마우스의 힌들보에서 보조 림프부종을 유도하기위한 개정 된 방법

요약

이 동물 모델은 연구원이 적어도 8 주 지속되는 마우스의 뒷다리에 있는 통계적으로 유의한 이차 림프부종을 유도하는 것을 가능하게 합니다. 이 모델은 림프부종의 병리생리학을 연구하고 새로운 치료 옵션을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

동물 모형은 질병의 병리생리학을 이해하기 위하여 림프부종의 연구에서 가장 중요하고 또한 잠재적인 처리 선택권을 탐구하기 위하여. 이 마우스 모형은 연구원이 적어도 8 주 지속되는 중요한 림프부종을 유도하는 것을 허용합니다. 림프부종은 분별 된 방사선 요법과 림프의 외과 적 절제의 조합을 사용하여 유도됩니다. 이 모형은 마우스가 수술 전후에 10 회색 (Gy) 방사선의 복용량을 얻을 것을 요구합니다. 모델의 외과 부분은 3 개의 림프관의 결찰과 마우스 뒷다리에서 두 개의 림프절추출을 포함합니다. 마우스의 작은 해부학 적 구조로 인해 미세 수술 도구와 현미경에 액세스 하는 것은 필수적이다. 이 모델의 장점은 다른 치료 옵션을 평가하기위한 좋은 기초를 제공하는 통계적으로 유의한 림프부종을 초래한다는 것입니다. 그것은 또한 미세 수술 훈련에 대 한 중대 하 고 쉽게 사용할 수 있는 옵션. 이 모델의 제한사항은 특히 사전에 실행하지 않은 경우 프로시저가 시간이 많이 소요될 수 있다는 것입니다. 이 모델은 쥐에서 객관적으로 정량화 할 수있는 림프부종을 초래하며, 심각한 이환율을 일으키지 않고 세 가지 별도 프로젝트에서 테스트되었습니다.

서문

림프부종은 주로 림프관에서 림프액의 손상 또는 중단 된 흐름으로 인해 발생하는 국소 조직 부종으로 이어지는 림프액의 축적을 특징으로합니다^1. 림프 흐름은^림프계의감염, 방해, 부상 또는 선천적 결함에 의해 손상되거나 중단 될 수 있습니다 2 . 이러한 병인은 림프액의 축적을 초래하여 만성 염증 상태로 이어져 후속 섬유증뿐만 아니라 지방 조직의 침착을 초래합니다^3. 림프부종은 1 차 또는 이차 림프부종으로 분류 될 수있다. 1차 림프부종은 발달 이상 또는 유전적^{돌연변이에}의해 유발된다^2,4. 이차 림프부종은 근본적인 전신 질환, 수술 또는 외상으로 인해^발생2,4. 이차 림프부종은^세계2에서 림프부종의 가장 일반적인 형태입니다. 선진국에서는 보조 림프부종의 가장 흔한 원인은 보조 방사선 요법 및 림프절 해부^5와같은 종양학 치료입니다. 림프부종은 유방암 환자 중 가장 빈번하지만 부인과 환자, 흑색종, 비뇨 생식기 또는 목암 환자에서 발병할 수도^{있습니다 6.} 유방암으로 진단 된 모든 여성 중 21 %가 림프부종을 개발할 것이라는 것이 제안되었습니다⁷.

림프부종은 환자에게 신체적, 심리적으로 스트레스를 받을 수 있습니다. 림프부종을 가진 환자는 감염의 증가한^{리스크가 5,8,9,}삶의 질이 좋지 않으며 사회적인 불안 및 불경기의 현상을 개발할 수 있습니다^10. 만성 림프부종의 합병증은 높은 치료 비용과 증가 된 질병^부담으로이어진다^9,11. 사실 인정은 또한 림프부종이 유방암 처리 후에 죽음의 증가한 리스크와 연관될 지도 모르다는 것을 건의했습니다^12. 영향을받는 지역의 압축, 수동 림프 배수 및 일반 스킨 케어와 같은 보수적 인 관리가 첫 번째 라인 접근 방식입니다. 현재 치료 치료는 없습니다⁶. 외과 및 의학 치료 분야에서 진전이 있었지만 여전히 개선의 여지가 있습니다. 질병의 병리생리학 및 진행에 대한 통찰력을 제공하는 더 많은 연구가 임상의가 환자에게 더 나은 치료 옵션을 제공 할 수 있도록하는 데 필요합니다^5.

동물 모델은 질병의 병리생리학을 이해하고 잠재적인 치료 옵션을 개발하기 위해 전임상 연구에서 사용되고 있습니다. 여러 가지 림프부종 동물 모델은 개^13,14,토끼^15,양^16,돼지^17,18 및 설치류^{19,20, 21,22},^23,24. 설치류 모델은 설치류가 쉽게 접근 할 수 있고 상대적으로 저렴한^25로인해 림프 기능의 재구성을 조사 할 때 가장 비용 효율적인 모델인 것으로 보입니다. 마우스 모델의 대다수는마우스^21,22,23의꼬리에 림프부종을 유도하는 데 초점을 맞추고 있다. 꼬리 모형은 아주 믿을 수 있습니다 그러나 림프부종을 유도하기 위한 정확한 외과 기술은 이전에 간행된 물자에서 현저하게 변화합니다. 이는 공지된 litterature^25에제시된 개발된 림프부종의 지속 기간 및 견고성의 변동을 초래한다. 다른 기술은 또한 뒷다리 모형에 있는 림프부종을 유도하기 위하여 이용되고 있고 또한 다양한 결과를 산출합니다, 그러나 뒷다리 모형은 번역관점에서 이해하기 쉬울지도 모릅니다. 이전 림프부종 모델은 자발적인 림프부종 분해능에 의해 방해를 받았기 때문에 재현 가능하고 영구적인 림프부종 모델이²⁵필요합니다. 연구원은 이전에 방사선의 복용량을 증가 하려고, 자발적인 림프 부 종 해상도 방지 하기 위해, 하지만이것은 종종 후속 심각한^이환25.

이 모형은 방사선과 미세 수술을 결합하여, 가혹한 이환율을 일으키는 원인이 되지 않고, 통계적으로 유의한 림프부종을 초래합니다. 이 모델은 심한^{이환율(26)을}유발하지 않고 림프부종을 유발하는 조사 용량을 추가하여 이전 수술 모델에서 개정되었습니다. 또한 미세 수술 훈련을위한 좋은 기회를 제공합니다. 마우스의 작은 해부학 적 구조로 인해 미세 수술 장비와 현미경에 액세스 할 필요가 있습니다. 외과 적 수술은 사용자가 미세 수술 기구로 봉합하는 것과 같은 기본적인 미세 수술 기술을 배웠을 때 수행 될 수 있습니다. 이 절차를 수행 한 운영자는 모두 미세 수술 기술 (1981)과 기본 미세 수화 기술 (1985)의 전제 조건에 Acland에 의해 튜토리얼 비디오를 보았다. 우리는 연구에 사용하기 전에 외과 적 수술을 8-10 번 연습하는 것이 좋습니다. 절차를 연습하면 실수가 줄어들고 절차를 보다 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 마스터하면 45 분 안에 외과 적 수술을 수행 할 수 있습니다.

프로토콜

동물은 기관 지침에 따라 남부 덴마크 동물 관리 시설의 대학에 보관되었다. 동물 과목과 관련된 모든 절차는 덴마크 환경 식품부 동물 실험 검사관의 승인을 받았습니다.

1. 수술 전 조사

참고: 수술 전 조사는 수술 7일 전에 이루어집니다.

1. 마취를 유도.
   1. 유도 상자에 마우스를 놓고 흡입 마취를 유도하는 0.8-1.2 L /min의 산소 유량으로 기화기를 3 %의 이소플루란으로 설정합니다.
      참고 : 또는 주사용 마취제를 사용할 수 있지만 흡입 마취를 유도하는 조사의 짧은 기간 동안 충분했습니다. 이 문서에 제시 된 결과 얻기 위해, 9 주 된 여성 C57BL6 마우스를 사용 했다.
   2. 마우스가 꼬리 또는 발 핀치 테스트로 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
2. 조사를 위해 마우스를 배치합니다.
   1. 완전히 진정되면 유도 상자에서 마우스를 이동하고 방사원 아래에 놓고 테이프로 뒷다리를 부드럽게 고정시십시오.
      참고: 마우스는 방사선의 짧은 기간 동안 진정된 상태로 유지됩니다.
   2. 1.5mm 두께의 리드 패드를 배치하여 수술을 받는 부위(즉, 무릎 주위 직경 25mm의 원형 영역)만 조사되도록 합니다.
3. 5.11 Gy/min (100 kVp, 10 mA)의 용량 속도로 10 Gy 방사선을 투여하십시오.
   주의: 방사선 작업 시 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 이 실험 동안 모든 방사선 절연 실에서 모든 방사선 조사가 수행되었으며 모든 직원이 방을 떠나 봉인 했을 때만 방사선원이 켜졌습니다.
4. 마우스를 케이지에 다시 놓습니다.

2. 장비 설정

참고 : 수술은 외과 적 수술 전용 방에서 수행해야합니다. 작동 표면은 멸균되어야 합니다.

1. 70% 에탄올로 모든 작동 표면을 철저히 청소하십시오. 헤어넷과 커버올을 착용합니다. 멸균 수술 기구와 멸균 장갑을 사용하십시오.
2. 마취를 준비하십시오.
   1. 펜타닐 1 mL(0.315 mg/mL), 미다졸람 1mL(5 mg/mL), 멸균수 2mL를 그립니다. 다른 구성 요소에 대해 다른 주사기와 바늘을 사용하십시오.
   2. 펜타닐과 멸균 수를 천천히 멸균 유리 튜브에 주사기를 비우십시오. 혼합할 때 midazolam을 추가하여 작업 용액을 완성하십시오.
3. 진통제를 준비하십시오.
   1. 부프레노르핀 0.2 mL(0.3 mg/mL)과 식염수 2 mL를 그립니다.
   2. 주사기를 멸균 유리 튜브에 천천히 비우고 부피를 혼합하여 작동 용액을 완성합니다.
4. 현미경을 켜고 조명이 충분한지, 그리고 현미경이 작업자의 눈에 잘 조정되었는지 확인하십시오.
   참고 : 모든 외과 적 수술은 수술 현미경으로 수행해야합니다. 4x-25x의 배율 범위는 충분합니다.

3. 준비

1. 마우스를 클리어된 눈금으로 빈 용기에 넣어 수술 전 마우스의 무게를 측정합니다.
2. 마취제를 투여하십시오.
   1. 마우스 체중 10 g당 0.1 mL의 마취제를 그립니다. 볼루스 주사로 피하 마취제를 주입.
   2. 마우스를 침구가 충분한 케이지에 넣고 완전히 진정될 때까지 약 10분 동안 보호합니다. 근육 이완을 평가하여 마취 깊이를 검사하고 발 또는 꼬리 핀치 테스트를 수행합니다.
3. 완전히 진정되면 전기 클리퍼를 사용하여 절차에 선택한 뒷다리를 면도하십시오. 여분의 머리카락을 닦아주세요.
4. 가열 패드와 같은 가열 장치를 켜고 수술용 천으로 덮습니다.
5. 산소의 흐름을 0.8 L/min으로 설정하고 노코콘과 연결합니다. 100 % 산소를 사용하십시오.
   참고 : 노코콘은 산소 전달을위한 것이지 마취가 아닙니다.
6. 안과 연고를 바르고 식염수 0.5 mL을 피하주사, 바람직하게는 수술 중 저혈당을 예방하기 위해 마우스의 목덜미에 주입하십시오.
7. 수술을 위해 마우스를 놓습니다.
   1. 수술용 천에 마우스를 놓습니다. 주전자 위에 노코콘을 놓습니다.
   2. 수술 중 마우스가 이동하는 것을 방지하기 위해 테이프로 뒷다리의 끝을 부드럽게 고정하십시오.
   3. 알코올/클로르헨시딘 또는 알코올/포비동 요오드를 사용하여 피부를 살균하십시오.

4. 수술

참고: 이 예제에서는 왼쪽 뒷다리(마우스가 척추 위치에서 볼 때)가 절차에 대해 선택되었습니다.

1. 원형 절개를 합니다.
   1. 매끄러운 집게로 피부를 들어 올리고 포퓰리터 포사에 약 5mm 근사한 작은 구멍을 클립.
   2. 날카로운 가위를 개구부로 밀어 무릎 쪽으로 잘라 절개가 무릎 바로 위에 끝나게 합니다. 클리핑하는 동안 집게로 피부를 들어 올려 기본 혈관에 구멍을 뚫지 않도록하십시오.
   3. 마우스를 경향이 있는 위치로 이동하고 원주 절개가 완료될 때까지 무릎에서 포퓰럴 포사쪽으로 계속 클립합니다.
2. 무릎 아래 피부를 해부하십시오.
   1. 부드럽게 무딘 발목 위의 몇 밀리미터에 무릎 아래 영역을 해부, 천천히 열고 집게로 피부를 들어 올리는 동안 마이크로 사이저를 닫습니다.
   2. 미세자극을 사용하여 눈에 보이는 접착력을 조심스럽게 잘라내소. 멸균 식염수로 정기적으로 사용하여 전체 시술 중에 조직을 촉촉하게 유지하십시오.
3. 원주 절개의 근위 림에서 피부를 해부하여 탄성 리트랙터로 후퇴 할 수 있도록하십시오.
   참고: 리트랙터를 통해 작업자는 근위 림프혈관을 더 잘 볼 수 있으며 수술 중 근위 림이 이동하는 것을 방지합니다.
4. 여전히 경향이 있는 위치에 있는 동안, 뒷다리를 부드럽게 회전하고 테이프로 고정하여, 이스키아성 정맥이 노출된 영역의 가장 근접한 지점에서 가장 말단지점까지 보이도록 합니다.
5. 30 G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 두 번째와 세 번째 발가락 사이에 약 0.01 mL의 특허 Blue V를 피하주입합니다. 특허 블루 V. 특허 블루 V가 림프혈관을 채울 때 현미경을 통해 림프관과 림프절을 시각화하기 위해 발을 몇 번 부드럽게 누릅니다.
   참고 : 시술 중에 림프관의 파란색이 퇴색하면 발을 부드럽게 마사지하여 흡수를 촉진하십시오. 절차를 손상시면 됩니다.
6. 중요한 구조를 찾습니다 : 포피 라이트 림프절 (PLN), 림프절 (DLV1 및 DLV2)에 대한 두 개의 림프관, 림프절 (PLV)에 가까운 하나의 림프관.
   참고 : 모든 림프관은 이스키아성 정맥에 인접한 곳에서 발견 될 수 있습니다. 근위 림프용기는 일반적으로 정맥내 측위를 발견하고, 두 개의 말단 림프관은 정맥내 및 측측측편에서 발견된다. 구조의 약어는 함께 제공되는 비디오에서 사용됩니다.
7. PLV를 명확하게 시각화하고 마이크로 니들 홀더와 마이크로 포스를 사용하여 10-0 나일론 봉합사로 돋보이게합니다. 발을 몇 번 눌러 특허 Blue V가 봉합사에 근접을 통과하지 않도록합니다.
   참고 : 림프혈관을 둘러싼 지방을 다듬는 것이 필요할 수 있습니다.
8. 2개의 말단 림프관을 리게이트하기 위하여 단계 4.7를 반복합니다. 발을 여러 번 눌러 특허 블루 V가 합자에 근접하게 전달되지 않도록 합니다. 림프관이 이스키아성 정맥에 가깝게 거짓말을하면 해부하십시오.
   참고 :이 예에서는 림프 흐름을 방해하는 합자로 인해 림프 관 중 하나가 파열되는 것을 볼 수 있습니다. 림프관은 종종 정맥에서 더 아래로 갈라집니다.
9. 포물성 림프절을 제거합니다.
   1. popliteal 림프절을 찾아 그것을 액세스하고 마이크로 포스와 마이크로 시저로 제거하기 위해 마이크로 시저와 작은 구멍을 클립.
      참고 : 림프절은 주변 지방 조직과 는 대조적으로 매끄러운 진주 와 같은 표면을 가지고 있습니다.
   2. 제거 된 조직이 림프절인지 테스트하려면 물로 채워진 시험관에 놓습니다.
      참고 : 조직이 지방으로 구성되어 있으면 조직이 떠 있습니다. 조직이 림프절인 경우 바닥으로 가라 앉습니다.
10. 잉구 지방 패드와 림프절을 제거합니다.
    1. 잉구인 지방 패드를 제거하기 전에 양극성 응고기를 사용하여 지방을 통과하는 혈관을 소작시하십시오.
    2. 마이크로포스와 마이크로시저를 사용하여 잉구인 지방 패드를 절제합니다. 지방을 통해 흐르는 소작 된 혈관을 부드럽게 잘라냅니다. 그런 다음 관인 부위의 지방 조직을 부드럽게 절제하십시오.
       참고 : 지방에위치한 림프절은 거의 특허 블루 V에 의해 착색되지 않으며 지방과 구별하기 어려울 수 있습니다. 한 조각에 지방 패드를 제거하는 것은 림프절이 제거되었는지 확인하는 가장 좋은 방법입니다.
11. 멸균 식염수로 다리를 철저히 헹구고 현미경을 통해 작은 머리카락과 입자가 상처 오염 및 감염을 피하기 위해 수술 부위에서 완전히 제거되었음을 확인하십시오. 활성 출혈이 없는지 확인하십시오.
12. 집게와 바늘 홀더를 사용하여 6-0 나일론 봉합사로 근육 근막까지 피부 가장자리를 봉합하고 표면 림프 흐름을 제한하기 위해 2-3mm의 간격을 둡습니다.
    참고: 함께 제공되는 비디오에는 완성된 봉합사의 예가 표시됩니다.
13. 진통을 관리하십시오. 마우스 체중 30 g 당 진통의 0.1 mL를 그립니다. 볼루스 주사로 피하 진통을 주입.
14. 비교를 위해 수술 후 마우스를 무게.
15. 회복을 위해 가열된 캐비닛에 마우스를 케이지에 놓습니다.

5. 수술 후 치료

1. 마우스에게 물과 음식 광고 리비텀수술 후 회복할 수 있도록 개별 케이지를 주세요.
2. 진통을 위해 매일 3x buprenorphine의 0.02 mL의 볼루스 피하 복용량을 관리하십시오.
3. 적절한 상처 치유, 통증과 감염의 징후를 위해 매일 동물을 모니터링하십시오. 감염의 징후가 나타나면 항생제 연고를 사용하십시오.

6. 수술 후 조사

1. 수술 3 일 후, 수술 전 조사 절차를 반복하십시오 (단계 1.1-1.4).

결과

이 절차는 이전에 세 가지 별도 실험에서 사용되었습니다. 모든 실험은 모두이 문서의 공동 저자 다른 수석 조사자에 의해 만들어졌다. 세 가지 실험 모두에서 이 프로토콜에 설명된 것과 동일한 절차를 준수하기 위해 세심한 주의를 기울였습니다. 모든 3개의 실험에서, 이차 림프부종은 다른 뒷다리가 대조군으로 봉사하는 동안 1개의 뒷다리에 유도되었습니다. 뒷다리의 ...

토론

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 방사능으로 작업할 때 연구원들이 안전 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 둘째, 이 프로토콜의 수술 부분 동안 마우스가 마취되면 절차를 시작하고 불필요한 휴식없이 완료하는 것이 중요합니다. 이것은 동물을 위한 지나치게 긴 수술 기간을 피하고 마취가 수술 도중 효력을 분실하는 것을 방지하기 위하여 중요합니다. 마취제의 볼루?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb