전체 게놈 나노기공 시퀀싱 검증, 우스투 바이러스를 예로 사용

요약

우리는 이전에 나노 기공 시퀀싱 플랫폼에서 앰플리코 기반 전체 게놈 우스투 바이러스 (USUV) 시퀀싱에 대한 프로토콜을 검증했습니다. 여기서, 보다 자세하게 사용되는 방법을 설명하고 나노기공 R10 유량 셀의 오차율을 결정한다.

초록

전체 게놈 시퀀싱은 바이러스 발병을 특성화하고 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 나노기공 계 전체 게놈 시퀀싱 프로토콜은 여러 가지 다른 바이러스에 대해 기재되었다. 이 접근은 유전으로 관련한 바이러스의 특정 바이러스 또는 단을 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있는 겹치는 amplicon 기지를 둔 접근을 이용합니다. 바이러스 존재의 확인 이외에, 시퀀싱은 바이러스를 추적하고 기원, 저수지 및 전송 의 모드를 해명하기 위하여 게놈 역학 연구 결과를 위해 이용될 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 사용되는 플랫폼과 관련된 오류율의 가능한 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 임상 및 공중 보건 설정에서 일상적인 응용 프로그램은 프로토콜의 모든 중요한 변경사항과 함께 문서화해야 합니다. 이전에는 나노기공 시퀀싱 플랫폼에서 전체 게놈 우스투 바이러스 시퀀싱에 대한 프로토콜이 일루미나 시퀀싱과 직접 비교하여 검증되었습니다(R9.4 플로셀). 여기서, 우리는 R10 유동 셀과 일루미나 시퀀싱 사이의 비교를 예로 사용하여 필요한 판독 범위를 결정하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

서문

3세대 서열 기술의 빠른 개발을 통해 바이러스 발생 시 실시간 시퀀싱에 가까운 방향으로 나아갈 수 있습니다. 유전 정보의 이 적시 가용성은 바이러스 성 병원체의 기원 그리고 진화를 결정하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 차세대 염기서열 분석 분야의 금 표준은 여전히 2세대 시퀀서입니다. 이러한 기술은 에멀젼 PCR 또는 클론 브리지 증폭 중에 클론 증폭과 같은 특정하고 시간이 많이 소요되는 기술에 의존합니다. 3 세대 시퀀서는 저렴, 휴대용 및 단순화 된 라이브러리 준비 방법론과 함께 제공됩니다. 특히 시퀀스 장치의 작은 크기와 낮은 구매 가격으로 배포 할 수있는 필드 시퀀싱을위한 흥미로운 후보가됩니다. 이것은 예를 들면 시에라리온에 있는 에볼라 바이러스 발발 도중 및^브라질에있는 진행중인 arbovirus 발발 조사 도중 볼 수 있었습니다^1,22,3. 그러나 보고된 높은 오류율^4는 나노기공 시퀀싱을 사용할 수 있는 응용을 제한할 수 있습니다.

나노기공 시퀀싱은 빠르게 진화하고 있습니다. 신제품은 정기적으로 시장에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어 DNA 분자의 두 가닥의 시퀀싱을 가능하게 하는 1D 제곱 키트가 예를 들어, 기체^5라고 불리는 정확도를 높이고, 기공^6의2개의 상이한 인스턴스에서 전류의 변화를 측정하는 R10 유량 세포의 개발이 가능하다. 또한 베이스콜 개선과 같은 향상된 생체 정보 도구는^베이스콜7의 정확도를 향상시킵니다. 가장 자주 사용되는 베이스콜러 중 하나(예: 알바코어)는 9개월 기간^5에서최소 12회 업데이트되었습니다. 최근, 제조 업체는 또한 기본 나노 기공 소프트웨어^8에서구현되는 플립 플롭이라는 새로운 basecaller를 발표했다. 함께, 이러한 개선의 모든 보다 정확한 시퀀스로 이어질 것입니다 및 나노 기공 시퀀서의 오류 율을 감소시킬 것이다.

우스투 바이러스(USUV)는 플라비리대 가족의 모기 매개 아르보바이러스이며 약 11,000개의 뉴클레오티드의 양성 가닥 RNA 게놈을 가지고 있다. USUV는 주로 큰 회색 올빼미와 블랙 버드 에 영향을^{미치는 9,,10,}다른 조류 종은 USUV 감염에 취약하지만^11. 최근, USUV는 또한 설치류와 슈루에서 확인되었지만 바이러스의 전염에 있는 그들의 잠재적인 역할은 알려지지 않은^12남아있다. 인간에서 무증상 감염은 혈액 기증자^{13,,14,,15,,16에서} 기재되었으며 USUV 감염은 뇌염 또는 수막뇌염^17,,18과관련이 있는 것으로 보고되었다. 네덜란드에서 USUV는 2016년^10마리의 야생 조류에서 처음 발견되었으며, 2018년^14년에는무증상 혈액 기증자에서 처음 발견되었습니다. USUV의 초기 검출 이후, 발발은 전체 게놈 순서를 포함하여 후속 년 및 감시 도중 보고되었습니다, 이전에 순진한 인구에 있는 arbovirus의 출현 그리고 퍼짐을 감시하기 위하여 현재 진행되고 있습니다.

에볼라 바이러스, 지카 바이러스 및 황열병 바이러스^3,,19,,20과 같은 다른 바이러스에 대해 설명된 것과 유사하게, 우리는 전체 길이 USUV^21을서열로 설정하는 프라이머 세트를 개발했다. 이 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기지를 둔 접근은 약 32의 Ct 값까지 견본에 있는 두뇌 견본 같이 높게 호스트 오염한 견본 모형에서 전체 길이 USUV 게놈의 복구를 허용합니다. 앰플리코 기반 시퀀싱 접근법의 장점은 메타게노믹 시퀀싱및 더 높은 특이성에 비해 더 높은 민감도입니다. amplicon 기반 접근법을 사용하는 제한사항은 모든 균주에 맞는 프라이머를 설계하기 위해 서열이 유사해야 하며 프라이머는 바이러스 다양성에 대한 현재 의 지식에 따라 설계된다는 것입니다.

3세대 염기서열 분석의 지속적인 발전 과 개선을 감안할 때, 시퀀서의 오차율을 정기적으로 평가할 필요가 있다. 여기서, USUV를 이용한 일루미나 시퀀싱에 대해 나노기공의 성능을 직접 평가하는 방법을 일례로 설명한다. 이 방법은 최신 R10 플로우 셀로 생성된 시퀀스에 적용되며 베이스콜링은 최신 버전의 플립플롭 베이스콜러로 수행됩니다.

프로토콜

참고: 사용할 소프트웨어 도구 목록: usearch v11.0.667; 근육 v3.8.1551; 포어찹 0.2.4; 컷적응 2.5; 미니맵2 2.16-r922; 삼도구 1.9; 트리모매틱 0.39; bbmap 38.33; 스페이드 v3.13.1; kma-1.2.8

1. 프라이머 디자인

1. 공개 또는 개인 데이터 컬렉션에서 관련 참조 전체 게놈 서열 집합을 다운로드하거나 검색하는 것으로 시작합니다. 예를 들어 NCBI 데이터베이스^22에서전체 길이 USUV 게놈(taxid64286)을 검색합니다. USUV는 약 11,000개의 뉴클레오티드의 게놈을 인코딩하므로 8,000-12,000개의 뉴클레오티드의 서열 길이만 서열을 검색합니다. 다음 검색 항목을 사용하여 이 작업을 수행합니다.
   - taxid64286 [유기체 : noexp] 및 8000 [SLEN]:12000 [SLEN].
   1. 보내기를 클릭합니다. 전체 기록 | 파일; 형식 = FASTA를 사용하고 파일을 만듭니다.
2. 참조 서열 집합을 축소하려면 데이터 집합에서 99% 이상의 뉴클레오티드 ID를 사용하여 중복 서열 또는 서열을 제거합니다. usearch^23에서클러스터 빠른 옵션을 사용하여이 작업을 수행합니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0.99 -centroids All_USUV_dedup.fasta
3. 프라이머를 생성하려면 시퀀스를 정렬해야 합니다. 이것은 근육^24를사용하여 수행됩니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 근육 -in All_USUV_dedup.fasta -out All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txt
   참고: 정렬을 수동으로 검사하여 불일치를 검사하는 것이 중요합니다. 이들은 필요한 경우에 수동으로 고칠 수 있고 끝은 대부분의 전체 게놈 서열의 길이에 따라 손질될 수 있습니다.
4. 원시는 전체 길이 앰플리톤 시퀀싱^(19)에사용할 수있는 프라이머의 초안 선택을하는 데 사용됩니다. 원초 웹 사이트(http://primal.zibraproject.org/)에정렬을 업로드하고 다른 앰플리온 사이의 기본 앰플리온 길이와 겹치는 길이를 선택합니다. primal.zibraproject.org 이동하고 구성표 이름을입력하고 정렬된 fasta 파일을 업로드하고 앰플리톤 길이, 겹침 크기를 선택하고 구성표를 생성합니다.
5. 사용 가능한 전체 USUV 시퀀스 의 전체 집합을 정렬합니다(축소또는 중복 제거되지 않은 집합). 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 근육 -in All_USUV.fasta -out All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt
   참고: 생성된 프라이머를 전체 선형(중복 제거 된 선형 을 사용하지 않음)에 매핑하고 수동으로 오류를 수정하고 최대 5 개의 퇴행성 프라이머 위치를 포함합니다.

2. 멀티플렉스 PCR

1. 설계된 프라이머및 나노기공 및 일루미나 시퀀싱을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행한다. USUV에 대한 멀티플렉스 PCR은 앞서 설명한^19,,21과같이 수행되었다.
2. 플립 플롭 버전 3.0.6.6+9999d81로 베이스콜을 수행합니다.

3. 나노 기공 데이터에서 합의 시퀀스를 생성하는 데이터 분석

1. 여러 샘플을 단일 나노기공 시퀀싱 실행에서 다중화할 수 있습니다. 서열 실행을 수행한 후, 나노기공 데이터를 디멀티플렉스한다. 이를 위해 포레찹^25를 사용하십시오. 오염을 방지하고 정확도를 높이려면 require_two_barcodes 플래그를 사용하십시오. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 포레찹 -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex -require_two_barcodes
2. 다중화 후 cutadapt^26을사용하여 프라이머 시퀀스(파일 Primers_Usutu.fasta 에 두 방향모두에 표시됨)를 제거합니다. 또한, 75개 뉴클레오티드보다 짧은 길이의 서열을 제거한다. 프라이머는 합의 순서에 인공 편향을 도입 할 수 있기 때문에 제거해야합니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - cutadapt -b 파일 : Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75
3. 탈중시퀀스 판독은 minimap2^27을 사용하여 별개의 기준 균주의 패널에 대해 매핑될 수 있으며, 합의 시퀀스는 samtools^28을사용하여 생성될 수 있다. 참조 기반 정렬의 절차와 한 샘플의 합의 시퀀스 생성을 보여 주면 BC01이라는 예제를 따릅니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - minimap2 -ax지도 -ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
   - 삼도구 정렬 BC01.bam > BC01_sorted.bam
   - bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools 전화 -mv -Oz -o BC01.vcf.gz
   - bcftools 지수 BC01.vcf.gz
   - 고양이 Random_Refs_USUV.fasta | bcftools 컨센서스 BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta
4. 참조 기반 정렬의 경우 밀접하게 관련된 참조 시퀀스를 사용해야 합니다. 따라서 생성된 합의 시퀀스를 사용하여 BlastN 검색을 수행하여 가장 가까운 참조 변형률을 식별합니다. 그런 다음 가장 가까운 참조 변형률로 참조 기반 선형을 반복합니다(단계 3.3 및 3.4). 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - minimap2 -ax지도 -ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam
   - samtools 정렬 BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam
   - bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools 전화 -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz
   - bcftools 지수 BC01_ref.vcf.gz
   - 고양이 Ref_USUV_BC01.fasta | bcftools 컨센서스 BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta

4. 일루미나 데이터 분석

1. 이러한 시퀀스는 시퀀싱 후 자동으로 다중화됩니다. 읽기는 트리모매틱^29를사용하여 품질을 제어할 수 있습니다. 페어링된 엔드 Illumina 시퀀스의 경우 일반적으로 사용되는 컷오프 중앙값 PHRED 점수 33과 최소 읽기 길이 75를 사용하여 정확하고 고품질의 읽기를 얻을 수 있습니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 트리밍 PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 후행:3 슬라이딩 윈도우:3:15 MINLEN:75
2. 제거 프라이머 (파일 Primers_Usutu.fasta 양쪽 방향으로 표시), 그들은 인공 바이어스를 도입 할 수 있기 때문에, 사용하여 cutadapt^26. 또한, 아래 명령을 사용하여 75개 뉴클레오티드보다 짧은 길이의 서열을 제거한다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75
3. de novo 조립전에, 서열 판독은 게놈 전반에 걸쳐 균일한 커버리지를 위해 정규화될 수 있다. SPAdes와 같은 de novo 어셈블러는 시퀀스 읽기를 어셈블할 때 읽기 범위를 고려하기 때문에 이는 필수적입니다. 정규화 는 BBMap 패키지 (30)에서 BBNorm을 사용하여^50의읽기 범위에 읽기를 . 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - bbmap/bbnorm.sh 대상=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq
4. 정규화된 읽기는 SPAdes^31을사용하여 조립된 de novo입니다. 기본 설정은 모든 다른 kmers(21, 33, 55, 77, 99 및 127)를 사용하여 어셈블리에 사용됩니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o 샘플9 -1 Sample9.qc.fq -2 Sample9.qc.r.fq
5. QC는 minimap2및 정렬을 큐레이트하기 위해 Geneious, Bioedit 또는 Ugene과 같은 프로그램을 사용하여 얻은 합의 서열에 대해 읽는 매핑합니다. 콘티그의 시작과 끝을 확인하는 것이 중요합니다.
   1. 미니맵2를 사용하여 얻은 합의 시퀀싱에 대해 QC 읽기를 정렬합니다.
   2. 유전자/바이오편집/UGene에서 정렬을 가져옵니다.
   3. 게놈의 시작과 끝을 수동으로 검사, 수정 및 큐레이터하십시오.

5. 일루미나 데이터를 골드 표준으로 사용하여 나노 기공 시퀀싱에서 오류 프로파일을 보정하기 위해 필요한 판독 범위를 결정

1. 선택 시퀀스는 하나의 앰플리콘에 매핑을 읽고,이 경우 앰플리콘 (26). 그 후, 미니맵2를 사용하여 이 앰플리톤에 대해 나노기공 판독을 매핑합니다. Samtools를 사용하여 앰플리온 26에 대한 읽기 매핑만 선택하고 bam 파일을 fastq로 변환합니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 미니맵2 -도끼 지도 -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
   - 샘 툴보기 -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam
   - samtools bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq - -> BC01_mapped.fastq
2. 임의로 선택 하위 집합 예를 들어 200 시퀀스는 천 번 읽습니다. 예를 들어 10으로 변경하면 10개의 시퀀스 읽기의 하위 집합이 1,000번 임의로 선택됩니다. 스크립트는 보충 파일 1로제공됩니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - 파이썬 Random_selection.py
3. 임의로 선택된 모든 시퀀스 판독은 앰플리온(26)에 정렬된다. KMA^32를 사용하여 시퀀스 읽기를 매핑하고 즉시 합의 시퀀스를 생성합니다. -bcNano 플래그로 표시된 나노 기공 시퀀싱에 최적화된 설정을 사용합니다. 명령줄에서 다음을 입력합니다.
   - kma 지수 -i Amplicon26.fasta
   - random_sample *에 있는 파일;
   - 샘플ID=${파일%.fastq}
   - kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano
   - 완료
4. 다음을 사용하여 명령줄에서 생성된 합의 시퀀스를 검사합니다.
   - 고양이 *.fsa > All_genomes.fsa
   - minimap2 -ax지도 - 온트 Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam
   - samtools 정렬 All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam
   - samtools 통계 All_genomes_sorted.bam > 통계.txt
   1. 오차율은 제목 오류율 #mismatches /염기 매핑아래 stats.txt에 표시됩니다. 다음 명령으로 화면에 표시합니다.
      - grep ^SN 통계.txt | 컷 -f 2-
   2. 인델의 양은 주기당 #Indels제목 아래에 표시됩니다. 다음 명령으로 화면에 표시합니다.
      - grep ^IC 통계.txt | 컷 -f 2-

결과

최근에는 새로운 버전의 유동 셀 버전(R10)이 출시되어 전자 전류 신호를 DNA 서열(소위 플립 플롭 베이스콜러)으로 변환하는 데 사용되는 베이스콜러에 대한 개선이 제공되었습니다. 따라서, 우리는 이전에 R9.4 유동 세포 및 일루미나 Miseq 기기^21상에서시퀀싱된 USUV 양성 올빼미의 뇌 조직으로부터 USUV를 재시퀀싱했습니다. 여기서, 우리는 일루미나 시퀀싱에 직접 비교하여 신뢰할 수 있는 합의 호출에 필요한 판독 범위를 결정하는 데 사용되는 방법을 설명했다.

베이스콜러 플립플롭과 함께 최신 유동 셀을 사용하여 40x의 판독 범위가 일루미나 시퀀싱과 비교하여 동일한 결과를 초래한다는 것을 보여줍니다. 30x의 판독 범위는 시퀀스된 585,000개의 뉴클레오티드마다 하나의 오차에 해당하는 0.0002%의 오차율을 초래하며, 20x의 판독 범위는 시퀀스된 모든 63,529개의 뉴클레오티드에서 하나의 오차를 초래합니다. 10x의 읽기 범위는 전체 USUV 게놈 당 3개 이상의 뉴클레오티드가 잘못 호출되고 있다는 것을 의미하는 매 3,312개의 뉴클레오티드에서 1개의 오차귀착됩니다. 30배 이상의 읽기 커버리지로 인델은 관찰되지 않았습니다. 20배의 판독 범위는 한 개의 인델 위치를 감지하는 결과를 낳았고, 10배의 판독 범위는 29개 위치에서 인델을 생성했습니다. 다른 읽기 커버리지 컷오프를 사용하는 오류율에 대한 개요는 표 1에나와 있습니다.

범위	오류 반복 1	오류율 반복 1	인델스:	오류 반복 2	오류율 반복 2	인델스:	오류 반복 3	오류율 반복 3	인델스:
10×	100	0.0274%	4	116	0.0297%	18	110	0.0282%	7
20×	4	0.0010%	0	6	0.0015%	1	7	0.0018%	0
30배	2	0.0005%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
40x	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
50×	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0

표 1: 나노기공 시퀀싱의 오차율에 대한 개요. 각 반복은 1,000개의 무작위 샘플을 나타냅니다.

보충 파일 1: 임의의 선택. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

토론

나노기공 시퀀싱은 지속적으로 진화하고 있으므로 오류율을 모니터링하는 방법에 대한 필요성이 있습니다. 여기서, 나노기공 시퀀서의 오차율을 모니터링하는 워크플로우에 대해 설명한다. 이 기능은 새 흐름 셀을 릴리스한 후 또는 basecalling의 새 릴리스가 릴리스된 경우에 유용할 수 있습니다. 그러나 이 기능은 자체 시퀀싱 프로토콜을 설정하고 유효성을 검사하려는 사용자에게도 유용할 수 있습니다.

다른 소프트웨어 및 정렬 도구는 다른 결과를 얻을 수 있습니다³³. 이 원고에서는 일반적으로 사용되고 명확한 설명서가 있는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지를 사용하는 것을 목표로 했습니다. 경우에 따라 일반적으로 사용자 친화적인 인터페이스를 가지고 있지만 비용을 지불해야 하는 상용 도구에 기본 설정이 제공될 수 있습니다. 미래에, 이 방법은 시퀀스 기술 또는 베이스 콜링 소프트웨어의 큰 수정이 도입되는 경우 동일한 샘플에 적용될 수 있으며, 기본 호출기 또는 플로셀의 각 업데이트 후에 이 작업을 수행해야 하지만 현재 개발 속도를 감안할 때 주요 업데이트 후에만 수행될 수 있습니다.

시퀀싱에서 오류율이 감소하면 더 많은 수의 샘플이 다중화될 수 있습니다. 이에 따라 나노기공 시퀀싱은 진단 분석용 종래의 실시간 PCR을 대체하는 것에 가까워지고 있으며, 이는 이미 인플루엔자 바이러스 진단의 경우이다. 또한 오류율이 감소하면 사소한 변이체의 결정 및 고처리량의 편향되지 않은 메타게놈 시퀀싱과 같은 이 기법의 시퀀싱의 유용성이 증가합니다.

프로토콜의 중요한 단계는 신뢰할 수 있는 신뢰할 수 있는 참조 시퀀스를 사용할 수 있어야 한다는 것입니다. 프라이머는 바이러스 다양성에 대한 현재의 지식을 기반으로하며 가끔씩 업데이트해야 할 수도 있습니다. 앰플리코 기반 시퀀싱 방식을 설정할 때 또 다른 중요한 점은 앰플리톤 깊이에서 균일한 균형을 얻기 위해 프라이머 농도의 균형입니다. 이를 통해 시퀀스 실행에 더 많은 샘플을 다중화할 수 있으며 상당한 비용 절감을 달성합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
dNTPs	Qiagen	201900
FLO-MIN106 R10 flowcell	Nanopore	R10 flowcell
KAPA Hyperplus libarary preparation kit	Roche	7962436001
Library Loading Bead Kit	Nanopore	EXP-LLB001
Ligation Sequencing Kit 1D	Nanopore	SQK-LSK109
Native Barcoding Kit 1D 1-12	Nanopore	EXP-NBD103
Native Barcoding Kit 1D 13-24	Nanopore	EXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367S
NEB Next Quick Ligation Module	NEB	E6056
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module	NEB	E7546S
Protoscript II Reverse Transcriptase	NEB	M0368X
Q5 High-Fidelity polymerase	NEB	M0491
Qubit dsDNA HS Assay kit	Thermo Fisher	Q32851
Random Primers	Promega	C1181
RNAsin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111