분변 미생물군 이식 및 장내 IgA 코팅 박테리아 유병률 검출

요약

우리는 3일 만에 장내 세균을 고갈시키는 효율적인 방법을 확립한 후 생쥐의 신선하거나 냉동된 장 내용물로 만든 배설물을 통해 대변 미생물총(microbiota)을 이식했습니다. 또한 장에서 IgA 코팅 박테리아의 빈도를 감지하는 최적화된 방법을 제시합니다.

초록

장내 미생물총(microbiota)은 인간의 건강과 질병에 다발성 역할을 합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 장내 세균의 생물학적 기능을 전체 또는 종 수준에서 조사하는 효과적인 방법입니다. 여러 가지 FMT 방법이 발표되었습니다. 여기에서는 며칠 만에 장내 미생물총(microbiota)을 성공적으로 고갈시킨 다음, 신선 또는 냉동 기증자의 장 내용물에서 분변 미생물총(microbiota)을 기존 마우스에 이식하는 FMT 프로토콜을 제시합니다. Real Time-PCR을 적용하여 세균 고갈의 효능을 시험합니다. 그런 다음 16S 리보솜 RNA(rRNA)의 염기서열분석을 적용하여 수용자 마우스에서 장내 미생물총(microbiota)의 상대적 풍부함과 정체성을 테스트합니다. 또한 장내 면역글로불린 A(IgA)로 코팅된 박테리아의 유세포 분석 기반 검출 방법을 제시합니다.

서문

다양한 장내 미생물총(microbiota)은 숙주 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 마이크로바이옴은 음식에서 영양소의 소화 및 흡수, 병원체 감염에 대한 방어, 면역 체계 발달 조절 및 면역 항상성에 이르기까지 다양한 생리학적 과정을 돕습니다¹. 장내 미생물 구성의 섭동은 암², 자가면역질환³, 염증성^장질환4, 신경계 질환⁵, 대사성 질환^6,7 등 많은 질병과 관련이 있습니다. 무균(Germ-free, GF) 마우스는 분변 미생물군 이식 모델에서 미생물총(microbiota)의 생물학적 효과를 연구하는 강력한 도구입니다⁸. 그러나 GF 사육 환경은 매우 엄격하며 이 마우스에서 분변 미생물군 이식(FMT)을 수행하는 것은 비용이 많이 듭니다. 또한, GF 마우스는 기존 마우스와 비교하여 박테리아 침투를 조절하는 장벽 및 점막 특성이 다릅니다⁹. 이러한 요인은 연구에서 GF 마우스의 광범위한 적용을 제한합니다. GF 마우스를 사용하는 것의 대안은 항생제 칵테일 다음에 FMT를 사용하여 기존 마우스의 미생물총(microbiota)을 고갈시키는 것입니다. 이전에 보고된 FMT 방법은 잘 설명되어 있지 않고 일관성이 없습니다. 따라서, 종래의 마우스를 이용하여 FMT를 수행하기 위해 실현 가능하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜을 수립할 필요가 있다.

성공적인 FMT를 위해서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 미생물군 고갈의 효율성이 첫 번째 중요한 단계입니다. 박테리아 고갈의 경우, 단일 광범위 항생제(예: 스트렙토마이신¹⁰) 또는 항생제 칵테일(3중 또는 4중 항생제 치료)의 사용이 보고되었다^11,12. 암피실린(ampicillin), 메트로니다졸(metronidazole), 네오마이신(neomycin), 반코마이신(vancomycin)을 포함한 4중 항생제 치료가 가장 효과적인 요법으로 밝혀졌으며 여러 연구에서 사용되었다 13,14,15. 사용되는 항생제의 종류 외에도 투여 경로, 투여 용량 및 항생제 치료 기간은 박테리아 고갈의 효능에 영향을 미칩니다. 일부 연구자들은 위장관의 박테리아를 제거하기 위해 식수에 항생제를 적용한다¹⁵. 그러나 각 마우스가 이런 식으로 받는 항생제의 복용량을 조절하기는 어렵습니다. 그러므로, 후속 연구에서, 연구자들은 만족스러운 고갈을 달성하기 위해^1-2주 동안 경구 위장으로 생쥐를 항생제로 처리했다 12. 그러나 항생제의 장기 사용은 항생제 자체가 설치류 모델의 일부 질병에 영향을 미칠 수 있기 때문에 문제가 될 수 있습니다¹⁶. 따라서 미생물총(microbiota) 고갈을 위한 더 빠르고 효율적인 방법이 필요합니다.

분변액 준비는 성공적인 FMT를 보장하기 위한 또 다른 핵심 단계입니다. 위장관에서 pH는 위장의 1에서 근위부 및 원위부의 7 사이입니다⁹. 위장의 미생물총(microbiota)은 산도가 높기 때문에 제한적이며, 헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori)¹⁷을 포함합니다. 근위부는 간-장 순환을 위한 담즙산을 생성하며, 지방, 단백질, 포도당 소화와 관련된 미생물총(microbiota)을 함유하고 있습니다. 원위 장관에는 혐기성 세균이 풍부하게 서식하고 있으며 높은 미생물 다양성을 보인다¹⁸. 장내 미생물총(microbiota)의 공간적 이질성을 감안할 때, 분변액 준비를 위해 장관의 다른 영역에서 장 내용물을 분리하는 것이 필수적입니다. 또한 FMT를 수행할 때 기증자 샘플의 특성(예: 신선 또는 냉동 샘플), 이식 빈도 및 기간을 포함한 다른 요인이 중요합니다. 냉동 대변은 기존 마우스에서 인간의 장내 미생물총(microbiota)을 군집화하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다¹⁹. 이와는 대조적으로, 동물 기증자의 신선한 대변을 사용하는 FMT는 동물 모델에서 더 적절하고 일반적으로 사용된다^20,21. FMT 빈도와 지속 시간은 실험 설계 및 모델에 따라 다릅니다. 이전 연구에서는 FMT를 매일 또는 이틀에 한 번씩 수행했습니다. 이식 기간은 3일²²에서 5주²³까지 다양했다. 위의 요인 외에도 무균 수술 환경을 유지하고 멸균된 수술 기구를 사용하는 것은 예상치 못한 환경 박테리아 오염을 방지하는 데 중요합니다.

장내 미생물총(microbiota)은 면역글로불린 A(IgA)를 발현하는 세포의 축적을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 우세한 항체 이소형인 IgA는 중화 및 배제를 통해 숙주를 감염으로부터 보호하는 데 중요합니다. 친화성이 높은 IgA는 장 내강으로 transcytos되어 문제가 되는 병원체와 결합하고 코팅할 수 있습니다. 대조적으로, IgA로 코팅하면 박테리아에 대한 집락화 이점을 제공할 수 있습니다²⁴. 병원체에 의한 IgA와 대조적으로, 토착 공생에 의한 IgA는 친화력과 특이도가 낮다²⁵. IgA로 코팅된 장내 세균의 비율은 일부 질병에서 현저하게 증가한 것으로 보고되었다^25,26. IgA로 코팅된 박테리아는 IgA 생산의 양성 피드백 루프를 시작할 수 있습니다²⁷. 따라서 IgA가 코팅된 박테리아의 상대적 수준은 장내 염증 반응의 정도를 예측할 수 있습니다. 사실, 이 조합은 유세포 분석²⁸을 통해 검출할 수 있습니다. Floris 등²⁷, Palm 등²⁵, Andrew 등²⁹는 IgA 기반 분류를 사용하여 생쥐에서 IgA⁺ 및 IgA^- 분변 박테리아를 획득하고 16S rRNA 염기서열분석을 통해 분류군 특이적 코팅장 미생물총(coated-intestinal microbiota)을 특성화했습니다.

이 연구에서는 장내 우성 박테리아를 효율적으로 고갈시키고 회장과 결장의 내용물에서 분리된 신선하거나 냉동된 배설물 미생물총으로 기존 마우스에 군집화하는 최적화된 방법을 설명합니다. 또한 장에서 IgA 결합 박테리아를 검출하기 위해 유세포 분석을 기반으로 하는 방법을 시연합니다.

프로토콜

동물 실험은 중국의 동물 관리 및 사용에 대한 현행 윤리 규정에 따라 수행되었습니다.

참고: 동물은 25°C에서 12시간 명암 주기로 통제된 환경에서 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에 사육되었습니다. 음식은 쥐에게 먹이기 전에 방사선 조사되었습니다. 식수와 케이지는 사용 전에 오토클레이브 처리되었습니다. 8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스는 1주일 동안 순응 후 연구에 사용되었습니다. 그들은 실험 설계에 따라 여러 그룹으로 나뉘었습니다. 각 그룹은 적어도 3마리의 마우스로 구성되었습니다.

1. 장내 미생물군 고갈

1. 항생제 칵테일 제제
   1. 0.5mg/mL 반코마이신 염산염, 1mg/mL 메트로니다졸, 1mg/mL 암피실린 나트륨염 및 1mg/mL 네오마이신 황산염이 포함된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 항생제 용액을 준비합니다.
      알림: 항생제는 2–8°C에서 보관하고 직사광선을 피하십시오. 항생제 칵테일 용액을 신선하게 준비하고 즉시 사용하십시오.
2. 치료 요법
   1. 3일 동안 준비된 항생제 칵테일 200μL를 #10 바늘로 마우스에게 경구 투여합니다. 한 손으로 마우스를 수직으로 잡고 다른 손으로 바늘의 각도를 조정하여 위에 닿지 않도록 합니다.
      알림: 식도와 위의 표면 손상으로 인해 염증이나 사망에 이를 수 있으므로 마우스가 몸부림치지 않도록 부드럽게 다루어야 합니다.
   2. 1.1.1 단계에 표시된 것과 동일한 농도로 식수에 항생제를 첨가하십시오.
   3. 3일 후, CO₂ 질식으로 마우스를 희생합니다.
   4. 멸균 기구를 사용하여 복부를 무균적으로 절개합니다. 관장에서 2cm 떨어진 곳에서 회장의 2cm 관을 잘라냅니다. 멸균 핀셋을 사용하여 요로의 한쪽 끝을 고정하고 요관에서 신선한 내용물을 짜서 미리 계량된 튜브에 넣습니다.
   5. 맹장의 내용물을 모으려면 수술용 가위로 반으로 자릅니다. 맹장의 각 절반의 내용물을 미리 계량된 튜브에 짜냅니다.
3. 장내 미생물군 고갈 효능을 평가합니다.
   1. 미성숙 마우스와 항생제 칵테일 처리된 마우스의 회장 또는 맹장에서 분리된 장 내용물의 무게를 측정하고 제조업체의 지침에 따라 키트를 사용하여 대변 미생물총 DNA를 추출합니다. 공식에 따라 DNA 농도를 결정하십시오.
      
      농도_샘플 (μg/mL) = OD₂₆₀ x 50
       
   2. 표준 원곡선을 구성합니다.
      1. V3-V4 특이적 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 대장균 유전자를 증폭합니다. 95 °C에서 1 분 동안 변성, 10 초 동안 95 ° C, 30 초 동안 60 ° C, 30 초 동안 72 ° C의 40 사이클 동안 증폭합니다.
      2. 증폭된 산물을 TA 벡터에 연결하여 플라스미드를 구성합니다. 제조업체의 지침에 따라 TA 벡터 키트로 배양물을 복제합니다.
      3. 1.3.1단계에서 설명한 대로 OD₂₆₀ 값을 기준으로 플라스미드 농도(ng/μL)를 측정합니다.
         참고: 플라스미드 농도 단위는 DNA 농도 단위와 다릅니다.
      4. 다음 공식을 사용하여 복제 수를 계산하며, 여기서 MW는 분자량을 나타냅니다.
         
         1 μL = 농도 (ng/μL) x ^10-9 x 6.02 x 10²³/(MW_{플라스미드} x 660)
          
      5. 플라스미드를 이중 증류수로 최종 농도 40 μg/μL로 재구성합니다. 8단계로 구성된 10x gradient dilution series를 준비합니다. PCR 증폭 후 로그(_{플라스미드} 복사)(X축)에 대해 C_T 값(Y축)을 표시하여 표준 곡선을 구성하며, 여기서_{C T}는 타겟 증폭을 위한 임계값 주기를 나타냅니다. 플롯에서 방정식을 추출합니다(이 경우 y = -3.07x + 45.07, R² = 0.994).
   3. 1.3.2.1단계에서 얻은 DNA 샘플 1.3.2.1 단계에서 설명한 대로 순수 대조군과 항생제 칵테일 치료군의 회장 또는 맹장에서 추출한 DNA 샘플 1 μL를 Real-time PCR로 증폭합니다. 1.3.2.5 단계의 표준 곡선을 기반으로 DNA 샘플의 1 μL에서 복제 수를 계산 한 다음 다음 공식을 사용하여 총 복제 수를 계산합니다.
      가중 샘플의 총 복제 수(mg당) = 복제 수 × 총 DNA 부피/샘플의 초기 중량
4. 16S rRNA V3 및 V4 영역을 염기서열분석하여 미생물군 DNA를 분석합니다.

2. 대변 미생물군 이식

1. 신선 및 냉동 대변 샘플을 위한 분변 유체 준비
   알림: 모든 기기는 기존 박테리아 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 75% 알코올에 담가둡니다. 회장과 결장 내용물을 채취할 때 오염을 피하는 것이 중요합니다.
   1. CO₂ 질식으로 3-5 마리의 기증자 마우스를 희생합니다.
   2. 1.2.4단계에서 설명한 대로 회장의 내용물을 수집합니다.
   3. 결장에 내용물을 모으기 위해서는 먼저 항문 근처를 절개하고 위쪽 2cm를 자릅니다. 1.2.4단계에서 설명한 대로 내용을 추출합니다. 공기 노출을 줄이기 위해 1분 안에 샘플을 수집하십시오.
   4. 얼어붙은 배설물의 경우 2.1.2 및 2.1.3 단계에서 설명한 대로 회장 또는 결장 내용물을 수집하고 액체 질소의 내용물을 급속 동결합니다.
   5. 사용할 준비가 될 때까지 -80°C 냉동고에 샘플을 보관하십시오.
2. 내용물을 풀링하고 무게를 잰 다음 구슬이 있는 신선한 멸균 튜브를 추가합니다. 냉동 샘플의 경우 무게를 측정하기 전에 얼음 위에서 배설물 알갱이를 해동하십시오.
3. 멸균 PBS를 튜브에 넣고 5mL 주사기 바늘을 사용하여 PBS(PBS 1mL/대변 펠릿 0.2g)에 대변 펠릿을 재현탁합니다. 배설물 펠릿을 구슬로 완전히 균질화하고 각각 1분 동안 3회 와류를 일으킵니다.
4. 800 x g 에서 3분 동안 원심분리기를 사용한 다음 70μm 세포 스트레이너를 통과하여 상층액을 여과합니다. 여과된 배설물을 멸균 튜브에 모아 즉시 FMT에 사용합니다.

3. 대변 미생물군 이식 절차

1. 미생물총이 고갈된 마우스에게 7일 동안 이틀에 한 번씩 구강 배당을 통해 준비된 분변액 200μL를 투여합니다. 200μL의 멸균 PBS를 사용한 Gavage control 마우스.
2. CO₂ 질식으로 마우스를 희생시키고 2.1.2 및 2.1.3 단계에 따라 회장과 결장에서 내용물을 수확합니다. 추가 처리가 있을 때까지 -80°C에서 샘플을 보관하십시오.
3. 1.3.1단계에서 설명한 대로 회장과 결장 내용물의 미생물군 DNA를 추출합니다. 16S rRNA 염기서열분석을 통해 이식된 마우스의 장내 미생물군 구성을 확인합니다.

4. IgA 코팅 박테리아 측정

1. 시료 전처리
   1. 2.1.2 및 2.1.3 단계에서 설명한 대로 기증자 마우스에서 50mg의 배설물 펠릿을 수집하고 4°C에서 1시간 동안 1mL의 멸균 PBS에서 배양합니다. 비드 비터를 사용하여 펠릿을 5초 동안 균질화합니다.
   2. 용액을 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 70μm 스트레이너를 통해 여과한 후 상층액을 수집합니다.
      알림: 고속 원심분리를 피하십시오.
   3. PBS(FACS 완충액)에서 1% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL에 상등액 5μL를 추가합니다. 8,000 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛하고 상층액을 버립니다.
   4. 펠릿을 1mL의 FACS 완충액에 재현탁하고 8,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
      참고: 여기에 사용된 볼륨을 최적화해야 할 수 있습니다. 이 단계에서 상층액을 너무 많이 투여하면 IgA로 코팅된 박테리아의 양성 신호가 가려질 수 있습니다.
   5. 10% 염소 혈청이 함유된 100μL의 PBS에 펠릿을 재현탁하고 얼음 위 또는 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 튜브에 FACS 완충액 1mL를 추가하고 8,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿에 넣습니다.
2. 유세포 분석
   1. 단계 4.1.5에서 얻은 펠렛을 비오틴 항-마우스 IgA 항체(1:100) 및 APC 접합 항-비오틴 항체(1:100)를 포함하는 200μL의 FACS 완충액으로 재현탁하고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 튜브에 FACS 완충액 1mL를 추가하고 8,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
   3. 녹색 형광 핵산 염색(1:200)을 포함하는 FACS 완충액 200μL를 첨가하여 단계 4.2.2의 펠릿을 염색하고 4°C에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 1mL의 FACS 완충액과 원심분리를 8,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 펠릿에 추가합니다.
   5. 측정하기 전에 펠릿을 250μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
   6. 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

결과

이 연구에 사용된 FMT 일정은 그림 1에 요약되어 있습니다. 항생제 칵테일로 처리한 후, 16S rRNA region을 염기서열분석하여 장내 미생물군 고갈의 효율을 분석하였다. 미성숙 마우스의 회장에서 196종을 검출한 반면, 3일 항생제 치료로 박테리아 종을 35종으로 급격히 줄였습니다(그림 2A). 항생제 칵테일 치료를 받은 쥐에서만 8종이...

토론

고갈 절차에 사용되는 항생제는 항균 특성이 다릅니다. 반코마이신은 그람 양성 박테리아에 특이적입니다³⁰. 경구용 독시사이클린은 암컷 C57BL/6NCrl 마우스에서 상당한 장내 미생물군 구성 변화를 유도할 수 있다³¹. 네오마이신(Neomycin)은 대부분의 장내 세균을 표적으로 하는 광범위한 항생제이다³². 그러나 장내 염증을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe needle	Sheng guang biotech	5mL
70 µm cell strainer	BD biosciences	352350
Ampicillin sodium salt	AMERESCO	0339
APC Streptavidin	BD biosciences	554067
Biotin anti-mouse IgA antibody	Biolegend	407003
Bovine serum albiumin (BSA)	Sigma	B2064-50G
C57BL/6J mice	Chengdu Dashuo
CO2	Xiyuan biotech
E.Coil genome DNA	TsingKe
Eppendorf tubes	Axygen	MCT150-C
Fast DNA stool mini Handbook	QIAGEN	51604
Metronidazole	Shyuanye	S17079-5g
Neomycin sulfate	SIGMA	N-1876
Oral gavage needle	Yuke biotech	10#
pClone007 Versatile simple TA vector kit	TsingKe	007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Hyclone	SH30256
Precellys lysing kit	Precellys	KT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIX	Vazyme	Q411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Thermo fisher scientific	S34855
V338 F primer	TsingKe		ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primer	TsingKe		GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochloride	Sigma	V2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometer	BD biosciences
Bead beater vortx	Scilogex
BIORAD CFX Connect	BIORAD
Centrifuge machine	Eppendorf
Illumina MiSeq	Illumina
Nanodrop nucleic acid measurements machine	Thermo fisher scientific
Surgical instruments	Yuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015	Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database