뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

요약

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

초록

췌도 이식은 타입-1 당뇨병을 위한 잘 확립된 치료 처리입니다. 신장 캡슐은 설치류 모형에 있는 아일레 이식을 위해 일반적으로 이용되는 사이트입니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 큰 동물 및 인간에 있는 충분한 작은 작은 것의 이식을 제한합니다. 새로운 피하 공간인 인큐니얼 피하 백색 지방 조직(ISWAT)은 저도 이식에 잠재적으로 귀중한 부위인 것으로 나타났습니다. 이 사이트는 다른 피하 공간보다 더 나은 혈액 공급이 있습니다. 더욱이, ISWAT는 신장 캡슐보다 더 큰 작은 덩어리를 수용하고, 그것으로 이식하는 것은 간단하다. 이 원고는 합성 당뇨병 마우스 수용자의 ISWAT 부위에서 마우스 췌도 격리 및 이식의 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 뮤린 췌도는 표준 콜라게나아제 소화에 의해 분리되었고 지하 막 매트릭스 하이드로겔은 ISWAT 부위에서 정제된 섬을 고정하는데 사용되었다. 수용자 마우스의 혈당 수준을 100일 이상 모니터링하였다. 아일렛 이식편은 조직학적 분석을 위해 이식 후 100일째에 회수되었다. 이 원고에 설명된 ISWAT 사이트에서 의정서는 간단하고 효과적이다.

서문

국제 당뇨병 연맹 (IDF)^1의통계 데이터에 따르면 타입-1 당뇨병 (T1DM)의 세계적인 부각 그리고 보급은 급속하게 상승하고 있습니다. 아일렛 이식은 T1DM⁴를 치료하기위한 가장 유망한 접근 법 중 하나입니다. 에드먼튼 프로토콜^2를 이용한 임상 섬 이식에서 큰 돌파구가 보고된 이후, 5년 후 T1DM 수혜자에서 기능하는 섬 이식 생존은 이제 약 50%^3에도달한다.

과거에는 간, 신장 캡슐, 비장, 근육 내 부위, 피하 공간, 골수 및 오멘탈 파우치와 같은 여러 이식 부위가 실험적인 췌도^이식을위해 탐구되었다^5,6,7. 위의 사이트 중 일부는 임상 설정에서 테스트 되었습니다⁸. 췌도 이식은 현재^9에서임상 적용에서 가장 널리 사용되는 방법으로 남아 있지만,이 사이트를 사용할 때 해결해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 예를 들어, 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)과 가난한 산소화^{공급(10,11)에} 의해 야기된 이식된 작은 섬들의 조기 손실을 감소시키는 방법^및필요한 경우 췌도 이식편을 회수하는 방법, 그들은 간에서 확산되기 때문에. 신장 캡슐 설치류 수용자에 대 한 이상적인 사이트 수 있습니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 인간에서 충분한 동종 아일렛의 이식을 제한하지만, 고도로 정제된 돼지 섬 제제로 인해 아일트종이식에 더 적합할 수 있지만 임상적으로^5,12. 따라서, 아일렛 이식에 적합한 부위에 대한 탐색이 진행되고 있다.

피하 공간은 접근성으로 인해 아일렛 이식에 임상적으로 적용 가능한 부위로서 사용될 수 있다. 그러나, 피하 공간으로의 섬 이식의 효율은 매우 낮으며, 따라서^{고혈당증(13)을}역전시키기 위해 상대적으로 많은 수의 섬을 필요로 한다. 최근 일본의 한 연구팀은^간(14)과비교했을 때 뮤린 모델에서 췌도 이식에 우수한 새로운 피하 부위인 ISWAT를 발견했다. ISWAT는 상복부 동맥과 정맥을 포함하므로 풍부한 혈액 공급은 아일렛 이식편 재혈관화를 보장 할 수 있습니다. 이 원고에서는 ISWAT에서 합성 뮤린 섬을 고정하기 위해 지하 막 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 쉬운 이식 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 아일렛 이식에 효과적임을 증명합니다.

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프로토콜

이 프로토콜의 모든 절차는 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회의 동물 복지 원칙을 따랐다. 아일렛 이식 수혜자 및 기증자는 광동성 의과 동물 센터에서 구입한 8-10주 된 C57BL/6 남성 마우스이었습니다. 수확된 세포의 수확, 분리, 배양, 또는 투여의 절차는 무균 조건에서 수행되었다.

1. 아일렛 준비

1. 콜라게나아제 V 형 작동 용액을 준비하십시오. 콜라게나아제 V형을 계량하고 D-Hank의 버퍼로 1 mg/mL의 최종 농도로 용해하고, 0.22 μm 주사기 구동 필터 유닛과 60 mL 주사기를 사용하여 필터를 사용하여 얼음에서 미리 냉각합니다. 각 기증자 받는 사람에 대 한 5 mL의 볼륨이 필요 합니다.
2. 자궁 경부 탈구에 의해 10 주 된 C57BL / 6 남성 마우스 (23 ± 2g)를 안락사시키고 마우스의 외부 부분을 75 % 에탄올로 몇 초 동안 살포하십시오. 한편, 콜라게나제 용액으로 5 mL 주사기를 채우고 굴곡 무딘 뾰족한 관류 바늘 (32G)으로 주사기 바늘을 변경하십시오.
3. 해부 범위 아래 얼음 가방에 척추 위치에 기증자 마우스를 넣어, 음모 영역의 피부에 직선 뾰족한 안과 가위를 사용하여 횡개구를 잘라, 완전히 머리를 향해 피부를 절개. 그런 다음 음모 부위에서 xiphoid 과정으로 V 절개를 통해 복부를 완전히 엽니다.
4. 담낭과 간을 재배치하여 일반적인 담관의 전체 길이를 노출. 그런 다음 일반적인 담관의 십이지장 개구부를 혈관 클램프로 고정하고 담낭의 작은 개구부를 잘라냅니다.
   참고: 최적의 바늘 배치는 간과 담낭으로의 역류를 방지하는 데 중요합니다.
5. 1.2 단계에서 관류 바늘을 사용하여 담낭 개구부로부터 일반적인 담관을 캔울한 다음 췌장에 콜라게나아제 용액의 ~ 2 mL를 주입합니다. 그 후, 비침습적 마이크로트위즈 2쌍을 사용하여 내장, 위 및 비장에서 관류췌장을 분리하고 얼음 위에 50 mL 원엽 튜브에 넣습니다.
   참고: 모든 기증자 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 연속적으로 관류된 3개의 췌장(40분 이상 떨어져 있지 않음)을 각 췌장에 대해 3 mL의 콜라게나아제 용액으로 미리 채워진 50 mL 원엽 튜브로 결합할 수 있습니다.
6. 췌장당 100 μL DNase I(10 mg/mL)를 50 mL 원엽 튜브에 넣고 37°C의 수조에서 췌장을 3-5분 동안 흔들어 소화합니다.
   참고: 수조에서 소화되기 전에 조직을 분리하기 위해 10s 간격으로 튜브를 40배 격렬하게 흔들어 소화 중에 튜브를 적당히 흔들어 줍니다.
7. 최대 50 mL의 최종 부피까지 정지 용액(2.5 mg/mL BSA-HBSS 솔루션)을 추가하고 튜브를 4°C에서 750 x g의 속도로 펄스 원심분리하고 신속하게 중지합니다.
8. 상급을 붓고 BSA-HBSS의 15-25 mL에서 부드럽게 다시 중단하여 펠릿 2x를 씻으십시오. 펄스 원심분리기는 1.7 단계에서 1분 동안 설명한 것과 동일한 속도 조건을 가진 튜브를.
9. 상급을 붓고 3 개의 원엽 튜브의 펠릿을 50 mL 원점 튜브로 풀. 히스타크-1119의 총 부피 10 mL로 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 균일하게 혼합하고, 튜브의 측면을 따라 천천히 피펫팅하여 히스타크-1077 및 HBSS의 5 mL및 5 mL을 순차적으로 추가합니다.
10. 원심분리기에서 시료를 4°C에서 750 x g에서 브레이크 없이 10분 동안 회전시다.
11. HBSS/histopaque-1077 인터페이스에서 일회용 5mL 파스퇴르 파이펫을 사용하여 50mL 원소 튜브에 흡인하고, BSA-HBSS를 최종 부피 50mL에 추가하고, 4°C에서 750 x g의 펄스 원심분리기를 추가합니다.
12. 상급을 붓고 BSA-HBSS의 30 mL를 사용하여 섬을 씻으하십시오. 4 °C에서 750 x g에서 1 분 동안 원심 분리기.
13. 튜브 당 30 mL의 배양 배지 (10 % FBS-1 % P / S-CMRL-1066)를 사용하여 섬을 다시 중단하고 10cm 직경의 가벼운 단단한 배양 접시에 부어. 입체 현미경에서 200 μL 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 형태 (즉, 구형, 흰색)에 따라 용액에서 섬을 손으로 선택합니다. 10 mL의 배양 배지로 처리되지 않은 세포 배양 접시에 넣습니다.
    참고 : 첫 번째 정제 된 작은 섬의 순도가 첫 번째 피킹 후 최적이 아닌 경우 두 번째 손 따기를 수행 할 수 있습니다.
14. 광 현미경으로 디티존 염색에 의해 엄선된 작은섬의 순도를 확인하고 형광 현미경으로 염색하는 플루오레세신 디아세테이트(FDA)-프로피듐 요오드화물(PI)에 의한 작은 섬의 생존 가능성을 감지합니다.
15. 이식 전 37°C에서 인큐베이터에서 배양배지(단계 1.13에서와 같이)에서 단리된 섬을 배양하고, 95% 공기-5%_CO2를 배양하였다.

2. ISWAT 아일렛 이식

1. 연쇄상 구균 (STZ)의 단일 주입에 의해 8 주 된 남성 C57BL / 6 마우스 (22 ± 2g)에서 당뇨병을 유도합니다. 4일째에, 마우스를 ~4-6h에 빠르게 하고, 0.1 M 구연산염 완충제(pH 4.4)를 사용하여 2% STZ 용액을 준비한다. 무게를 달고, 버퍼에 다시 중단하고, 180 mg/kg의 용량으로 마우스를 복강 내 주사하십시오.
   참고: STZ 솔루션은 사용 전에 신선하게 제조되어야 하며 빛 감도로 인해 알루미늄 호일로 덮여 있어야 합니다. 그것은 15-20 분 이내에 활동을 잃게되기 때문에 즉시 사용해야합니다.
2. STZ-주입 마우스의 꼬리 정맥을 뚫어 1일 차 -1 및 0일의 약 10AM에 일부 혈액을 수집하고 시험 스트립 및 기본 혈당 모니터링 기구를 사용하여 비 공복 혈당 수준을 측정합니다. 마우스는 2회 연속 시험일의 혈당 수치가 둘 다 20 mmol/L 이상인 경우, 아일렛 이식 수용자로서 사용될 것이다.
3. 0일째에 모든 수령인 마우스의 무게를 측정하고 표시합니다. 각 수령인에게 60 mg/kg펜토바르비탈 나트륨을 심상으로 주입하여 마취시다.
   참고 : 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락 핀치를 관리합니다. 수신자 마우스가 철수 반사가없는 경우, 마취의 수준은 수술에 충분하다. 그렇지 않은 경우, 추가로 10 mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 투여하십시오. 사용된 펜토바르비탈 나트륨은 2% 농도(m/v)의 농도에서 멸균 생리식염수로 희석하였다.
4. -20 °C 냉동고에서 하이드로겔을 꺼내서 해동할 수 있도록 얼음에 보관하십시오. 하이드로겔은 4-10 °C의 액체이며 더 높은 온도에서 고화됩니다.
5. 각 수령인에 대해 ~450-500개의 염두 등가물(IEQ)을 스테레오현미경(단계 1.13)에서 멸균 된 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 200 μL의 배양 배지로 선택하고 이식 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
6. 75% 에탄올을 사용하여 수령인의 왼쪽 인구 영역을 면봉합니다. 수술 테이프를 사용하여 척추 위치에 놓고 네 개의 팔다리를 고정시다. 전기 클리퍼로 수술 부위 주변의 머리카락을 면도하고 Iodophor로 부위를 면봉하십시오.
7. 안과 가위와 비 침습적 인 마이크로 트위즈를 사용하여이 부위의 수직 피부 절개를 만들고 ISWAT에서 열등한 상복부 동맥과 정맥을 식별하고 혈관 위에 작은 주머니를 만듭니다.
8. 200 x g에서 30s의 섬 튜브를 회전시키고 가능한 한 상류자를 제거하십시오. 완전히 해동 된 하이드로 겔의 20 μL을 흡입하고 섬과 튜브에로드합니다. 거품을 피하면서 섬을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
9. 200 μL 파이펫 팁으로 수령인의 포켓(단계 2.7)에 튜브 내의 전체 아일렛 하이드로겔 혼합물을 전달한다.
   참고 : 이 과정은 두 명의 기술자가 필요합니다, 하나는 비 침습적 마이크로 트위즈를 사용하여 주머니의 가장자리를 따기위한 하나, 다른 하나는 주머니에 섬 혼합물을 전달하기위한.
10. 아일렛 하이드로겔 혼합물이 완전히 고형화된 후 이식 부위에 20 μL (~5-10 mg)을 추가한 다음 5-0 수술 봉합사를 사용하여 연속 봉합법으로 근육과 피부를 닫습니다.
    참고 : 하이드로 겔은 체온으로 인해 고화하기 위해 약 3 분이 필요합니다.
11. 수령인을 깨끗한 케이지에 넣고 열 패드를 사용하여 따뜻하게 유지합니다. 받는 사람이 완전히 복구되고 자율적으로 이동하기 시작할 때까지 모니터링을 유지합니다. 그런 다음 0.1 mg / Kg 용량에 따라 멸균 생리식염수로 0.03 mg / ml Buprenorphine을 복강 내 투여하십시오.
12. 각 받는 사람 마우스에 대해 2.3-2.11 단계를 반복합니다.
13. 수용인 마우스의 비단식 혈당 수치를 측정(단계 2.2에서와 같이) 첫 달 동안 일주일에 3-4회, 그 후 일주일에 1회.
14. 후속 (이식 후 100 일)의 끝에서, 마취하에 (단계 2.3에서와 같이 수행됨) 단계 2.6에 기재된 멸균 단계를 따라 수령인으로부터 이식편을 베어링하는 ISWAT를 절제한다. 인슐린과 글루카곤의 헤마톡신 및 에오신(H&E) 염색 및 면역형에 대한 조직학적 프로토콜에 따라 포르말린과 파라포름알데히드에서 조직을 고정합니다.
15. 세팔로스포린을 추가하고 2.10 단계에서와 같이 받는 사람의 절개를 닫은 다음 2.11 단계에서와 같이 회복을 준비하십시오.

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결과

이 프로토콜에는 두 가지 절차가 도입됩니다: 뮤린 아일렛 제제 및 ISWAT 부위에 의한 아일렛 이식. 첫 번째 절차에서, 타입 V 콜라게나아제 용액으로 정독 및 소화한 후, 히스타크-1119 및 히스타크-1077및 추가의 손 따기 단계로 정화한 후, 분리된 뮤린 섬은 이식에 충분히 순수할 것이다(도 1에도시된 바와 같이) 및 높은 생존율을 가지는 고립된 섬이 이식에 사용될 것이다(도

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토론

췌장 췌도 이식은 T1DM을 치료하는 유망한 치료법입니다. 이 치료의 효과는 많은 요인에 의해 영향을 받고 아일렛 이식을위한 최적의 부위를 선택하는 것은 매우 중요합니다. 아일렛 이식에 대한 이상적인 해부학 적 부위는 다음과 같은 특성을 가져야합니다 : 간단한 이식, 생검 및 이식 편이식 검색 절차에 대한 접근성; 감소 합병증; 혈액 포도 당 제어의 높은 성공률; 및 섬 이식편^15,<...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit	Merck Millipore	SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette	JingAn Biological, China	J00085
5 mL syringe	Szboon, China	20170829
50 mL conical tube	Corning	430829
5-0 surgical suture	sh-Jinhuan, China	CR537
60 mL syringe	Szboon, China	20170623
75% Ethanol	LIRCON, China	9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)	Invitrogen	A21202	Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody	Abcam	ab10988	Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody	Cell Signaling Technology	3014s	Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle	Oloey, China	005	32G, yellow
BSA	Meilune, China	MB4219
C57BL/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province		8~10 weeks
cell culture dish	BIOFIL, China	TCD000100	General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge	Thermo Scientific	ST16R
cephalosporin	Lukang medical, China	150303
CMRL-1066	Sigma-Aldrich	C0422
Codos Pet Clipper	Szcodos, China	CP-8000
collagenase Type V	Sigma	C9262
DAPI	Thermo Fisher	D1306
D-hank's buffer	Coolaber, China	PM5140-10
dithizone	Sigma-Aldrich	D5130
Dnase I	Sigma-Aldrich	D4263
Eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
FBS	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
fluorescein diacetate (FDA)	Thermo Fisher	F1303
fluorescent microscope	Leica	DMIL
gel-loading pipet tips	Corning	CLS4884
HBSS	Coolaber, China	PM5150-10
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology	14166S
HISTOPAQUE-1077	Sigma-Aldrich	RNBG0522
HISTOPAQUE-1119	Sigma-Aldrich	RNBG0536
Hydrogel	BD Biosciences	356234	Basement Membrane Matrix
Iodophor	LIRCON, China	5190313
light-tight culture dish	DVS, China	AN-5058548	self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape	Cofoe, China	K12001
non-invasive microtweezers	RWD Life Science	F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
ophthalmic scissors	RWD Life Science	S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin)	Gibco	15140-122
pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P-010
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
STZ (streptozotocin)	Sigma-Aldrich	S0130
Test Strip	GenUltimate	100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00007-2	Dilution (1:200)
vascular clamp	RWD Life Science	R31006-04