면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

요약

우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.

초록

무세포 DNA(cfDNA)와 히스톤 및 호중구 엘라스타아제(NE)와 같은 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NETs)은 전신 염증이나 병원체에 반응하여 호중구에 의해 방출됩니다. NET는 이전에 인간과 개에서 혈전 형성을 증가시키고 섬유소 용해를 억제하는 것으로 나타났지만, 비대성 심근증에 이차적인 생명을 위협하는 합병증인 심인성 동맥 혈전색전증 (CATE)을 가진 고양이의 NET의 역할 을 참조하십시오. 고양이의 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하고 정량화하는 표준화된 방법은 CATE에서의 병리학적 역할에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 여기에서, 우리는 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 혈전에서 NET를 식별하는 기술을 설명합니다 대동맥 분기 내에서, 부검 중에 추출. 자일렌으로 탈파화 한 후, 대동맥 절은 간접 열 유발 항원 검색을 시행했다. 단면도는 그 때, 투과되고, ex vivo NETs는 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 무세포 DNA (cfDNA), 시트룰린화된 히스톤 H3(citH3), 및 호중구 엘라스타제(NE)의 공동 국소화에 의해 확인되었다. 혈전에서 NET의 면역 검출을 최적화하기 위해, 조직 원소의 자가형광은 현미경 검사법 전에 자가형광 담금질 과정을 사용하여 제한되었다. 이 기술은 그밖 종에 있는 NETs 그리고 혈전증을 공부하는 유용한 공구일 수 있고 이 복잡한 조건의 병리생리학에 새로운 통찰력을 제안합니다.

서문

비대성 심근병증을 가진 고양이는 생명을 위협하는 혈전색전성 합병증^1,,2의위험이 있습니다. 고양이 심인성 동맥 혈전 색전증 (CATE)과 관련된 높은 사망률및 사망률에도 불구하고 고양이의 CATE의 근본적인 병리학은 제대로 이해되지 않습니다. 이 치명적인 상태의 위험에 고양이를 치료하고 식별하는 제한된 진단 및 치료 도구도 있습니다³.

선천성 면역에 있는 그것의 역할 이외에, 호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NETs)를 풀어 놓음으로써 혈전증에 있는 역할을 하기 위하여 보였습니다, 이는 호중구 엘라스타제 (NE) 및 골수로파소와 같은 히스톤과 과립 단백질로 둘러싸인 무세포 DNA (cfDNA)의 웹 같은 네트워크인. 호중구는 전신 염증, 병원균과의 직접적인 만남 및 활성화 된 혈소판과의 상호 작용에 대한 응답으로 NETs 형성을 겪습니다^4,,5,6,,7. 개에서 호중구 유래 DNA는 응고 용해를 억제하는 것으로 나타났으며 NET 단백질은 혈전 형성을 가속화합니다. 순환 세포 및 응고 성분을 트랩하는 NET의 능력은 또한 혈전 특성^{8,,9,10,,11,,12의}핵심입니다.^,

NET는 세포외 호중구 단백질, 히스톤 및 cfDNA의 동국화에 의해 검출됩니다. 이 때문에, 탈파라핀화된 조직의 면역형광에 의한 고정된 조직에서 의한 NET의 식별 및 정량화는 밝은 필드 현미경 을 사용하여 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 얼룩보다 우수하다^4,,5. 면역형광 현미경을 이용한 여러 인간 연구는 관상동맥 혈전, 대뇌 뇌졸중 혈전, 아테로스롬보증 및 정맥^{혈전13,,14,,15,,16,,17의}구조적 성분으로 NETs를 확인하였다. 현재까지, 고양이 혈전에서 NET를 검출하고 정량화하는 표준화된 방법은 기술되지 않았다. 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하면 NET및 혈전증의 향후 번역 연구를 촉진 할 수 있기 때문에, 우리는 고양이의 파라핀 내장 동맥 혈전에서 NET 식별 및 평가의 기술을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학교 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 조직의 부검 및 생검은 소유자의 동의하에 수행되었습니다.

1. 조직 고정, 포함 및 단면화

1. 내림차순 대동맥, 대퇴 동맥 및 일반적인 선장동맥(그림1A)을포함한 대동맥 분기를 해부하고, 인도적인 안락사 또는 사망 직후에 해부한다. 무딘 근막(그림 1B)을해부하기 전에 10 % 중성 완충 포르말린에 완전히 담그기 전에 최소 24 시간 및 48 시간 이하.
2. 시료를 탈수시키기 위해, 먼저 10% 중성 완충포르민에 1시간 동안 37°C로 가열하여 침수한다. 그런 다음 37 °C (70 %, 95 %, 100 %)로 가열 된 에탄올농도가 증가하면 침수됩니다. 각각 1 시간 동안 2 x. 마지막으로, 헹구지 않고, 각각 1시간 동안 37°C로 가열된 100% 톨루엔에 2x를 담급전시.
3. 62°C로 가열된 파라핀을 넣고 파라핀이 밤새 완전히 굳어지도록 합니다.
4. 파라핀 내장 조직의 섹션 2-3 μm는 마이크로토메를 사용하여 양전하 유리 슬라이드위에 놓습니다. 추가 분석이 될 때까지 단면 조직을 -80 °C에서 저장합니다.

2. 탈파화, 재수화 및 열 유발 항원 회수

1. 유리 슬라이드에 섹션의 탈파화 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 놓고 다음 순서로 처리하십시오.
   1. 3 분 동안 100 % 자일렌에 완전히 잠기. 이 단계를 2x 반복하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.
   2. 에탄올 농도 감소 (100 %, 95 %, 70 %) 완전히 침수 실온(RT)에서 3분 동안 3회 사용하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.
   3. 탈이온수에서 2분 동안 완전히 물에 담그다.
2. 트리스 버퍼링 식염수에 0.1 % 트위넨 (TBST, pH = 7.6)을 2-3 분 동안 넣습니다.
3. 100 °C로 가열 된 탈이온수로 저수지를 채웁니다. 증기선 챔버가 20분 동안 평형화되도록 하십시오.
   참고: 열 유도 항원 회수는 식품 증기선과 같은 미리 설정된 온도 설정을 가진 증기선에 의해 생성된 간접 가열로 가장 잘 수행됩니다.
4. 트리스 및 EDTA(pH=9)를 함유하는 시판되는 항원 회수 용액을 일정한 교반과 함께 온도 제어 핫 플레이트상에서 95-97°C로 가열한다. 끓지 않는지 확인하십시오.
   참고: 솔루션이 따뜻해지면 흐려져야 합니다.
5. 가열된 항원 회수 용액을 슬라이드 용기에 붓고 용기를 증기선 의 챔버에 놓습니다. 항원 회수 용액이 증기선 의 온도에 3-4 분 동안 평형화되도록 허용하십시오.
6. 가열 된 항원 회수 용액에 슬라이드를 완전히 담그고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속하십시오.
7. 증기선에서 슬라이드 용기를 제거하고 슬라이드 및 항원 회수 용액을 RT로 냉각시키십시오. 희석된 항원 회수 용액을 4°C에 저장하고 필요한 경우 최대 2x까지 재사용하십시오.
8. 슬라이드를 TBST로 3x로 5분 동안 씻습니다.

3. 면역 표지 및 자동 형광 담금질

참고: 표 1에서는 다음 단계에서 사용되는 차단 버퍼의 구성에 대해 자세히 설명합니다.

1. 완만한 흔들림(30-50rpm)에서 RT에서 2시간 동안 블로킹 버퍼 1의 섹션을 인큐베이션합니다. 건조를 피하기 위해 파라핀 필름으로 밀봉하십시오.
2. 세척하지 않고, 희석된 토끼 폴리클로날 항인간 시트룰린화 히스톤 H3(citH3) 항체(블로킹 버퍼 1에서 희석된 0.03 mg/mL)를 슬라이드에 직접 100 μL을 직접 바릅니다.
3. 각 섹션에 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13-0.17 mm)을 배치하여 항체 혼합물을 균일하게 분배합니다.
4. 부드러운 흔들림 (30-50 rpm)으로 4 °C에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 건조를 피하기 위해 파라필름 필름으로 밀봉하십시오.
5. TBST로 3x를 5분 동안 씻으소서.
6. 3.3단계에서 설명한 바와 같이 100 μL의 염소 항토끼 항체를 알렉사 플루어 488(0.04 mg/mL 또는 차단 완충액 1에서 1:50의 최종 농도로 희석)에 공액화하. 부드러운 흔들림 (30-50 rpm)에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다.
7. TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
8. 완충완충2에서 밤새 4°C에서 부드러운 흔들림(30-50 rpm)으로 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하십시오.
9. TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
10. 완충3의 블로킹 섹션은 RT에서 2시간 동안 완만한 흔들림(30~50rpm)에 대해 3.3단계에서 설명한 대로.
11. 생체 응모형 폴리클로날 토끼 항인간 NE 항체(최종 농도 = 차단 완충액 3에서 0.2 μg/mL)를 단계 3.2-3.4에 기재된 바와 같이 12-16시간 동안 4°C에서 배양한다.
12. TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
13. RT에서 3.2-3.3 에 대해 3.2-3.3 단계에 설명된 대로 Alexa Fluor 594 스트렙타비딘 접합체(블로킹 버퍼 3에서 0.02 mg/mL로 희석)로 배양하여 건조를 방지하기 위해 파라핀으로 보호하고 밀봉합니다.
14. TBST 1x로 5분 동안 씻으소서.
15. 100 μL의 자동 형광 담금질 용액 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 1 분 동안 섹션에 직접 적용하십시오.
16. 즉시 10 분 동안 TBST 6x로 슬라이드를 씻으십시오.
17. 각 슬라이드를 300 nM DAPI의 100 μL로 어둠 속에서 5 분 동안 덮습니다.
18. TBST로 3분 동안 씻으면 총 5x동안 반복합니다.
19. 안티페이드 장착 매체의 드롭(~50 μL)을 오토플루오르전 담금질 키트의 일부를 섹션 주변의 유리 슬라이드에 직접 바하십시오. 기포를 만들지 않고 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13~0.17mm)을 부드럽게 섹션에 놓습니다.
20. 침지 렌즈로 현미경 분석을 위해 장착 매체가 경화될 때까지 시료가 4°C에서 어두운 환경에서 밤새 경화될 수 있도록 하십시오.

4. 호중구 세포 외 트랩 식별

참고: 다음 프로토콜은 1,280 x 960 디지털 CCD 카메라가 있는 반전된 epifluorescence 현미경을 사용합니다(재료 표참조).

1. 혈전을 찾으려면, 10배 의 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 대동맥, 대동맥 분기 및 각 대퇴 동맥의 길이를 따라 두개골을 스캔합니다. 혈전은 상 대비 및 밝은 필드 현미경 검사법에 내피에 인접한 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 조직의 conglomeration이다(그림 2A, 도 2B).
2. 먼저 10x 및 20x목표(그림 2C)를사용하여 DAPI 채널(여기 = 357/44nm)을 사용하는 NET 섹션을 검사합니다. cfDNA는 단계 대조 또는 밝은 필드 현미경 검사법에 볼 때 세포의 세포질의 경계 안에 있지 않은 decondensed DNA로 나타납니다.
3. 텍사스 레드 채널(여기 = 585/29 nm, 방출 = 628/32 nm)과 녹색 형광 단백질 채널(여기 = 470/22 nm, 방출 = 525/50 nm)에서 세포외 NE 및 citH3을 각각 10, 20 및 40x 목표와 식별합니다.
4. 이미지 J(NIH)와 같은 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 혈전 내의 NET를 평가하고 분석합니다. NET 형성은 앞서 설명한 바와 같이 cfDNA, 세포외 citH3 및 NE의 공동 국소화에 기초하여 확인된다^18. 픽셀 강도의 채도를 피하기 위해 이미지 수집 을 통해 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다.
5. 대역에서 가장 가까운 영역 1, 대공에서 가장 먼 영역 3, 영역 1과 3 사이의 영역 2로 나누어 내림차순 대원과의 근접성을 기반으로 각 혈전을 매핑합니다. 작업자가 각 과목의 건강 상태를 눈멀게 하면 각 구역에서 최소 10개의 무작위 필드를 가져가십시오. 각 영역에서 NET이 있는 필드의 수를 평균화하거나 영역당 평균 NET 점유 영역을 계산하여 트롬비에서 NET 분포를 특성화합니다.

결과

파라핀화, 열 유발 항원 회수 및 파라핀 내장 트롬비의 이중 면역 라벨링을 위해 이 프로토콜을 사용하여 고양이 CATE에서 처음으로 NET를 확인했습니다. 대동맥 분기 내의 Thrombi는 표준 H&E 염색 및 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 형광 현미경 검사법 및 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 위치했습니다. 밝은 필드 현미경 검사법에, 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 이루...

토론

우리는 이중 면역 표지 프로토콜 및 면역 형광 현미경 검사법을 사용하여 고정 된 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 비록 심인성 동맥 혈전만 얼룩이 있었지만, 이론적으로이 프로토콜은 다른 유형의 트롬비와 다른 수의종에 사용될 수 있습니다. 고양이 동맥 혈전 내의 NET를 식별하는 것은 NET가 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate	ThermoFisher Scientific	Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher Scientific	Catalog # A32723
Goat serum	Jackson Immuno Research Labs	Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40	Pierce	Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides	Thomas Scientific	Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum	Life Technology	Catalog # 10510
Target Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400