기관 절제술을 통해 동맥 내 혈압 모니터링 및 환기를 사용하여 마우스에서 뇌 사멸 유도

요약

우리는 고체 기관 이식의 맥락에서 기관뿐만 아니라 연속적인 이식에 대한 병리 생리적 영향의 영향을 평가하기 위해 뇌 사멸 유도의 뮤린 모델을 제시합니다.

초록

순환기 죽음 후에 살아있는 기증 및 기증둘 다 기관 이식을 위한 대체 기회를 제공하는 동안, 기증자 뇌사 후에 기부 (BD) 아직도 고체 이식을 위한 중요한 근원을 나타냅니다. 불행히도, 뇌 기능의 돌이킬 수없는 손실은 혈역학뿐만 아니라 호르몬 변형을 포함한 여러 병리생리학적 변화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 마침내 전신 염증 반응으로 이어진다. 생체 내에서 이러한 효과의 체계적인 조사를 허용 하는 모델은 부족. 우리는 동종 이식 품질에 BD의 파괴적인 효력에 조사를 도울 수 있던 BD 유도의 murine 모형을 제시합니다. 일반적인 경동맥을 통한 동맥 내 혈압 측정을 구현하고 기관 절제술을 통해 신뢰할 수 있는 환기를 실시한 후, BD는 풍선 카테터를 사용하여 두개내 압력을 꾸준히 증가시킴으로써 유도된다. BD 유도 후 4 시간, 장기 분석 또는 추가 이식 절차에 대 한 수확 될 수 있습니다. 우리의 전략은 뮤린 모델에서 기증자 BD의 포괄적 인 분석을 가능하게, 따라서 고체 장기 이식에 BD 관련 효과의 심층적 인 이해를 허용하고 잠재적으로 최적화 된 장기 사전 컨디셔닝에 길을 포장.

서문

이식은 현재 말기 장기 부전을 위한 유일한 치료 처리입니다. 지금까지 뇌사(BD) 환자는 장기 기증의 주요 원천이었지만, 순환사 후 의기양양한 기증과 기증은 귀중한^대안1. BD는 돌이킬 수없는 혼수 상태에 의해 정의된다 (알려진 원인), 뇌 줄기 반사 및 무호흡증의 부재². 불행히도, BD 기관은 인간 백혈구 항원(HLA)과 무관하게 장기간 이식 생존에서 열등한 결과를 보여준다-불일치 및 감기 허혈시간^3. 한편, 이 항원 독립적 인 위험 인자에 대한 집중적 인 연구는 BD의 결과로 매개 된 병리 생리학적 변화의 세 가지 주요 측면인 혈역학, 호르몬 및 염증성^4의결과로 수행되었습니다.

현재까지 설치류의 실험BD 모델은 주로 쥐를 사용하여 수행되었습니다. BD 다음 고체 기관에 대한 면역학적 결과에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해, 우리는 현재 마우스 모델만이 유전 적 또는 면역 학적 인자에 대한 포괄적 인 조사를 허용하기 때문에 BD의 뮤린 모델을 확립하는 것을 목표로했습니다. 이러한 맥락에서 마우스 시스템은 더 다양한 분석 도구를 제공합니다.

여기에 설명된 바와 같이 BD 유도의 원리는 두개골 아래에 삽입된 풍선 카테터의 인플레이션에 의해 유도된 두개내 압력의 증가에 기초한다. 증가된 두개내 압력은 뇌의 관류를 차단함으로써 BD의 생리적 기전을 모방, 소뇌, 뇌줄기^5,,6. 말초 장기의 충분한 관류를 보장하기 위해, 혈압 측정은 절차 중에 의무적이다. 이러한 목적을 위해 동시에 사용되는 카테터는 유체 치환에 의해 혈압을 안정시키기 위해 식염수 투여를 위한 역할을 한다. BD는 자발적인 호흡의 중단을 동반하기 때문에, 충분한 환기가 보장되어야 합니다. 전기 담요는 생리적 코어 체온을 유지합니다.

요약하면, 이 모델은 BD 유도 상해의 영향에 대한 심층적 인 연구를 가능하게 할 것이다, 백혈구 이동에^7,칭찬 활성화^8,허혈성 재관류 부상^9,및 기타 요인.

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프로토콜

동물 실험은 국립 의학 아카데미에서 준비하고 국립 보건원에 의해 출판 된 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 의학 연구 학회및 가이드에 의해 공식화 된 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 수행되었다 (NIH 간행물 No. 86-23, 개정 1985). 모든 실험은 오스트리아 교육과학문화부(BMWF-66.011/0071-II/3b/2012)의 승인을 받았습니다.

1. 동맥 카테터화

1. 케타민과^{자일라진(10)의} 복강 내 주사와 국소 실습에 따른 진통제(예: 부프레노르핀)로 마우스를 마취시다.  뒷다리를 집게로 꼬집어 마취의 정확한 깊이를 확인합니다.
   참고: 본 연구에서는 8-12주 미만의 남성 C57BL/6N 마우스를 사용하였다(체중 20-25 g). 저자는 같은 나이의 남성 BALB / C를 성공적으로 테스트했지만 다른 균주를 시도하지 않았습니다 (토론 참조).
2. 전기 면도기로 관심 부위(머리, 목)에서 머리카락을 제거합니다. 상처 오염을 방지하기 위해 느슨한 머리카락이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 그 후 70 % 에탄올 / 클로르헨시딘 / 베타 딘으로 수술 부위를 소독하고 외과 의사를 향한 머리와 마우스 척추를 놓습니다.
3. 해부 가위로 자궁 경부 중간 선 절개를합니다.
4. 일반적인 경동맥을 노출시키기 위하여 하악골과 목 근육 조직을 해부하고 그(것)들을 분리합니다. 집게를 통해 주로 무딘 해부를 사용합니다.
5. 세 개의 8-0 배치 오른쪽 공통 경동맥 아래 실크 합자.
6. 근위 합자에 클램프를 놓고 동맥에 긴장을 가져 와서 흐름이 중단되도록하십시오.
7. 가장 말단 합자를 닫습니다.
8. 절개의 두개골 측면에 작고 미리 형성 된 피부 구멍을 통해 동맥 카테터를 삽입하십시오. 카테터가 너무 커서 혈액 역류를 줄이지 못하면 카테터의 내강을 짜고 변형시. 세 합자 모두 고정합니다.
9. 탈구를 피하기 위해 카테터를 피부에 고정시하십시오. 카테터를 미리 형성된 피부 구멍 부위의 피부에 연결하는 봉합사(예를 들어, 5-0 모노필라멘트, 비흡수성)를 사용하여 이 작업을 수행합니다.

2. 기관 절제술

1. 집게를 사용하여 기관 전 근육을 무뚝뚝하게 해부하십시오.
2. 배치 8-0 실크 합자 아래 기관 아래.
3. 일방적인 환기를 피하기 위해 가능한 한 근접적으로 마이크로 가위를 사용하여 자양화하십시오. 두 개의 기관 연골 사이의 수평 절단 라인을 사용합니다.
4. 환기 튜브를 삽입하고 준비된 합자 모두로 고정하십시오.
   참고: 기관의 근위 쪽 끝을 결찰할 필요가 없습니다.
5. 달리는 봉합사 (예 : 6-0 모노 필라멘트, 비 흡수성)로 피부를 닫습니다.
6. 150/min의 주파수와 200 μL의 조수 부피로 마우스를 환기시다.

3. 뇌 사멸 유도

1. 마우스를 취약한 위치로 정렬합니다.
2. 외과 용 가위와 집게를 사용하여 두개골에서 피부를 제거하여 피부를 유지합니다.
3. 왼쪽 정수리 피질 위에 1mm 구경 시추공을 마비시음질로 드릴링합니다. 내부 컴팩트 뼈와 경막 미더를 위반하기 전에 드릴링을 중지합니다.
4. 무딘 집게를 사용하여 두개골의 최종 조직 다리를 관통하여 날카로운 모서리를 제거합니다.
5. 풍선 카테터를 삽입하여 두개골 구멍 내에 완전히 넣습니다. 풍선이 식염수로 미리 채워져 있고 모든 공기가 배출되었는지 확인하십시오.
6. 주사기 펌프의 도움으로 10-15 분 (총 부피 0.8-1.2 mL)의 기간 동안 ~ 0.1 mL / min에서 인플레이션을 시작합니다.
   참고 : 마우스는 근진근, 근막증, 추가 발작 활동 및 고뇌 가스를 나타낼 것입니다.
7. 마우스의 꼬리가 뻣뻣해지고 세워진 후 마우스 뇌가 죽은 것으로 발음합니다.
   참고 : BD는 특징적인 초기 혈압 피크 (쿠싱 반사), 뇌간 반사 및 자발적 호흡의 부재에 의해 확인됩니다. 쥐는 산소의 부족으로 인해 순환 불안정이 될 수 있기 때문에 정기적 인 무호흡증 테스트는 실험 중에 피해야한다.
8. 풍선 카테터의 인플레이션을 중지합니다.
9. 저체온증을 피하기 위해 마우스 위에 난방 담요를 놓습니다.

4. BD 기간 중

1. 정기적으로 혈압을 모니터링하고 문서화하십시오. 장기간 저혈압 단계(평균 동맥 압력 [MAP] & 50 mmHg >30 분)를 가진 마우스를 제외하십시오.
2. 마우스의 혈압을 안정시키기 위해 30분마다 0.1 mL의 식염수를 주입합니다.
   참고: 이 연구에서 는 총 0.8 mL의 식염수를 각 마우스에 투여하였습니다.
3. BD 지속 시간 4 시간 후, 마우스 장기 /조직을 수확. 실험이 끝날 때 마우스의 심장이 박동하지 않는 경우 실험에서 마우스를 제외합니다.

5. 샴 절차

1. 1.1-3.3 단계를 수행합니다.
   참고: 내부 컴팩트 골격을 열지 마십시오. 풍선 카테터를 삽입하거나 팽창시키지 마십시오.
2. 마우스 가까이에 머무르고 동물을 지속적으로 관찰하십시오. 반복적으로 마취의 정확한 깊이를 확인하기 위해 집게와 뒷다리를 꼬집는. 마우스가 각성의 징후를 보여주는 경우 피하 (시작 복용량의 약 1/2)를 피하 추가 마취를 적용, 이는, 우리의 경험에, 약 후 발생 2−3 마취 후 시간.
3. BD 마우스와 동일한 양의 정맥 식염수를 적용합니다.
   참고 : 샴 마우스는 환기의 중단 후 자발적인 호흡을 회복한다. BD 마우스는 그렇지 않습니다. 무호흡증 테스트는 모델을 설정하는 동안 수행해야하지만, 실험 중에 불필요한 생리 적 스트레스로 인해 피해야한다.

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결과

뮤린 BD 모델은 90% 이상의 성공률로 100회 이상 성공적으로 수행되었습니다. 추가적으로, 심장과 신장의 사후 내정간섭 기관 이식은 안전하게^7을수행되었습니다.

BD는 이 모형을 사용하여 추가조사될 수 있는 다양한 병리생리학적 변화를 유도한다. 그림 1에도시된 바와 같이, 혈압은 초기...

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토론

다기관 기증자의 동종 이식 품질에 대한 위험 인자인 BD는 생체 내 모델을 사용하여 충분히 평가할 수 있는 병리생리학적 변화의 과다를 수반합니다. 혈역학적 변화, 사이토카인 폭풍, 호르몬 변화 및 장기 이식의 질과 생존에 대한 궁극적인 영향은 시험관 내에서 분석될 수 없다^4. 면역학적 연구뿐만 아니라 기본적인 이식의 대다수는 마우스 모형에서만 널리 이용가능한 정교한 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109