꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

요약

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

초록

전이는 암 관련 죽음의 주요 원인이고 전이성 질병을 가진 환자를 위한 한정된 치료 선택권이 있습니다. 전이성 질병에 대한 더 나은 치료법의 개발을 용이하게 하는 새로운 치료 표적의 식별 및 테스트에는 생체 내 전임상 모델이 필요합니다. 여기에서 입증된 것은 유방암 전이성 식민지화 및 후속 성장을 위한 합성 마우스 모델이다. 전이성 암 세포는 반딧불 루시퍼라제 및 ZsGreen 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터로 안정적으로 변환됩니다. 후보 유전자는 그 때 luciferase/ZsGreen 발현암세포에서 그 후에 세포가 전이성 식민지화 및 성장을 분석하기 위하여 측방 꼬리 정맥을 통해 마우스로 주입됩니다. 생체 내 이미징 장치는 살아있는 동물의 종양 세포의 생물 발광 또는 형광을 측정하여 시간이 지남에 따라 전이성 부담의 변화를 정량화하는 데 사용됩니다. 형광 단백질의 발현은 절편 또는 조직학적 염색없이 실험이 끝날 때 폐에서 전이의 수와 크기를 정량화할 수 있게 한다. 이 접근법은 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 테스트하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 전통적인 꼬리 정맥 전이 분석보다 훨씬 더 많은 정보를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여, 우리는 유방암 세포에 있는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 연관된 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 녹다운이 폐에 있는 감소된 전이성 부담으로 이끌어 내고 이 감소된 부담이 현저하게 손상한 전이성 식민지 및 전이성의 감소된 성장의 결과이다는 것을 보여줍니다.

서문

암은 전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인 남아¹ 전이 이 죽음의 대부분에 대한 책임이^2,3. 그러나, 전이성 식민지및 후속 성장을 통제하는 분자 기계장치의 한정된 이해는 전이성 질병을 위한 효과적인 처리의 발달을 방해했습니다. 새로운 치료 표적의 확인은 후보 유전자의 교란된 발현 또는 기능이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하기 위한 분석법을 필요로 한다. autochthonous 마우스 모델은 장점이 있지만 생성하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들기 때문에 대상 검색보다는 대상 유효성 검사에 더 적합합니다. 후보 유전자가 시험관 내 암세포에서 교란되고 전이성 전위전위에 대한 영향이 생체 내에서 평가되는 이식 모델 시스템은 자가 진단모델보다 비용이 적게 들고 처리량이 높다. 또한, RNAi, CRISPR/CAS9 및 트랜스유전자의 안정한 전달을 위한 바이러스 벡터가 널리 이용가능하여, 암 세포주에서 관심 있는 거의 모든 유전자 또는 유전자를 비교적 쉽게 교란할 수 있다. 이 접근법은 또한 세포를 면역 타협 또는 인간화 된 마우스로 이식함으로써 인간 암 세포주에서 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

생체 내에서 이식된 암세포에 의한 전이 형성을 테스트하는 데 사용되는 두 가지 유형의 실험은 자발적전이성 전이 검정 및 실험전이이다. 자발적 전이^{분석4,5에서,}암세포는 마우스로 주입되고, 원발성 종양을 형성하도록 허용한 다음, 자발적전이 형성 및 후속 성장이 분석된다. 이 모형의 힘은 세포가 전이성 종양을 형성하기 위하여 전이성 프로세스의 모든 단계를 완료해야 한다는 것입니다. 그러나, 많은 암 세포주는 자발적인 전이 모델에서 효율적으로 전이되지 않으며, 원발성 종양 성장에 영향을 미치는 세포의 조작은 전이 분석의 결과를 혼동할 수 있다. 암세포가 순환에 직접 주입되는 실험적 전이 실험은 이러한 함정을 피하기 위해 사용됩니다. 일반적인 실험전이검사는^{꼬리정맥주사6,7,8(여기서} 입증됨), 심내주사9,및 문맥주사(10)를 포함한다.

여기에 제시된 프로토콜의 목적은 연구원이 실시간으로 전이 형성 및 성장을 모니터링할 수 있도록 하는 생체 내 실험 전이 분석실험을 제공할 뿐만 아니라 동일한 마우스의 폐에서 종점 전이 수 및 크기를 정량화하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 전통적인 꼬리 정맥 전이 검소^6,7,8은 생체 내 이미징 장치^{9,11,12,13,14를}사용하여 살아있는 동물 이미징과 결합된다. 루시퍼라제와 형광 단백질을 모두 안정적으로 발현하는 종양 세포는 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스내로 주입된 후 생체내 이미징 장치는 시간이 지남에 따라 폐의 전이성 부담의 변화를 측정하는데 사용된다(그림1). 그러나, 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 개별 전이의 크기를 구별하거나 측정할 수 없다. 따라서, 실험의 끝에서, 형광 입체 현미경은 절편 및 조직학 또는 면역 조직화학의 필요없이 폐에서 형광 전이의 크기를 카운트하고 측정하기 위해 사용된다(그림 1). 이 프로토콜은 후보 유전자의 발현 또는 기능을 변경하는 것이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 항체를 차단하는 작은 분자 또는 기능과 같은 잠재적인 치료 화합물도 시험될 수 있습니다.

이 접근법을 설명하기 위하여는, 우리는 먼저 필수적인 복제 인자, 복제 단백질 A3 (RPA3)가 전이성 마우스 유방암 세포에서 쓰러지는 개념 실험의 증명을 수행했습니다. 우리는 RPA3 녹다운 세포로 주입된 마우스가 대조군 세포로 주입된 마우스에 비해 매 시점에서 현저한 전이성 부담을 가지고 있음을 보여준다. 전이 함유 폐의 분석은 이러한 전이성 부담 감소가 전이성 식민지화 및 형성되는 전이의 성장을 크게 감소시킨 결과임을 보여준다. 이 기술을 추가로 설명하기 위하여는, 우리는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 관련 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 노크가 전이성 식민지화 또는 후속 성장을 손상하는지 여부를 시험했습니다. YAP 와 TAZ는 하마 통로의 중요한 하류 이펙터인 두 개의 관련 전사 공동 활성제입니다. 우리^15,16 및 그 외는 전이에 YAP와 TAZ를 연루했습니다^{(17,18,19에서}검토), 이 단백질이 좋은 치료 표적이다는 것을 건의합니다. 일관되게, 우리는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스가 전이성 부담을 현저하게 감소시켰음을 발견했습니다. 폐의 분석은 YAP/TAZ 녹다운 세포가 더 적은 전이를 형성하고 양식한 전이가 더 작다는 것을 보여주었습니다. 이 실험은 실험적인 전이 실험이 어떻게 연구원이 전이 형성 및 성장에 있는 후보 유전자의 역할을 신속하고 저렴하게 시험하는 것을 허용하는지 보여줍니다. 그(것)들은 또한 살아있는 동물 화상 진찰의 결합한 사용 및 전체 폐에 있는 전이의 형광 정량화가 전이성 식민지 도중 단계를 더 잘 이해하는 것을 허용하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 마우스 및 생체 유해 물질의 사용을 포함하고 적절한 기관 안전 위원회의 승인을 필요로한다. 여기에 설명된 모든 생체 내 작업은 알바니 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다.

참고: 프로토콜 개요는 그림 1의회로도를 참조하십시오.

1. 필요한 모든 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 포장

참고: 기재된 프로토콜은 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 루시퍼라아제 효소 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하고 후보 유전자의 발현을 조작한다. 이러한 바이러스는 아래에 설명된 바와 같이 HEK-293FT 세포에서 패키징된다.

1. 1일차: 완전한 성장 매체의 2 mL에서 6웰 플레이트에 있는 PLATE HEK-293FT 세포(1% 페니실린/스트렙토마이신과 2mML-글루타민을 가진 DMEM의 10% FBS)를 2일째에 40-60% 수렴합니다. 37°C, 5%_CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
2. 일 2: 패키징되는 각 바이러스 벡터에 대해, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 및 바이러스 코팅 및 패키징 단백질을 코딩하는 적절한 벡터를 사용하여 HEK-293FT 세포의 40-60% 웰웰을 트랜스펙트한다.
   참고: 이 프로토콜은 VSVG를 코트 단백질로, 렌티바이러스 포장을 위한 psPAX2, 레트로바이러스 포장을 위한 개그폴을 사용합니다(벡터 목록에 대한 보충 표 1 참조).
3. 다음과 같이 각각에 대한 공동 형질 전환 혼합물을 만듭니다.
   1. 4 μL의 지질 용액을 형질감염(재료 표참조)과 96 μL의 형질전환 완충액을 결합하고 5분 동안 배양합니다.
   2. 바이러스 벡터 1 μg, 코트 단백질 벡터 0.5 μg(VSVG), 0.5 μg의 포장 단백질 벡터(psPAX2 또는 개그폴)를 넣고 20분 동안 배양합니다.
   3. 1.3.2단계에서 1.3.2단계에서 의 혼혈 혼합물을 1.1단계에서 도금된 HEK-293FT 세포에 부드럽게 첨가하고 37°C, 5%_CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
4. 3일차: 각 웰에서 형질전환 함유 매체를 제거하고 각 웰에 2 mL의 완전한 성장 매체를 부드럽게 추가합니다. 약 24시간 동안 37°C, 5%_CO2에서 배양합니다.
5. 일 4: 3 mL 주사기를 사용하여 각 우물에서 바이러스 상구제를 수집하고 2 mL 미세 원심 분리튜브로 0.45 μm 필터를 통해 필터링합니다.
6. 선택 사항: 바이러스의 두 번째 배치의 수집이 필요한 경우, 각 웰에 2 mL의 완전한 성장 매체를 부드럽게 추가하고 약 24 시간 동안 37 °C, 5 %_CO2에서 배양하십시오.
7. 5일차(선택 사항): 1.5단계에서와 같이 두 번째 바이러스 성 상급제를 수집합니다.
   참고: 프로토콜은 바이러스 상한을 동결시킴으로써 일시 중지될 수 있다.

2. 루시퍼라제와 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 암세포의 생성

참고: 다음 프로토콜은 독특한 선택 유전자를 가진 2개의 벡터를 사용하여 반딧불 루시퍼라아제와 형광 단백질(ZsGreen)으로 4T1 세포를 안정적으로 라벨하는 방법을 설명합니다. 이어서^3rd 바이러스 벡터는 후보 유전자의 발현을 조작하는데 사용된다. 그러나, 형광 단백질 및 유전 적 조작을 동시에 전달하는 바이러스 벡터는 또한 대안으로 사용될 수 있다 (아래 대표적인 실험에서와 같이). 그밖 암세포는 이용될 수 있습니다, 그러나 세포 수는 단계 2.1 및 2.7.1를 위해 최적화되어야 합니다.

1. 플레이트 4T1 세포는 1.5 x 10⁵ 세포에서 12 웰 플레이트에서 완전한 성장 매체 (1% 페니실린/스트렙토마이신과 2 mM L-글루타민을 가진 DMEM에서 10% FBS)를 37°C, 5%_{CO2하룻밤에서} 배양한다.
2. 1단계에서 생성된 바이러스 상상염으로 4T1 세포를 감염시다.
   1. 세포로부터 성장 매체를 흡인하고 루시퍼라제 바이러스 상판및 500 μL의 루시퍼라제 바이러스 상판및 500 μL의 형광 단백질 바이러스 상류제를 첨가하여 동시에 루시퍼라제 및 형광 단백질 바이러스 성 초온제 모두로 세포를 감염시킨다.
   2. 8 mg/mL 헥사디메트린 브로마이드 1 μL을 첨가합니다(재료 표참조).
   3. 37 °C에서 세포를 배양, 75-90 % confluent까지 5 % (일반적으로 24-48 시간).
3. 트립시네이드 4T1 세포와 함께 500 /5 분 동안 트립신의 μL (세포는 우물의 바닥을 자유롭게 헹구어야한다). 모든 세포를 4 mL의 선택 매체(적절한 항생제를 함유하는 완전한 성장 매체)에서 6 cm 접시로 옮겨 트립신을 담금질한다. 동일한 선택 매체에 비감염 대조군 세포의 6 cm 접시를 플레이트.
   참고: 적절 한 항생제 농도 여러 복용량을 테스트 하 여 미리 결정 해야 합니다. 추가적으로, 형광 활성화 세포 선별은 또한 약물 선택 대신에 형광 표지된 세포를 선택하는 것을 이용될 수 있다.
4. 37°C, 5%_CO2에서 세포를 선택 매체에 배양하고 모든 비감염 대조구세포가 죽을 때까지 필요한 경우 세포를 분할한다(선택 유전자 및 세포주에 의존).
5. 감염된 4T1 세포가 50-100x 배율로 반전형광 현미경상에 설정된 녹색 여기(450-490 nm)/방출(500-550 nm) 필터를 사용하여 ZsGreen 형광 단백질을 발현하고 있는지 확인합니다.
6. 감염된 4T1 세포가 시판되는 루시퍼라제 활성 키트를 이용하여 루시퍼라제를 발현하고 있는지 는 다음과 같다.
   1. 1x 수동 용해 버퍼의 최소 볼륨을 사용하여 루시퍼라제를 발현하는 4T1 세포를 용해시키고 루시퍼라제를 발현하지 않는 4T1 세포를 제어하고 30분 동안 부드럽게 흔들어 보냅니다.
   2. 20 μL의 세포 용해액을 백색 바닥 96 웰 플레이트에 첨가한 다음 루시퍼라아제 활성 키트로부터 루시페라아제 분석 시약의 50 μL을 첨가한다.
   3. 플레이트 리더를 사용하여 발광 설정을 사용하여 스펙트럼의 모든 파장에서 세포의 발광을 측정합니다.
      참고: 프로토콜은 안정적으로 변환된 셀을 동결하여 일시 중지될 수 있습니다.
7. 후보 유전자의 발현을 다음과 같이 조작한다.
   1. 플레이트 6 x 10^5는 완전한 성장 매체의 4 mL에서 60 mm 접시상에 2.6단계로부터 4T1 세포를 표지하고 37°C, 5%_CO2에서 밤새 배양한다.
   2. 각각의 웰로부터 성장 매체를 흡인하고 8 mg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 4 μL을 함유하는 완전한 성장 매체2 mL를 첨가한다.
   3. 1단계에서 2 mL의 바이러스 상구제를 단계 2.7.2로부터 도금된 세포에 넣고 37°C, 5%_CO2에서 밤새 배양한다.
   4. 트립시네이드 4T1 세포와 함께 500 /5 분 동안 트립신의 μL (세포는 우물의 바닥을 자유롭게 헹구어야한다). 모든 세포를 10 mL의 선택 매체(적절한 항생제를 함유하는 완전한 성장 매체)에서 10 cm 접시로 옮겨 트립신을 담금질한다. 플레이트 일부 비감염 대조군은 동일한 선택 매체에 4T1 세포를 표지하였다.
   5. 선택 매체에 37°C, 5%_CO2에서 세포를 배양하고 모든 비감염 세포가 죽을 때까지 필요한 경우 세포를 분할합니다.
   6. 후보 유전자의 발현이 웨스턴 블롯²⁰ 또는 qPCR^21과같은 표준 접근법을 사용하여 변경되는지 확인한다.
   7. 분석 발광 및 형광 단계 2.5-2.6에서와 같이 그들은 제어 및 녹다운 세포에 얼마나 유사한지 결정하기 위해, 이것은 변경 될 수 있습니다 (토론 참조).
      참고: 프로토콜은 안정적으로 변환된 셀을 동결하여 일시 중지될 수 있습니다.

3. 생체 내 실험 설계의 최적화

1. 원하는 전이성 부담에 대해 적절한 세포 수 및 실험 기간을 다음과 같이 최적화한다.
   1. 완전한 성장 매체에서 2.6 단계에서 형광 및 생물 발광 4T1 세포를 확장하여 주입 당일에 과잉 세포를 사용할 수 있도록하십시오.
   2. 4.2단계에서 설명한 바와 같이 꼬리 정맥 주사를 위한 세포를 준비한다. 주사에 대한 최적의 세포 수를 결정하기 위해 1x PBS의 100 μL에서 여러 다른 농도로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
      참고: 25,000에서 최대 500,000까지 다양한 셀 번호/마우스를 테스트하는 것이 좋습니다.
   3. 주입 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
   4. 단계 3.1.2에서 3-4 마우스로 4.3 단계에서 기재된 측면 꼬리 정맥을 통해 4T1 세포의 각 희석을 주입합니다(아래 참조).
   5. 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다. 마우스는 고통 또는 고민의 표시를 매주 3 배 검사해야 합니다.
   6. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 사용하여 3-6주 동안 전이 형성 및 성장을 위한 마우스 모니터링(세포주 및 마우스 변형 의존성)(단계 5 및 6 단계 참조).
      1. 표준 기관 지침에 따라 꼬리 정맥 주사 후 3-6 주 동안 마우스를 안락사시.
      2. 폐를 준비하고 7단계에서 기재된 전이 크기 및 수를 평가한다.
      3. 전이가 원하는 전이 부담에 대해 성장할 적절한 시간을 선택합니다(토론 참조).

4. 표지된 암세포의 꼬리 정맥 주입

참고: 4.2.4 단계는 4T1 세포가 동기화 BALB/c 마우스에서 자라는 것에 최적화되었습니다. 그밖 암 세포주 및 마우스 긴장이 이용되는 경우에, 주입된 세포의 수 및 분석법의 길이는 첫째로 최적화되어야 합니다.

1. 2단계에서 생성된 4T1 세포주를 완전한 성장 매체에서 2개의 15cm 접시에 확장하여 주사 당일에 초과 세포를 사용할 수 있도록 합니다.
2. 꼬리 정맥 주입을 위한 세포를 준비하십시오:
   1. 용지를 흡인하고 1x PBS로 셀 플레이트를 헹구습니다.
   2. 트립시니화 5 트립신 의 mL 당 트립신 15 cm 플레이트 당 2-5 분 (세포는 자유롭게 우물의 바닥을 헹구어야한다). 모든 세포를 원유관으로 옮김을 옮김으로 옮김. 트립신을 담금질하고 동일한 원추형 튜브에 세척을 추가하기에 충분한 완전한 성장 매체로 조직 배양 접시에서 남은 세포를 세척합니다.
   3. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하여 총 셀 수를 결정합니다.
   4. 세포를 122 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 상월체를 흡인하고, 원하는 농도로 1x PBS로 세포를 재중단한다. 여기서, 2.5 x 10⁴ 세포는 PBS의 100 μL에서 각 마우스에 주입되므로 2.5 x 10⁵ 세포/mL에서 세포를 다시 중단한다. 주입 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
      참고: 세포의 트립시니화와 꼬리 정맥 주사 사이의 시간을 약 1 시간으로 제한하는 것이 중요합니다.
3. 4.2.5단계에서 부터 횡꼬리 정맥을 통해 마우스로 4T1 세포를 다음과 같이 주입한다.
   1. 동물 시설에서 후드에서 작업, 부드럽게 하지만 철저 하 게 튜브를 반전 하 여 세포를 혼합 또는 1 mL 주사기를 사용 하 여 그들은 균일 하 게 다시 일시 중단 되도록. 주사기를 적재하기 전에 항상 셀을 다시 매달아 두도록 하십시오.
   2. 셀 서스펜션으로 1 mL Luer-lock 주사기를 적재하고 여분의 기포를 배출하십시오. 경사를 위로 하고 기포를 배출하는 주사기 위에 1/2 인치, 30 게이지 바늘을 놓습니다.
   3. 마우스를 설치류 절제기안에 부드럽게 놓습니다.
   4. 측면 꼬리 정맥이 보이고 넓혀져야 합니다. 그렇지 않은 경우 꼬리 의 밑부분을 부드럽게 꼬집고 꼬리를 따뜻한 수돗물에 담그어 정맥을 넓히십시오.
      참고: 정맥의 팽창은 또한 가열 램프 및/또는 가열 패드 의 상단에 마우스 케이지를 두면 달성될 수 있습니다.
   5. 알코올 닦음기를 사용하여 꼬리를 청소하십시오. 바늘을 꼬리 정맥에 넣고, 옆으로 베블하고, 100 μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
      참고 : 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 약간 앞뒤로 쉽게 미끄러져야하며 플런저를 밀때 저항이 없어야합니다. 성공적인 주사는 또한 정맥의 푸른 색이 주입 후 몇 초 동안 흰색으로 변하는 "플러시"를 초래해야합니다.
4. 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여, 어떤 출혈을 중지 주사 부위에 압력을 가한다.
5. 마우스를 케이지에 넣고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다. 마우스는 고통 또는 고민의 표시를 매주 3 배 검사해야 합니다.
6. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 사용하여 3-6주 동안 전이 형성 및 성장을 위한 마우스 모니터링(세포주 및 마우스 변형 의존성)(단계 5 및 6 단계 참조).

5. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치로 형광에 의한 전이성 부담 모니터링

참고: 활성 발광 신호로 형광에 대한 동물을 이미지화하지 마십시오.

1. 만 이미징 생물 발광경우, 단계 6로 건너 뜁니다.
2. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 켭니다.
3. 마취 챔버와 이미징 챔버에 1.5 %와 2 %의 이소플루란을 제공하기 위해 제조업체의 지침에 따라 생체 내 살아있는 동물 이미징 마취 시스템을 설정합니다.
4. 4단계에서 형광표지된 전이를 마취실로 생쥐를 마취챔버에 넣고 1.5-2.5% 이소플루란을 전달한다.
5. 이미지 소프트웨어(재질 표참조)를 열고 로그인합니다.
6. 초기화 단추를 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다.
7. 뷰 필드를 D로변경합니다.
   참고: 마우스의 가까이보기가 필요한 경우 보기 C 필드도 사용할 수 있지만 동시에 이미지화할 수 있는 마우스 의 수가 제한됩니다.
8. 소프트웨어가 카메라가 적절한 온도에 도달했다고 표시되면 이미징 마법사 버튼을 클릭하고 형광을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 적절한 필터 쌍을 선택합니다.
   참고: 사용 중인 형광단이 옵션이 아닌 경우 입력 EX/EM을 선택하고 필요한 여기 및 방출을 입력합니다.
9. 3.2.4단계에서 설명한 대로 마우스를 챔버에 놓는다.
10. 시퀀스 획득을 클릭합니다.
11. 이미징 후 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다.
12. 5.2 단계 및 5.7-5.9 단계를 전이를 포함하지 않는 마우스를 하나 이상 반복합니다. 참고: 이 마우스는 분석 중에 배경 신호를 정량화하고 빼는 데 사용됩니다(8단계).
13. 실험 기간 동안 매주 2-3회 이미지.

6. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치로 생물 발광에 의한 전이성 부담 모니터링

1. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 켜고 다음과 같이 프로그램을 설정합니다.
   1. 이미지 소프트웨어(재질 표참조)를 열고 로그인합니다. 초기화 단추를 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다. 뷰 필드를 D로변경합니다.
      참고: 시야 C 필드는 전체 마우스 본체를 자세히 볼 때 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 한 번에 이미지화될 수 있는 마우스의 수를 제한합니다.
   2. 처음 사용하려면 노출 설정을 다음과 같이 편집합니다. 환경 설정 | 취득 | 자동 노출및 최대 노출 시간을 기본 60초에서 300초로 변경하고 OK를클릭합니다.
      참고: 자동 노출 탭에서 다른 매개변수를 변경하지 마십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 마취 시스템을 설정하여 마취 챔버와 이미징 챔버에 1.5 %와 2 %의 이소플루란을 전달합니다.
3. 6.4단계로 진행하기 전에 카메라가 적절한 온도에 도달했는지 확인합니다.
4. 마취-함유 마우스를 마취 챔버에 넣고 1.5-2.5% 이소플루란을 전달함으로써 4단계에서 전이 함유 마우스를 마취시다.
5. 생물 발광 이미징을 위한 마우스를 다음과 같이 준비시다.
   1. D-루시페린(D-luciferin)으로 1mL 주사기를 적재한 다음 1/2인치 30인치 바늘을 주사기에 넣고 기포를 배출합니다.
   2. 마취된 마우스의 질량을 측정하고 기록합니다.
   3. 엄지손가락과 포인터 손가락을 사용하여 목 덜미를 꼬집고 핑키 핑거와 손의 밑면 사이의 꼬리를 잡고 마우스를 억제하십시오. 머리가 아래쪽을 가리키는 45도 각도로 마우스를 반전합니다.
   4. 바늘을 마우스의 왼쪽 복강 내(IP) 공간에 삽입합니다. 작은 볼륨을 다시 그려 IP 공간으로 항목을 확인합니다. IP 공간에서 다시 그릴 때 바늘의 베이스에 색상이 없어야합니다.
   5. 의 복용량에 대 한 D-luciferin의 적절 한 볼륨을 주입 150 mg/kg.
   6. D-luciferin 관리 직후, 타이머를 시작하고 코 콘에 코를 가진 화상 진찰 장치에 그것의 뒤쪽에 그것의 뒤의 마우스를 평평하게 놓고 1.5-2.5% 이소플루란이 관리되고 있는지 확인하십시오. 여러 마우스를 이미징하는 경우 각 마우스 사이에 분배기를 놓습니다. 마우스가 가능한 한 평평하게 배치되었는지 확인합니다(즉, 한쪽으로 기울지 않음).
   7. 발광 및 사진 상자를 클릭한 다음 획득 제어판에서 획득을 클릭합니다.
6. 피크 신호가 달성될 때까지 생물 발광 이미지를 지속적으로 획득하고 분석을 위해 피크 생물 발광 신호와 함께 이미지를 사용합니다.
7. 이미징 후 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다.
8. 실험 기간 동안 매주 2-3회 이미지.

7. 전이의 수와 크기의 정량화

참고: 전이가 증가하는 시간은 각 세포주 및 마우스 변형에 대해 결정되어야 하며, 주입된 세포 수에 의해 영향을 받습니다.

1. 표준 기관 지침에 따라 마우스를 안락사.
2. 각 마우스에서 폐를 분리하고 제거하고 1x PBS로 헹구어 과잉 혈액을 제거하십시오.
3. 폐를 로브로 부드럽게 분리합니다.
4. GFP 광대역 필터(여기 470/40x)를 사용하여 밝은 필드에서 10배 의 로브와 형광에 있는 ZsGreen 전이의 이미지를 획득합니다.
   참고: 모든 샘플에 대해 동일한 배율과 밝기를 유지합니다. 사용되는 배율은 사용되는 현미경의 시야뿐만 아니라 전이의 크기, 수 및 밝기에 따라 달라질 수 있습니다.
5. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 전이의 크기와 수를 정량화합니다.
   참고: 이미지 분석을 위한 프로토콜은 소프트웨어에 따라 달라지며 step3의 종양으로 최적화될 수 있습니다. 양자택일로, 형광 입체 스코프를 사용하여 각 폐에 있는 전이의 수를 수동으로 계산하십시오. 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있으며 8단계는 모든 생체 내 이미지가 수집된 후 임의의 시점에서 수행될 수 있다.

8. 생체 내 라이브 동물 이미징 장치로 획득 한 이미지의 데이터 처리 및 분석

1. 이미지 소프트웨어에서 각 마우스에 대한 모든 이미지 파일을 엽니다.
   참고: 분석을 위해 피크 생물 발광 신호와 함께 이미지를 사용하십시오.
2. 이미지 창의 왼쪽 상단에 있는 화살표를 클릭하고 해당 장치로 변경하여 장치가 생물 발광 데이터의 방사및 형광 데이터의 효율성에 있는지 확인합니다.
3. 마지막 시점의 이미지를 사용하여 다음과 같이 관심 영역(ROI)을 만듭니다.
   1. 도구 팔레트 창에서 ROI 도구를 클릭합니다. 화살표를 클릭하고 1을선택하여 ROI 를 하나 삽입합니다.
   2. ROI의 테두리를 클릭하고 마우스 가슴 위로 이동합니다. 마우스 의 가슴을 덮고 신호를 배제하지 않도록 ROI의 크기를 조정합니다.
4. ROI 측정을 클릭하고 원시 번호를 Excel 시트에 복사하거나 입력합니다.
   참고: 생물 발광 데이터의 경우 총 플럭스(광자/초)를 선택하면 ROI의 모든 광채의 합계가 합산됩니다. 전이가 반드시 균일하게 성장하지 않기 때문에, 전이성 부담의 합을 측정하기 때문에 총 플럭스는 평균 광도보다 우선합니다. 마찬가지로 형광 데이터의 경우 총 효율 %(방출 광도(광자/초)/여기광(광자/초))을 평균 효율 대신 사용해야 합니다.
5. 이미지 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 8.3단계에서 사용된 ROI를 복사하고 모든 이미지 파일에 붙여넣습니다.
   참고: 형광 이미지를 정량화할 때 전이 없이 이미지화된 마우스에서 동일한 영역을 정량화합니다. 이 신호를 배경 신호로 사용하고 획득한 각 형광 전이를 포함하는 마우스 이미지에서 빼내입니다.
6. 각 이미지에 대해 8.3.4 단계에서 선택한 동일한 영역에 붙여넣은 ROI를 이동하고 8.4 단계를 반복합니다.
7. 원시 데이터를 플롯하고 분석하는 것은 다음과 같습니다(보충 표 2참조).
   1. 도 2D 및 도4F에서와같이 표시된 수식(보충표 2)을사용하여 각 마우스에 대한 원시 데이터의_로그(10) 변환을 수행한다. 로그₁₀ 변환은 기하학적 경향이 있는 성장 곡선을 선형화하고 이종성을 최소화합니다.
   2. 선형 회귀를 사용하여 8.7.1단계(보충 표 2)에서플롯된 각 마우스에 대해 변형된 데이터를 로그_10에 맞게 피팅된 선의 기울기를 계산합니다. 선에 맞게 한 단계에서 경사를 계산하려면 보충 표 2의 수식을 참조하십시오.
   3. 그림 2E 및 그림 4G에서와같이 경사의 숫자 값을 플로팅합니다. 학생의 t-검정 또는 단방향 ANOVA(2개 이상의 그룹)를 사용하여 통계적 유의를 결정합니다.

결과

상기 접근법을 입증하기 위해, 우리는 중요한 복제 인자인 RPA3가 전이성 마우스 유방 암종 세포주에서 쓰러졌던 개념 증명 실험을 수행하였다(4T1^22). 프로토콜은 유전자 조작 전에 루시퍼라제 및 형광 단백질로 세포를 표지하는 것을 설명하지만, RNAi 벡터는 ZsGreen(그림 2A)을제공하기 때문에 변형 된 접근 법을 사용했습니다. 먼저, 4T1 세포는 반?...

토론

메서드의 중요한 단계
주어진 세포주 및 마우스 균주에 대해 주입된 세포수(단계 3)를 최적화하는 것이 중요하며, 이는 실험의 형태및 길이에 크게 영향을 미칠 수 있다. 너무 많은 세포가 주입되거나 전이가 너무 오래 증가하는 경우에, 전이가 평가하기 어려운 유전 조작의 효력을 만드는 계산하기 어려울 지도 모릅니다. 그러나, 너무 적은 세포가 주입되는 경우에, 몇몇 또는 전혀 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE Gel			For western blot
2.5% Trypsin	Gibco	15090-046	Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate	Corning	3922	For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes			For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)	Taconic	BALB-F	For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular	VWR Ameresco	97061-416	For western blot
Cell lysis buffer	Cell Signaling		For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm	Celltreat	40-229749-CS	For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber			For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit	Promega	E1960	For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline	Himedia	TS1006	For PBS
EDTA	VWR	97061-406	Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin	VWR	97068-085	Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager	Fujifilm		For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb	Cell Signaling	2118	For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo Scientific	31460	For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT	Invitrogen	R70007	Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose	GE Healthcare life sciences	SH30243.01	Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade	VWR Ameresco	97064-810	For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA	Molecular devices		For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej			Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane	Biorad	1620177	For western blot
Isoflurane			For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)	PerkinElmer	CLS136340	For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)	Leica Microsystems		Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine	Gibco	25030-081	Component of complete growth media
Lipofectamine 3000	Life technologies	L3000008	For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)	PerkinElmer		Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1	Karmanos Cancer Institute	Aslakson, CJ et al.,1992	Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0	Fujifilm		Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)	Gibco	31985-062	For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit	Thermo Scientific	23225	For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets	Thermo Scientific	A32957	Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets	Thermo Scientific	A32953	Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	45-H9268	For infection
Puromycin	Sigma-Aldrich	45-P7255	For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer			For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer			For western blot
TAZ (V3886) Antibody	Cell Signaling	4883	For western blot
TBST buffer			For western blot
TC20 automated cell counter	Bio-Rad		For counting cells
Vectors			See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope	VWR	89404-464	For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer			For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt	PerkinElmer	122799	Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)	Roche	6365787001	For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb	Cell Signaling	14074	For western blot