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요약

이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.

초록

고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1(HPAI H5N1) 및 H7N9를 인간에게 직접 적으로 전달하는 것은 심각한 공중 보건 문제이며 전염병의 가능성을 시사한다. 그러나, 바이러스의 우리의 분자 이해는 기초적이고, 그것의 봉투 단백질의 생물학 속성을 치료 표적으로 공부하고 감염을 통제하는 전략을 개발하는 것이 필요합니다. 우리는 그것의 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 봉투 당단백질, HA 및 NA의 재분류 특성의 기능 분석을 포함하여 조류 인플루엔자 바이러스를 연구하는 고체 바이러스 성 가성 입자 (pp) 플랫폼을 개발했습니다. 수용체, 트로피즘, 중화 항체, 진단, 감염, 약물 개발 및 백신 설계의 목적을 위해. 여기서, 우리는 2개의 인플루엔자 A 균주(HAPI H5N1 및 2013 조류 H7N9)로부터 엔벨로프 당단백질(HA, NA)을 가진 pps를 확립하는 실험 적 절차를 기술한다. 그들의 생성은 pp에 봉투 당단백질을 통합하기 위하여 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)와 같은 몇몇 바이러스의 수용량에 근거를 두었습니다. 또한 이러한 pps가 RT-qPCR로 정량화되는 방법, 그리고 H및 NA의 기원에 따라 네이티브 및 불일치 바이러스 pps의 감염 성 검출방법을 자세히 설명합니다. 이 시스템은 매우 유연하고 적응력이 있으며 봉투 당단백질로 바이러스 pps를 확립하는 데 사용할 수 있으며 다른 유형의 봉투 바이러스에 통합 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 바이러스 성 입자 플랫폼은 많은 연구 조사에서 야생 바이러스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

바이러스 입자의 임무는 감염된 숙주 세포로부터 비감염숙주 세포로 게놈을 수송하고 이를 복제 유능한 형태1에서세포질 또는 핵으로 전달하는 것이다. 이 프로세스는 처음에 호스트 세포 수용 체에 바인딩에 의해 트리거됩니다., virion와 세포 막의 융합 다음. 인플루엔자 바이러스와 같은 포위 된 바이러스의 경우, 스파이크 당단백질은 수용체 결합 및 융합1,2를담당합니다. Viral envelope glycoproteins (e.g., pyrogens, antigens), are involved in many important properties and events, such as virus lifecycle initiation (binding and fusion), viral pathogenesis, immunogenicity, host cell apoptosis and cellular tropism, the cellular endocytic pathway, as well as interspecies transmission and reassortment1,3,4,5,6,7. 바이러스 성 봉투 당단백질에 대한 연구는 바이러스 감염 과정의 많은 측면을 이해하는 데 도움이됩니다. 의사형 바이러스 입자(pp)는 또한 의사 입자 또는 의사 입자라고도 하며, 가성 화 기법을 통해 생성될 수 있다8,9,10. 이 기술은 C형 간염11,12형,B형 간염13형,수포성 구내염 바이러스(VSV)14, 15,및 인플루엔자 바이러스16,17,18,19를포함한 많은 바이러스의 가성 입자를 개발하는 데 사용되어 왔다. 이 기술은 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스의 개그폴 단백질을 기반으로 합니다.

가성형 바이러스 입자는 바이러스 봉투 당단백질 발현 플라스미드, 봉투 env 유전자를 누락한 레트로바이러스 패키징 플라스미드, 및 pp 생산자 세포내로의 별도의 리포터 플라스미드를 교전시킴으로써 3-플라스미드 시스템을 사용하여 수득될 수 있다. 레트로바이러스는 개그 단백질에 의해 조립되고, 바이러스 봉투 단백질1을발현하는 감염된 세포막에서 싹이 나고 있다. 따라서, 레트로바이러스 개그 단백질을 이용하여 고역인플루엔자 pps를 획득하여 인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 세포막상에서 싹을 생성할 수 있다. 우리의 이전 연구에서, 모든 조합의 HA /NA는 기능적이었고 바이러스 성 수명 주기16,17,18,20,21에서해당 기능을 수행 할 수 있었습니다. 이러한 pps는 hemagglutination, neuraminidase 활동, HA 수용체 결합 트로피즘, 및 감염을 포함하는 인플루엔자 생물학적 특성을 조사하기 위해 사용된다. HA와 NA는 바이러스 성 수명 주기에서 중요한 표면 기능성 단백질이기 때문에, 인플루엔자의 다른 변종에서 파생된 불일치하는 HA 및 NA는 부분적으로 그들 사이의 재분류를 입증할 수 있습니다. 여기서, 우리는 2개의 하스와 2개의 NA (HPAI H5N1 긴장 및 H7N9 얼룩에서 파생된)를 결합하여 8가지 유형의 인플루엔자 pps를 생성합니다. pps의 이 8가지 모형은 2개의 네이티브 pps, H5N1pp, H7N9pp를 포함합니다; 두 개의 일치하지 않는 PPS, (H5 + N9)pp, (H7 + N1)pp; 단일 당단백질(HA 또는 NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. H5N1 및 H7N9와 같은 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 생체 안전성 요건에 의해 제한됩니다. 야생 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 모든 연구는 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서 수행되어야합니다. 가성형 바이러스 입자 기술은 생체 안전 도 2(BSL-2) 설정에서 인공 비리온을 패키징하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 pps는 두 가지 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)에 따라 인플루엔자 바이러스 과정을 연구하는 보다 안전하고 유용한 도구를 나타냅니다.

이 프로토콜은 3-plasmid cotransfection 전략(그림 1에서검토됨), pps를 정량화하는 방법 및 감염성 검출을 통해 이러한 pps의 생성을 설명합니다. pp 생산에는 플라스미드의 3가지 종류가 포함됩니다(그림1). 레트로바이러스 개그폴 단백질을 인코딩하는 개그폴 유전자는 레트로바이러스 패키징 키트에서 복제하여 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입하고 PCDNA-Gag-Pol로 명명하였다. 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자는 pTRE-EGFP 벡터에서 복제되고 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입되고 pcDNA-GFP라고 합니다. 복제 동안, 패키징 신호(θ) 시퀀스가 프라이머를 통해 첨가되었다. HA 및 NA 유전자는 각각 pVRC-HA 및 pVRC-NA라는 pVRC 플라스미드로 복제되었다. 마지막 플라스미드는 융합 단백질을 인코딩하고 관심 있는 임의의 다른 융합 단백질로 대체할 수 있다. 우리의 의사 티핑 플랫폼은 두 개의 당단백질 발현 플라스미드를 포함합니다: pVRC-HA 및 pVRC-NA. 이 BSL-2 설정에서 다른 바이러스 긴장 사이 재분류에 대 한 연구를 단순화할 수 있습니다.

프로토콜

1일차: 세포 배양 및 시팅

  1. 인간 배아 신장(HEK) 293T/17 세포를 60mm 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신(DMEM Complete Medium) 으로 보충하여 변형된 필수 배지(DMEM)를 사용하여 배양합니다. DCM)을 37°C에서, 5%이산화탄소(CO2)에서약 80% 까지 인큐베이터에 있다.
    참고 : HEK 293T / 17 낮은 통로 세포를 권장합니다.
  2. 인산완식염(PBS) 1x 5 mL로 조심스럽게 세포를 세척합니다.
    참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다.
  3. PBS를 제거하고 0.25% 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액의 1 mL로 세포를 해리. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓고 세포가 해리될 때까지 5분 이상 동안 배양합니다.
  4. DCM의 5 mL을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.
  5. 세포 현탁액을 미리 냉각된 15 mL 원심분리기로 옮김을 옮김. 4°C에서 5분 동안 250 x g에서 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
  6. 가능한 한 상급의 많은 장식. DCM 배지의 6 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포를 계산합니다. DCM 배지로 세포를 1 x 106 셀/mL로 희석합니다.
  7. 세포를 잘 당 1 mL의 세포 현탁액으로 6 웰 플레이트에 시드합니다. 접시를 가볍게 두드려 세포를 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.

2. 2일차: 리포페션에 의해 중재된 4-플라스미드 코트랜스펙션

  1. 반전된 광 현미경의 밑에 세포 형태 및 조밀도를 확인하십시오. 이상적으로, 세포는 형질 전환에 대략 85% 수렴되어야 합니다. 배지를 잘 당 1 mL의 무혈청 DMEM 배지로 교체한 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다.
  2. 배양된 각 웰에 대해 형질전환 시약의 8 μL을 감소된 혈청 배지(튜브 1)로 150 μL의 부피로 희석한다. 부드럽게 섞고 실온(RT, 약 20°C)에서 5분간 배양합니다.
    참고: 각 형질감염 샘플에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 2개(번호 1 및 2)를 준비합니다.
  3. 튜브 2에서, 플라스미드 DNA 2.5 μg을 150 μL의 감소된 혈청 배지로 희석한다.
    참고: 튜브 2에서 표 1과같이 각 플라스미드 DNA를 희석합니다. VSV가 광범위한 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 플라스미드 인코딩 된 혈관 성 질염 바이러스 (VSV) G 당단백질 (플라스미드 pLP-VSVG)은 양성 대조군으로 사용되었습니다. 인플루엔자 봉투 당단백질(Δenv pps)이 부족한 음성 대조군 입자는 pcDNA-개그-폴 및 pcDNA-GFP 플라스미드를 사용하여 생성되었다.
  4. 5 분 배양 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 감염 시약과 결합하십시오. 부드럽게 섞고 RT에서 15분 간 더 배양하세요.
  5. DNA-지질 복합체를 세포 및 무혈청 배지를 함유하는 상응하는 웰에 첨가한다. 접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞어주세요.
  6. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, DMEM의 2 mL로 대체하였다. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 36-48시간 동안 배양한다.
    참고: 혈청이 없고 항체가 없는 DMEM으로 교체하십시오. 이 프로토콜에서는 두 개의 하와 2개의 NA를 사용하여 8가지 유형의 pps를 생성할 수 있습니다(표 1에표시됨).

3일차: 세포 파종

  1. 감염성 분석의 경우, 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포에서 감염되기 쉬운 세포의 각 유형을 시드합니다.
    참고 : 이 기사에서 감염성 분석기를 수행하기 위해 두 가지 유형의 표적 세포를 사용합니다: 폐포 유래 인간 세포주 (A549 세포) 및 Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포. MDCK 세포는 인플루엔자 연구에 널리 사용되며 좋은 대조군이 될 수 있다. 이 단계는 유연합니다. 다른 표적 세포주들은 연구 요건에 따라 사용될 수 있다.
  2. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.

4. 4 일: 가성 형바이러스 입자 수집, 정량화 및 감염성 분석

  1. 가성형 바이러스 입자 수집
    1. 매체의 색상을 확인합니다. 이상적으로는 밝은 분홍색 또는 약간 주황색이어야합니다. 440-460 nm 의 거꾸로 형광 생물학적 현미경으로 세포를 검사합니다.
    2. 36-48 시간 후 변형에서 0.45 μm 폴리 비닐 리덴 불소 (PVDF) 멤브레인 필터를 통과하여 pps를 수확하여 세포 이물질을 제거합니다.
    3. pps를 작은 볼륨 aliquots로 나눕니다.
    4. pps를 -80 °C에 보관하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 그러나, 이것은 권장되지 않습니다, pps의 감염은 동결 및 해동 후 급격히 감소하기 때문에.
  2. 가성형 바이러스 입자 정량화
    1. 정제된 pps 20 μL을 1.5 mL 리보누클리스(RNase)가 없는 미세원심지 튜브로 옮니다.
    2. 0.24 U/mL 벤조나아제 뉴클레아제 1 μL을 첨가합니다. DNA 및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C에서 배양합니다.
      참고: 표적 RNA, 일반적으로 하향 조절된 사이토메갈로바이러스 (CMV)-GFP RNA는 pps에서 포장되고 벤조나제 뉴클레아제에 의해 저하되는 것을 피할 수 있습니다.
    3. 벤조나아제 뉴클레아제에 대해 -70°C에서 시료를 동결.
    4. 봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출하기 위해 30 분 동안 50 °C에서 2 μL의 단백질 분해제 K. 인큐베이터를 추가하십시오. 100°C에서 3분 동안 단백질나제 K를 비활성화한다.
    5. 범용 프로브 1단계 RT-qPCR 키트를 사용한 실시간 정량적 역전사(qRT)-PCR로 pps를 정량화하고, 전방 프라이머 5'-AACAAAGAGCTGGATTTTTTTTTAA-3', 역방향 프라이머 5'-GGGTCTCCTCAGAGGATTAGAC-3', 프로브 5'-FAM-CCCCCAAAAGACCCCCCGAG-TAM-3', 실시간 PCR 열자전거. 감염 전에 RNA 카피 번호에 대한 pps를 정상화하십시오.
  3. 감염성 분석
    1. qRT-PCR 데이터의 관점에서 각 유형의 pps를 4 x 105 복사/mL(pp 정규화)로 희석합니다.
    2. 토실-페닐알라닌 클로로메틸-케톤(TPCK)-트립신을 H7N9 HA를 수용하는 pps에 40 μg/mL의 최종 농도에 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 HA1 및 HA2의 기능적 소단위를 형성한다.
      참고: HA1-HA2 절단 부위에 여러 아르기닌과 리신 잔류물이 있기 때문에 H5를 TPCK-트립신으로 취급할 필요가 없습니다. 이 다중 기본 절단 사이트는 유비쿼터스 세포 프로테아제에 의해 절단 될 수있다.
    3. 정규화된 pps를 DMEM 배지(무혈청)와 1:1 비율(부피/부피)으로 혼합합니다.
    4. 생체 안전성 캐비닛에 영향을 받기 쉬운 세포가 들어있는 접시를 가져옵니다.
    5. 상월체를 흡인하고 미리 온난화된 PBS의 0.1 mL로 세포를 한 번 세척한다.
    6. 0.1 mL의 pps-DMEM 혼합물을 하나의 우물에 추가합니다. 각 유형의 pps의 감염성 검사를 하나의 취약한 세포주로 세배로 합니다(그림 2에서간과함).
    7. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 96웰 플레이트를 배양한다.
    8. 상급을 흡인하고 DCM의 0.1 mL로 교체하십시오.
    9. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 24-36h에 대한 96웰 플레이트를 배양한다.

5일차 5일 또는 6일: 감염성 검출

  1. 96 웰 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛에 가져옵니다.
  2. 상월체를 흡인하고 미리 온화한 PBS의 0.2 mL로 세포를 1x 세척한다.
  3. PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액의 0.1 mL로 세포를 해리시.
  4. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 3분 동안 놓고 세포가 해리될 때까지.
    참고 : 이것은 세포 응집으로 이어질 수 있기 때문에 5 분 이상 배양하지 마십시오.
  5. DCM의 0.4 mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
  6. 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.
  7. 세포 현탁액을 냉각된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮니다.
  8. 형광 활성화 세포 선별 (FACS)로 GFP 리포터 양성 세포를 결정합니다.
    참고: GFP 리포터 양성 표적 세포의 비율을 결정하기 위해, 대조군 샘플(pps-처리되지 않은 A549 세포 또는 MDCK 세포)을 사용하여 유동 세포측계 게이트를 설정한 다음 샘플당 10,000개의 GFP 리포터 양성 세포를 계산합니다.

결과

위에서 설명한 일반적인 절차에 따라, 우리는 2개의 그룹 HA/NA 또는 VSV-G 당단백질 또는 무엔벨로프 당단백질을 결합한 10가지 종류의 pps를 생성하였다(표 1에나타낸). 그 중 7명은 전염성이 있습니다. 무엔벨로프 당단백질 또는 NA만 항구하는 pps는 여기에서 어떤 감염도 보여주지 않았습니다. 인플루엔자 pp 생산 절차는 그림 1에서검토됩니다. pps의 전송 전자 현미?...

토론

이 프로토콜에서, 우리는 BSL-2 설정에서 인플루엔자 바이러스 가성 입자(pp)를 생성하는 방법을 설명한다. 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP는 pps에 통합되고 감염성 분석에서 FACS에 의해 pps를 정량화하는데 사용될 수 있다. 우리는 인플루엔자 연구에 널리 사용되기 때문에 두 가지 유형의 영향을 받기 쉬운 세포주를 선택했습니다. MDCK 세포는 이러한 연구에서 사용되는 가변 불멸의 인간 세포에 좋은 대?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 절강 성 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, 2017KY538), 항저우 시 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, OO20190070), 항저우 의학 및 항저우 의학 및 기술 계획에서 보조금에 의해 지원되었다 기술 핵심 프로젝트 (그랜트 번호, 2014Z11) 및 사회 개발 및 과학 연구의 항저우 시 자치 응용 프로그램 프로젝트 (그랜트 번호, 20191203B134).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Benzonase NucleaseMillipore70664Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)Corning3599Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)Costar3516Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)Gibco11965092A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serumExcellFND500fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)Beckman coultercytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cellsATCCCRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cellsATCCCRL-11268A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscopeOlympusBX51-32P01-FLB3
Inverted light microscopeOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitNEBE3006LWill withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellsATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDFMilliporeSLHV033RSan improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycinGibco15140122Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)Corning430791a stable and highly reactive serine protease
Proteinase KBeyotimeST532Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)Corning430166Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsinSigmaT1426This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056

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