미늄 호일로 덮고 아르곤 아래에서 24 시간 동안 실온에서 방해받지 않고 둡니다.
5. 24시간 후, 진공 아래 부흐너 깔때기에 필터 종이를 사용하여 반응 혼합물을 필터링하여 과도한 시약을 폐기한다.
6. 1단계에서 1.3(vol/vol) 및 로토바페에서 다이틸 에테르에 단막된 폴리머를 포함하는 1.5단계에서 여과를 침전하여 디틸 에테르를 제거한다.

2. 폴리 버블형성

참고: 디온화된(DI) 물에 폴리머를 주입하면 폴리버블이 유리병 바닥으로 이동하여 바닥이 평평해질 수 있습니다. 10% (wt/vol) 카복티메틸 셀룰로오스(CMC)를 사용하여 유리 바이알을 채우는 대신 폴리버블 플래밍을 방지합니다.

1. DI 워터에서 10%(wt/vol) CMC 솔루션을 준비합니다.
2. Fill a 0.92 mL glass vial with 0.8 mL of 10% CMC using a 1 mL transfer pipet.
3. 14kDa PCL의 1000 mg/mL을 DCM에 혼합하고 PCLTA를 1:3(vol/vol)에 1:3(vol/vol)로 합성하여 총 부피 200μL을 준비하거나 5kDa 폴리(젖소-공동-글리콜산) 디아크레이트(PLAGAD)의 1000 mg/mL를 준비한다.
4. 2-하이드록시-4′-(2-하이드록스테톡시)-2-메틸프로필피오페논(photoinitiator)을 고분자(PLGADA 또는 PCL/PCLTA) 혼합물과 0.005:1(vol/vol)에 섞는다.
5. 내경0.016인치의 디스펜싱 스테인리스 스틸 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착된 1mL 유리 주사기에 폴리머 혼합물 200 μL을 적재한다.
6. 마이크로모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전방 및 후진 운동을 제어하여 유리 유리병에서 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성한다.
7. 자외선(UV) 하에서 2W/cm^2에서60s의 자외선(UV)을 치료한다.
8. 플래시는 액체 질소에서 폴리 버블을 동결하고 0.010 mBar 진공 및 -85 °C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
9. 포셉을 사용하여 건조 된 CMC에서 폴리 버블을 분리하고 DI 물로 폴리 버블을 세척하여 잔류 CMC를 제거하십시오. 다른 폴리머는 방출 운동학을 변경하기 위해 수정과 함께 사용할 수 있습니다.

3. 폴리 버블 직경의 변조

1. Fill a 0.92 mL glass vial with 10% CMC using a 1 mL transfer pipet.
2. 1000mg/mL 14kDa PCL과 1:3(vol/vol)에 PCL/PCLTA를 혼합하고 PCLTA를 합성합니다. 광신염을 폴리머 혼합물과 0.005:1 (vol/vol)에 섞는다.
3. 고분자 혼합물을 0.016 인치의 내경을 가진 디스펜싱 스테인레스 스틸 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착 된 1 mL 유리 주사기에 적재하십시오.
4. 마이크로모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전방 및 후진 운동을 제어하여 유리 유리병에서 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성한다.
5. 다양한 직경의 폴리버블을 얻으려면 분주 속도가 0.0005에서 1 μL/s로 다양합니다.
6. 직경이 다른 폴리버블로 바이알의 이미지를 가져 가라.
7. ImageJ를 사용하여 폴리버블의 직경을 정량화하고 바이알크기를 스케일로 사용합니다.

4. 폴리버블 내화물 센터링

1. _K2CO_3를이용한 PCL/PCLTA 점도 변조:
   참고: PLGADA의 점도는_K2CO_3를 사용하여 수정할 필요가 없습니다.
   1. 추가 K₂CO₃ (PCLTA 반응 후 격리 된) PCLTA에 포함 하 여 다양 한 농도에서 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, 그리고 60 mg/mL.
   2. rheometry를 사용하여 전단 속도를 0에서 1000 1/s로 변경하여 솔루션의 동적 점도를 측정합니다.
   3. K2_CO3(Step 4.1.1)의 농도가 다른 PCL/PCLTA 용액을 이용하여 형성된 폴리버블의 중간에₂화물을 수동으로 주입한다(4.2단계). 4.1.1 단계에서 어떤 용액이 중간에 화물을 보유할 수 있는지 관찰하여_K2CO_3의 최적의 농도를 결정합니다.
2. CMC를 가진 화물의 중심 (이미 작은 분자와 타당성을 보여 주었다)
   1. 화물의 점도를 높이기 위해 하룻밤 동안 회전기에서 5 % (wt / vol) CMC와 화물을 혼합합니다.
   2. 폴리버블에 화물 혼합물 2μL을 수동으로 주입하고 2W/cm^2에서60s에 대한 254 nm 파장에서 UV 경화로 진행한다.
   3. 플래시는 30s용 액체 질소로 폴리버블을 동결하고 0.010mBar 진공 및 -85°C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
   4. 폴리버블을 포셉을 사용하여 말린 CMC로부터 분리하고 DI 물로 세척하여 잔류 CMC를 제거합니다.
   5. 폴리버블을 반으로 자르고 공초점 현미경 검사를 사용하여 반쪽을 이미지하여 화물이 중심이 되도록 합니다(발암 및 배출 파장의 경우 6단계를 참조).

5. 화물 제형

참고: 폴리버블 제형은 소분자, 단백질 및 핵산을 포함한 다양한 화물 유형을 수용할 수 있습니다.

1. 이전 연구에 따르면, 단백질 화물의 경우 폴리에틸렌 글리콜(PEG)^6,폴리비닐피로돈(PVP), 글리코폴리머(6)를 포함한 부형제를 사용하여 폴리버블 제형 시 단백질의 안정성을 향상시킨다.⁶
2. 2단계에서 프로토콜을 기반으로 폴리버블을 형성합니다.
3. 17.11 g의 트레할로오스를 HIV gp120/41 항원의 625 μL에 추가하여 항원 용액을 준비한다.
4. 폴리버블 중간에 항원 용액 1μL을 수동으로 주입합니다.
5. 일 0, 7, 14 및 21일에 폴리 버블을 열고, 각각 497 nm 및 520 nm, 내분 및 방출 파장 497 nm및 520 nm와 항원의 형광을 기록한다.
6. 효소-연결된 면역흡소벤트 분석(ELISA)을 사용하여 항원의 기능을 결정하고 5% 비지방 우유를 차단 완충제로 사용한다.

6. 화물의 방출

참고: 작은 분자 또는 항원은 화물 유형으로 사용될 수 있습니다.

1. 소분자
   1. 37°C에서 인산염 완충식염(PBS)의 400μL, PLGADA 폴리버블의 경우 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블용 70°C의 중심 아크리플라빈을 중심으로 한 폴리버블을 배양한다.
      참고: 우리가 체온 위에 시험하는 것이 좋습니다 이유는 a) PCL 및 PLGA 내의 금 나노로드 (AuNRs)를 레이저하는 동안 폴리 버블이 도달하는 온도 (50 °C)를 시뮬레이션하는 것입니다; 및 b) PCL (50 °C, 70 °C)의 분해 과정을 가속화한다.
   2. 매 번 초월제를 수집하고 400 μL의 신선한 PBS로 대체하십시오.
   3. 플레이트 판독기를 사용하여 수집된 수퍼나츠의 형광 강도를 정량화합니다.
      참고: 416 nm/514 nm의 전/em을 사용하여 acriflavine에 대 한.
2. Antigen
   1. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 400 μL, PLGADA 폴리버블의 경우 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블의 경우 50°C의 중심소 알부민 세럼(BSA)-488을 가진 폴리버블을 배양한다.
   2. 매 번 초월제를 수집하고 400 μL 신선한 PBS로 교체하십시오.
   3. 플레이트 판독기를 사용하여 수집된 수퍼나츠의 형광 강도를 정량화합니다. BSA-488에 497 nm /520 nm의 ex/em을 사용합니다.
      참고: PCL/PCLTA 폴리버블에 대한 70°C의 방출 연구는 항원이 극한의 온도에 노출되는 것을 피하기 위해 수행되어서는 안 됩니다.

7. 독성

1. 중성자 활성화 분석(NAA)을 사용하여 폴리버블의 염소 함량 정량화
   1. 이 연구를 위해 2, 4, 6, 20 및 24 h용 및 -85°C에서 lyophilized 된 폴리버블을 사용합니다.
   2. 5-9 mg의 폴리버블을 측정하고 LDPE 조사 바이알에 배치하십시오.
   3. 국가 표준 기술 연구소(NIST)-추적 가능한 교정 솔루션에서 염소 교정 솔루션 1000g/mL를 준비합니다.
   4. 1메가와트 트리가 반응기를 사용하여 중성자 연도율 9.1 × 10^{12/cm 2·s의}중성자 플루엔트(600s)에서 각 시료에 중성자 조사를 수행한다.
   5. 다발포를 조사되지 않은 바이알로 옮습니다.
   6. HPGe 검출기를 사용하여 360s 붕괴 간격 후 500s에 대한 감마선 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
   7. 캔버라 인더스트리에서 NAA 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
2. NAA를 사용하여 폴리버블에서 방출되는 염소 함량 정량화
   1. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 하룻밤 사이에 lyophilized 된 폴리 버블 (0.010 mBar 진공 및 -85 °C)을 배양하였다.
   2. 인큐베이션 후 1, 2, 3주에 초월자를 수집합니다.
   3. 상기 7.1단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 NAA를 사용하여 염소 함량에 대한 초월제를 분석한다.

8. 키틀러, S., 외.^8에 의해 AuNR 합성

1. 10m 클로로우리산(HAuCl_4),7.5mL의 100m mM 체트리모늄 브로마이드(CTAB), 10mm 얼음 냉간 나트륨 보로하이드라이드(NaBH_4)의600μL을 혼합하여 AuNR 파종 솔루션을 준비한다.
2. 100mM CTAB의 40mL, 10mM HAuCl_4의1.7mL, 은 질산250μL(AgNO_3),17.6 mg/mL 아스코르브산270 μL을 튜브에 혼합하여 성장 용액을 준비한다.
3. 종자 용액 420 μL을 1분 동안 1200rpm의 성장 용액과 적극적으로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 방해받지 않고 16 시간 동안 반응하게하십시오.
4. 혼합물에서 10분 동안 8000 × g에서 원심분리하여 혼합물에서 과도한 시약을 제거하고 상퍼를 폐기하십시오.

9. 솔리만, M.G., 외^9에 의해 AuNRs의 소수성

1. 합성 된 CTAB 안정화 AuNRs의 1.5 mL의 pH를 1 mMM 나트륨 수산화 (NaOH)를 사용하여 10으로 조정하십시오.
2. 0.1mM00m 메틸화 PEG(mPEG) 티올을 밤새 400rpm에 저어주세요.
3. PEGylated AuNRs와 0.4 M 도데딜라민 (DDA)을 클로로폼에 4 일 동안 500 rpm에 섞는다.
4. 소수성 AuNR을 포함하는 상단 유기 층을 피펫하고 나중에 사용할 때까지 4 °C에 저장합니다.

10. 폴리버블의 NIR 활성화

1. 폴리머(PLGADA 또는 PCL/PCLTA) 용액을 1:9(vol/vol)에 소수성 AuNR과 혼합합니다.
2. 0.005:1 (vol/vol)에 폴리머-AuNR 혼합물에 광신도를 추가합니다.
3. 폴리머-AuNR 혼합물을 0.92mL 유리 유리 바이알에 10% CMC(wt/vol)로 주입하여 폴리버블을 형성한다(2단계 참조).
4. 2W/cm^2에서60s의 254 nm 파장에서 폴리버블을 치료한다.
5. 30s용 액체 질소에 플래시동결하고 0.010 mBar 진공 및 -85°C에서 하룻밤 동안 lyophilize합니다.
6. 세척을 사용하여 말린 폴리 버블을 분리하고 DI 물로 세척하여 잔류 CMC를 제거하십시오.
7. 37°C에서 PBS의 400 μL에서 폴리버블을 배양한다.
8. 매주 월요일, 수요일, 금요일 에 8A에서 801 nm NIR 레이저를 사용하여 폴리 버블을 활성화합니다.
9. 레이저 활성화 전후의 폴리버블의 미래 지향적 적외선(FLIR) 이미지를 가져와 온도 값을 얻습니다.
10. FLIR 이미지의 온도 값에 따라 레이저 활성화 전후의 온도 차이를 계산합니다.

결과

폴리버블은 SEM과 NAA를 사용하여 광범위하게 특징지어졌습니다. 화물은 성공적으로 지연 된 버스트 릴리스의 결과로 중심이되었다. 폴리버블은 또한 폴리버블 내에 AuNRs가 존재하기 때문에 성공적으로 레이저 활성화되었다.

폴리버블 특성화
CMC 없이 수성 용액에 주입된 다발포기는 유리 바이알의 바닥과의 접촉...

토론

현재 기술 및 과제
에멀젼 계 마이크로 및 나노 입자는 일반적으로 약물 전달 캐리어로 사용되어 왔다. 이러한 장치에서 화물의 방출 역학은 광범위하게 연구되었지만, 버스트 방출 역학을 제어하는 것은 주요 도전이었다^11. 화물의 다기능성과 기능은 또한 과도한 수성 및 유기 용매에 대한 화물의 노출로 인해 에멀젼 기반 시스템에서 제한됩니다. 단백질 기반화?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010