장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

요약

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

초록

공초점 화상 진찰을 사용하여 창자의 중요한 현미경 검사는 살아있는 동물에 있는 상피 세포 흘리기 및 장벽 누설의 실시간 관찰을 허용합니다. 따라서 마취된 마우스의 장 점막은 특이하지 않은 스테인링(acriflavine)과 형광 추적자(로다민-B dextran)로 토탈로 염색되어 식염수 용액-헹구는 플레이트에 장착되어 공초점 현미경을 사용하여 직접 이미지화된다. 이 기술은 경구 투여 된 추적자의 경막 통과와 같은 장 투과성의 누설을 식별하기 위해 다른 비 침습적 기술을 보완 할 수 있습니다. 이 외에도 여기에 제시 된 접근 방식은 실시간으로 셀 흘리는 이벤트를 직접 관찰 할 수 있습니다. 적절한 형광 기자 마우스와 함께,이 방법은 장 상피 세포 압출을 제어하는 세포 및 분자 메커니즘뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에 빛을 흘리는 데 적합합니다. 지난 수십 년 동안, 내피성 현미경 검사를 이용한 흥미로운 연구는 내피 투과성, 면역 세포 창자 호밍, 면역 상피 통신 및 발광 성분의 침입에 대한 지식에 기여했습니다. 함께, 여기에 제시 된 프로토콜은 상피 세포 압출을 제어하는 메커니즘의 이해를 증가도움이 될뿐만 아니라, 다른 조직에서도 다른 매우 역동적 인 세포 과정을 시각화하는 도구로 사용되는 다른 접근 법의 발달의 기초가 될 수 있습니다. 기술적 한계 중, 특정 조직의 광학 특성뿐만 아니라 선택된 이미징 기술 및 현미경 구성은 차례로 이미징 작업 거리 및 획득 된 이미지의 해상도를 결정할 것입니다.

서문

장은 유해한 발광 물질에 대한 영양과 보호와 상충하는 프로세스, 즉 영양과 보호를 가능하게 하는 엄격하게 조절된 기능을 가진 고도로 전문화된 기관입니다. 인체와 환경 사이의 안감, 장 상피는 물리적 및 면역 장벽역할을 하며 창자^1,,2에서점막 항상성의 유지에 기여한다. 상피 무결성의 상실및 팽팽한 접합 투과성 증가는 염증성 장질환(IBD)^{3,,4,,5,,6과}연관되는 것으로 잘 알려져 있다. 상피 변경은 IBD에 있는 만성 장 염증을 위한 원인 그리고 이차 증폭기로 그 때 고려됩니다. 따라서, IBD 환자의 창자에 있는 초기 상피 변경의 향상한 이해는 IBD 재발의 믿을 수 있는 예측 및 후속 예방을 위한 상피 무결성을 회복하기 위하여 새로운 전략의 발달을 위한 엄청난 가치가 일 것입니다.

장 상피는 복잡하고 엄격하게 규제된 회전율 프로세스를 따릅니다. 토굴 바닥에서, 다능성 줄기 세포에서 유래한 말단 분화장 상피 세포(IeC)는 고루 팁으로 위쪽으로 이동하여 노인/손상된 세포가 루멘^7로흘려집니다. 분열과 세포 압출 사이의 평형은 장 상피 세포 수의 유지를 가능하게 하고, 틈새 및 누설의 형성을 피하고, 잠재적으로 세포 질량 및 종양^발생으로이어지는 상피 세포의 축적을 피할 수 있다^8,9,,10. 창자 상피의 생리적 갱신에서 발산하는 상피 세포의 핵심 역할에도 불구하고, 빌루스 팁에서 세포의 압출을 구동하는 분자 메커니즘에 대한 지식은 제한적이다. 따라서 상피 세포 흘리기와 관련된 분자 이벤트의 서열에 대한 정확한 설명을 제공하는 기본 연구가 필요합니다.

장 점막 내의 다른 세포 모형 사이 복잡한 상호 작용은 상피 회전율 및 장 항상성을 조절하는 분자 기계장치를 이해하는 열쇠입니다. 따라서 생체 내 연구는 이 맥락에서 시험관 내 및 전 생체 접근법보다 높은 이점을 제공합니다. 더욱이, 실시간 이미징 기술은 특정 현상을 통제하는 사건의 순서의 설명을 허용합니다. 이러한 맥락에서, 고동적인 프로세스의 연구는 조직의 직접 관찰을 위한 최적화된 고해상도 기술의 사용을 요구합니다. 인트라바이탈 이미징 기술은 창자에 있는 상피 세포 흘리기의 연구 결과에 대한 유일한 적합한 공구로 나타납니다.

용어 "인트라바이탈 현미경 검사법"은 살아있는^동물(11)내의 토착 환경에서 세포와 조직을 직접 시각화하기 위해 고해상도 이미징 기술(multiphoton 또는 공초점 현미경 검사법)을 활용한 실험적 접근법을 말한다. 최대 단일 셀 해상도까지 생체 내 정보를 실시간으로 수집할 수 있으며 정적 또는 저해상도 방법에 비해 명확한 이점을 수반합니다. 인트라바이탈 현미경 검사는 상호 보완적인 정보를 제공하고 조직 처리로 인한 유물과 같은 고전 및/또는 고급 기술의 일부 한계를 극복합니다. 대조적으로, 인트라베이티 현미경 검사법의 주요 한계는 조직이 대부분의 경우에 수술을 요구하는 현미경에 직접 노출되어야 한다는 것입니다. 정교한 접근법은 활력을 보존하고 이미지 조직(스킨폴드 챔버 및 이미징 윈도우)의 영향을 최소화하지만( 스킨폴드 챔버 및 이미징 윈도우)^12,,13,대부분의 경우 조직(skin flaps)의 외부화를 위해 간단한 피부 절개가 수행된다.¹⁴ 지난 10 년 동안, 이러한 접근 방식은 이전에 는 불가결했던 매우 역동적 인 프로세스에 대한 주요 증거를 기여했습니다. 번역적으로, 실시간 화상 진찰은 줄기 세포및 백혈구 homing^15,뿐만 아니라 암 보급 및 전이 형성에 새로운 생물학 통찰력을 제공^13,,16. 임상 적 맥락에서, 내시경 검사는 현재 IBD^18,,19와같은 암¹⁷ 및 위장 질환의 진단 도구로 이용된다. 공초점 모자이크 현미경 검사는 수술 중 빠른 병리학 도구가되었다^20. 함께, 인트라바이탈 현미경 검사는 최근 병원에서 생물 의학 연구 및 미래 응용을위한 귀중하고 다재 다능한 도구로 부상했습니다.

인트라바이탈 현미경 검사는 장 상피 누설의 실시간 시각화및 상피 세포 흘리기 사건의 관찰을 위해 구현된다. 장 투과성의 누설은^{혈청(21)에서}형광 추적기의 경수화와 같은 다른 생체 내 비침습적 기술에 의해 식별될 수 있다. 그러나, 이 기술은 파기 성능의 직접적인 관찰이나 파라 세포 와 트랜스 세포 투과성 사이의 분리를 허용하지 않습니다. 표준 추적 실험과 인트라베이티 현미경 검사법의 조합은 적절한 접근법을 나타냅니다: i) 장 투과성 에서 교란을 식별하고, ii) 파라-세포 상피 투과성 사이의 분리. 세포 흘리기 이외에 생체 내 형광 라벨링과 함께 중요한 현미경 검사법은 다른 세포 및 분자 메커니즘(예를 들어, 형광 기자^{마우스(22)을} 이용한 세포 흘리기 중 팽팽한 접합 재분배 또는 장 점막 내의 IeCs 및 기타 세포 간의 상호^작용)의연구를 가능하게 한다.

여기에 제시된 방법은 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여 장 점막의 실시간 관찰을 가능하게 하는 인트라바이탈 현미경 검사법의 적응을 나타낸다. 따라서, 우리는 장 상피 세포(IGt1b^iΔIEC 마우스)에서 GGTase (Geranylgeranyltransferase)의 조건부 녹아웃 마우스를 사용하며, 이는 심각한 장 질환과 상피 투과성(24)으로 고통받기 때문에.²⁴ 마우스의 외과 적 준비 및 장 점막의 염색뿐만 아니라 이미징 획득 및 후 분석에 사용되는 적절한 설정이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 장 상피 세포 흘리기의 역학 및 운동학에 대한 현재 지식에 기여하는 미래 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 장 점막의 표면에서 발생하는 다른 현상을 연구하기 위한 각종 적응을 위한 기초가 될 수 있고, 심지어 그밖 조직에서.

프로토콜

다음 의정서는 에를랑겐(독일 뷔르츠부르크 레게룽 폰 운테르프랑켄)의 관련 지방 당국의 승인을 받았습니다. 마우스는 특정 병원균 없는 조건하에서 보관하였다.

참고: IEC 내GGTase 매개 조형물의 억제는 Pggt1b^iΔIEC 마우스^24에서장 투과성의 심각한 변경을 일으킨다. 따라서, 이 마우스 모델은 프로토콜이 장 장벽 결함을 연구하는 데 어떻게 유용할 수 있는지 를 보여주기 위해 사용되었다. 그러나 이 프로토콜은 다른 마우스 선의 연구에 사용될 수 있습니다.

1. 외과 준비 및 마우스 장 점막 염색

참고: 수술 준비는 이전에 설명된^{프로토콜(25)을}기반으로 합니다. 수술 준비 중에 마취 된 마우스를 빨간 램프 아래에 두어 체온이 떨어지지 않도록하십시오.

1. 케타민/자일라진(96 mg/kg 케타민; 12.8 mg/kg 자일라진)의 인트라테오네 주사로 마우스를 마취시킵니다. 눈꺼풀 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다.
2. 면 봉오리를 사용하여 아이 보호 크림을 바르습니다.
3. 표준 집게와 직선 미세 가위를 사용하여 왼쪽 복부 영역에 절개 (1cm)를 만듭니다.
4. 내장의 세그먼트를 외부화 (5-7cm, 약).
5. 시간 시간 측에서 전기 카운터화에 의해 세로로 외부장 세그먼트를 엽니 다.
6. 점막을 노출하고 배설물 함량을 제거하기 위해 식염수 용액으로 곧 헹구는 다.
   참고: 선택적으로, 연동으로 인한 모션 아티팩트를 피하기 위해 창자에 자일라진을 직접 적용합니다.
7. 장 점막의 표면에 acriflavine 및 로다민-B dextran (10 kDa)를 얼룩.
   1. 점막에 드롭하여 떨어뜨리고 3분 동안 배양하여 1 mg/mL 아크리플라빈 용액(100 μL)을 적용합니다. PBS로 나머지 솔루션을 씻어내라.
   2. 점막에 떨어뜨리고 3분 동안 배양하여 배관하여 2 mg/mL 로다민-덱스론 용액(100 μL)을 적용하십시오. PBS로 나머지 솔루션을 씻어내라.
      참고 : 선택적으로, 무균 면화로 준비에서 혈액을 제거합니다.
8. 미리 데워진 식염수 용액(37°C)으로 헹구는 챔버에 장착된 커버 슬라이드에 마취마우스 스핀을 놓습니다.
   참고: 열린 장 세그먼트는 덮개 슬라이드에 발광 표면을 아래로 배치합니다.
9. 반전 된 현미경 단계에 준비 (챔버에 마취 마우스)를 놓습니다.
10. 동물을 이더스말 패드(약 37°C)로 덮습니다.
11. 즉시 인트라바이탈 현미경검사로 진행하십시오.
    참고: 조직과 세포 사멸의 탈수를 피하기 위해 미리 따뜻워진 식염수 용액으로 헹구는 수술 준비를 유지하십시오.

2. 인트라바이탈 현미경 검사법

참고: 마취, 수술 및 이미지 수집 사이의 긴 대기 시간을 피하기 위해 수술 준비를 시작하기 전에 2.1 단계를 수행하십시오. 필요한 경우, 마취제의 추가 복용량은 화상 진찰 실험을 위한 마취의 밑에 그(것)들을 지키기 위하여 외과적으로 준비된 동물에게 주어질 수 있습니다.

1. CLSM 현미경을 설정합니다.
   1. 현미경 베이스와 스캐너 상자를 켜서 CLSM 현미경을 시작합니다. 시작 버튼을 눌러 컴퓨터를 켭니다.
   2. 아이콘을 두 번 클릭하여 이미지 수집 소프트웨어(예: LAS X)를 시작합니다. 적절한 구성을 선택합니다(구성: 기계; 현미경 : DMI6000) 및 확인을 클릭합니다.
      1. 적절한 해상도를 정의합니다. 구성으로 이동 | 하드웨어 | 해상도 | 비트 깊이. 12를 선택합니다.
   3. 획득 메뉴로 이동합니다. 드롭다운 메뉴에서 이미지 수집 모드에 대한 xyzt를 선택합니다. 드롭오프 메뉴(20배 또는 40배)에서 목표를 선택합니다.
   4. 순차적 획득 설정을 설계합니다. Seq를 클릭합니다. 추가 단추(+)를 클릭하여 두 번째 시퀀스를 추가합니다. 프레임 사이를선택합니다.
      1. 서열 1구성(아크리플라빈 검출; 416nm 흥분; 514nm 방출). 보이는 레이저 상자를 켭니다. PMT1(ON)을 활성화합니다. 방출 파장 창(490-550 nm)을 정의합니다.
      2. 서열 2(로다민B-dextran 의 검출; 570 nm 여기; 590 nm, 방출). 보이는 레이저 상자를 켭니다. PMT2(ON)를 활성화합니다. 방출 파장 창(550-760)을 정의합니다.
   5. 해당 레이저(488 및 552)를 활성화합니다. 구성으로 이동 | 레이저. 488 및 552 nm 레이저를 활성화 (켜기).
2. 설정을 현재 실험의 특정 피처로 조정합니다.
   1. 광원(프레스 파워)을 켭니다. 현미경 단계에 제제(챔버내 마취 마우스)를 배치하고 조명 축이 조직 준비에 초점을 맞출 때까지 xy 위치를 변경합니다.
   2. 표준 광원과 안장을 사용하여 관심 분야를 선택합니다.
      1. 필터 큐브(I3)를 선택합니다. 셔터를 엽니다. 매크로 및 마이크로 휠을 사용하여 장 점막의 표면에 초점을 맞춥니다. XY 위치를 변경하여 시야 내에서 여러 개의 악의적인 빌드를 시각화할 수 있는 영역을 검색합니다.
   3. 로다민-엑스트라넨 염색도 해당 지역에서 볼 수 있는지 확인합니다. 필터 큐브(N2.1)를 변경합니다. 안장을 통해 이미지를 확인합니다.
   4. 소프트웨어에서 CLSM 이미지 수집을 시작합니다. 두 시퀀스에 대한 설정을 최적화합니다.
      1. 시퀀스 1을 선택합니다. 시퀀스 1에 대한 레이저 전력, 게인 및 오프셋을 조정합니다.
      2. 시퀀스 2를 선택합니다. 시퀀스 2에 대한 레이저 전력, 게인 및 오프셋을 조정합니다.
   5. z 스택 범위를 정의합니다.
      1. Z 스택 드롭오프 메뉴를 엽니다. z축 제어를 사용하여 점막의 표면에 초점을 맞춥니다. 시작 을 누릅니다.
      2. 신호가 여전히 감지가능한 하단 제한에 초점을 맞춥니다. 종료를누릅니다.
      3. z 스택(10)의 숫자를 정의합니다. 2회 연속 시간 포인트에 대해 2분 이상 경과하지 마십시오.
   6. 시간 설정을 정의합니다. 시간 메뉴로 이동합니다. 최소화를클릭합니다. 중지될 때까지 획득을 선택합니다.
   7. 선 평균을 정의합니다. Seq 1을 선택합니다. 선 평균 2를 선택합니다. Seq 2를 선택합니다. 선 평균 2를 선택합니다.
3. 해당 이미지를 수집합니다.
   1. 형식(1024 x 1024) 및 속도(400)를 선택합니다. 시작을 누릅니다.
   2. 원하는 이미지 수집 시간 후에 중지를 누릅니다.
4. 파일을 저장합니다. 프로젝트로이동합니다. 해당 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 저장을 로누릅니다.
   1. 파일이름을 적절하게 지정합니다. 적절한 폴더를 선택합니다. 저장을누릅니다.
5. 동물 (자궁 경부 탈구)을 안락사시키고 필요한 경우 악의적 인 분석을 위해 조직을 수집합니다.

3. 이미지 분석 : 세포 흘리기 속도와 장 상피를 결정합니다.

1. 세포 흘리기 속도
   1. 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다.
   2. 프로젝트를 열기로 이동합니다. 적절한 파일을 선택합니다.
   3. 이미지 수집의 총 시간을 정의합니다.
      1. 마지막 전체 z 스택을 선택합니다. 이전에 선택한 시간 점에서 마지막 Z 위치를 선택합니다. 화면 의 오른쪽 하단 모서리에 있는 시간(이미지 수집의 총 시간)을 읽습니다.
   4. 빌루를 선택합니다.
      1. 적절한 Z 스택 위치(빌루의 표면을 선택하지만, 루멘에 이미 흘린 세포 및 기타 구성 요소와의 간섭을 피하기에 충분히 깊음).
      2. 기저 멤브레인의 길이를 측정합니다. 눈금자 도구를 선택합니다. 빌루를 여러 줄로 나누어 전체 빌루스 둘레를 덮거나 그립니다. 다른 값(기초 막의 총 길이)을 추가합니다. 눈금자 도구의 세그먼트를 삭제합니다.
   5. 이미지 수집 의 전체 기간 동안 발생하는 이벤트 수를 계산합니다.
      1. 적절한 크기의 세그먼트로 빌드를 분할합니다. 다양한 시간 지점을 통해 막대를 슬라이딩하여 이벤트/세그먼트의 순서를 분석합니다. 확인된 셀 흘리기 이벤트에 대해 인코딩합니다.
   6. 기저막의 흘리기 이벤트/시간/길이의 수를 계산하여 세포 흘리기 속도를 나타냅니다. 최대 5개의 비방/비디오, 적어도 두 개의 동영상/마우스를 계산합니다. 이 10가지 측정값의 평균을 계산합니다.
2. 누설
   1. 빌루를 선택합니다.
   2. 적절한 Z 스택 위치(빌루의 표면을 선택하지만, 루멘에 이미 흘린 세포 및 기타 구성 요소와의 간섭을 피하기에 충분히 깊음). 상피 세포/빌루스의 총 수를 계산합니다.
   3. 누설 점의 수를 계산 (로다민 dextran의 파라 셀룰러 존재. 이 이벤트는 일시적이며, 이전 및 악의적인 수집 된 사진을 확인하여 확인할 수 있습니다.)
   4. 누설 수/상피 세포의 총 수를 계산합니다. 10개의 다른 빌루스/샘플/비디오를 분석하고 누출 및 투과성 셀/빌루의 평균 수를 계산합니다.

결과

여기에 제시된 프로토콜은 장 상피 누설을 시각화하고 실시간으로 창자에 있는 세포 흘리기 성능을 관찰하기 위하여 인트라VITAL 현미경 기지를 둔 접근법을 기술합니다. 간단히, 마우스는 소장 점막의 표면을 드러내기 위하여 마취되고 외과 준비에 제출됩니다. 그런 다음 II는 아크리플라빈의 국소 적용을 통해 염색됩니다. 발광 로다민 B-dextran은 루멘에서 하위 상피 공간?...

토론

기술적으로 도전적이지만, 인트라바이탈 현미경 기반 방법론은 세포 발산 성능과 같은 매우 역동적인 세포 공정을 실시간으로 시각화하는 독특한 실험 적 접근 방식을 나타냅니다. 지금까지 생체 내에서 세포 압출을 시각화하는 대체 실험 적 접근법은 없습니다. 우리는 이 프로토콜이 장 집상성의 유지에 있는 역할을 하는 다양한 세포 프로세스의 설명에 기여할 수 있다고 믿습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422