정맥 이식편을 사용하여 동맥 혈압하에서 인티맥 증식을 평가하는 재혈관 외과를 모방한 토끼 정맥 중개 모델

요약

본 프로토콜은 정맥 이식편을 사용하여 정맥 혈관 화 수술 후 정맥 심상 증식을 감쇠하는 전략을 개발하기 위한 동맥 혈압에 정맥을 복종시킴으로써 정맥 친혈증을 실험적으로 만드는 것을 목표로 합니다.

초록

정맥 이식편은 허혈성 질환에 대한 재혈관 화 수술에서 자가 이식편으로 일반적으로 사용되었지만 동맥 혈압에 노출되기 때문에 친밀한 증식의 가속화로 인해 장기적인 길직성은 여전히 좋지 않습니다. 본 프로토콜은 토끼 경정맥을 원소 경동맥에 끼워 실험적인 정맥 내 심상 증식의 확립을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 신체 트렁크 깊숙이 외과 적 수술을 필요로하지 않으며 절개 범위가 제한되어 있어 동물에 대한 침습력이 적어 이식 후 장기 관찰이 허용됩니다. 이 간단한 절차는 연구원이 이식된 정맥 이식의 친밀한 증식의 진행을 감쇠하는 전략을 조사하는 것을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 수베정맥 이식편으로 증식상태에서 수축상태에 이르는 혈관 평활근 세포(VSMC)의 표현형을 제어하는 것으로 알려진 microRNA-145(miR-145)의 전달 효과를 보고했습니다. 우리는 VSMC의 표현형 변경을 통해 이식 수술 전에 miR-145를 변환하여 정맥 이식의 친시 증식의 감쇠를 확인했습니다. 여기에서 우리는 revascularization 수술에 있는 정맥 이식의 친근한 증식을 감쇠하기 위하여 이용될 수 있는 전략을 조사하기 위하여 보다 적게 침략적인 실험 적인 플래트홈을 보고합니다.

서문

동맥경화증으로 인한 허혈성 질환을 경험하는 환자의 수는 전 세계적으로^1으로증가하고 있다. 심혈관 질환에 대한 의료 및 외과 적 치료의 현재 발전에도 불구하고, 허혈성 심장 질환, 이러한 심근 경색 등, 사망률과 사망률의 주요 원인 남아^2. 더욱이, 사지로의 혈류감소가 특징인 말초 동맥질환은 치명적인 사지 허혈을 유발하며, 여기서 환자의 약 40%가 진단 후 6개월³이내에 다리를 잃고 사망률은 최대 20%3이다.

관상 동맥 우회 이식 (CABG) 및 말초 동맥에 대한 우회 수술과 같은 혈관 혈관 화 수술은 허혈성 질환에 대한 주요 치료 옵션입니다. 이 수술의 목적은 죽상 경화성 동맥의 협착 또는 폐색 병변의 말단 부위를 향한 충분한 혈류를 제공하기 위해 새로운 혈액 경로를 제공하는 것입니다. CABG를 위한 내부 흉부 동맥과 같은 실동맥 이식편에서는, 예상되는 더 긴 개통때문에 우회 접목으로서 선호되지만, 자가 사페누스 정맥과 같은 정맥 이식편은 접근성 및 가용성이 높기 때문에 일반적으로 사용된다^4. 정맥 이식편의 약점은 동맥 이식편 질환으로 이어지는 동맥 압박을 받을 때 가속한 친위증으로 인해 동맥 이식편^5에 비해 개통율이 좋지 못하다는 것이다.⁶

정맥 이식 질환은 다음과 같은 세 단계를 통해 발생합니다 : 1) 혈전증; 2) 친밀한 증식; 및 3) 죽상 동맥 경화증⁷. 정맥 이식질환을 해결하기 위해, 많은 기초연구가^8건의실시되고 있다. 지금까지, 항혈소판 및 지질 하강 요법 이외의 약리학적 전략은 최근 가이드라인^{9,,10,,11,,12에서}관상 동맥 또는 말초 혈관분석 수술 후 이차 예방을 위해 권장된다. 따라서, 정맥 이식 질환, 특히 친밀한 증식을 극복하기 위해서는 추가 연구를위한 관련 실험 플랫폼의 설립이 필요합니다.

친시 증식은 혈관 평활근 세포 (VSMC)가 증식, 축적 및 친밀감에서 세포 외 매트릭스를 생성하는 주변의 변화에 반응하여 발생하는 적응 현상입니다. 따라서, 그것은 접목 아테로 마^7에대한 기초를 제공합니다. 과형성 인티마에서 VSMC는 수축보다는 증식 및 생산을 부담하며,"현상기^{변화"라고 8}. 정맥 이식병을 예방하기 위해 정맥 이식편의 VSMC의 표현형을 조절하는 주요 연구 대상이며, 이 주제에 대한 수많은 기초 연구가^8. 그러나, VSMC 표현형의 약리학적 제어를 달성하기 위한 무작위 대조 임상 연구는 제한된 결과를 보였다^13. 추가, 친밀한 증식을 방지하기 위하여 아무 표준화한 치료도 없습니다. 동물 모델 연구를 포함한 더 기본적인 연구가 필요합니다.

이 분야에서 연구를 촉진하기 위해, 동맥 혈압하에서 정맥 이식을 재현하는 동물 모델을 확립하는 것이 중요합니다, 장기 허용, 수술 후 관찰. Carrel 외. 경동맥에 외부 경정맥의 이식의 개 모델을 설립^14. 테르후, 다양한 정맥 이식편은 흉부 또는 복부 대동맥으로 이식된 열등한 정맥카바를 포함하여 동맥 혈압의 변화의 생리적 및 병리학적 효과를 조사하기 위해 사용되어 왔으며, 또는 대퇴^동맥내로이식된 사혈구 정맥^15,16,,17. 이 모형은 임상 케이스에 있는 정맥 이식 질병을 모방하기 위하여 적당한 돼지 또는 개와 같은 더 큰 동물에서 건축되었습니다. 그러나, 특별한 외과 기술 없이 그리고 더 낮은 비용으로 준비될 수 있는 동물 모형의 설치는 생체내 VSMC 표현형 통제를 통해 암시 증을 감쇠하기 위한 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 시도하는 연구원을 위해 이상적일 것입니다. 처음에는 토끼의 경동맥 내경 정맥의 중간체가 신경외과^18,,19의분야에서 도입되었다. 그 후,^20,,21에 대한 연구에 적용되었다. 초기 모델은 정맥 중간 배치만으로 구성되므로 시간을 절약할 수 있습니다. 더욱이, 후속 연구는 정맥 이식의 준비는 또한 친밀한 증식에 영향을 미쳤다는 것을 보여주었습니다^22. Davies 외. 토끼 정맥 중간 모델^23,,24에서자궁 위증에 대한 풍선 카테터 손상의 효과를 평가하였다. 풍선 카테터 손상 이외에 정맥 삽입이 임상 설정과 더 관련이 있었지만, 보다 재현 가능한 모델도 요구되었다. 따라서, Jiang 등은 친혈증에 대한 차동 흐름 환경의 영향을 조사하고 재현 가능한 모델^25로서원위 분기 결찰 절차를 수립했다. 그러나, 그(것)들은 임상 조정에 있는 손 바느질 한 해부학과 다른 보이는 정맥 이식 의 시간에 커프 기술을 채택했습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 동맥 혈압하에서 친밀한 증식을 평가하기 위해 토끼 정맥 중간 모델의 준비를 위해 재현 가능하고 임상적으로 관련성이 있고 광범위하게 이용 가능한 절차를 보고합니다.

프로토콜

참고: 동물에 대해 수행되는 모든 외과 적 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드 (www.nap.edu/catalog/5140.html) 또는 기타 적절한 윤리 지침에 따라 수행되어야합니다. 의정서는 진행하기 전에 해당 기관의 동물 복지 위원회의 승인을 받아야 합니다.

1. 동물의 준비

1. 2.7~3.0kg의 수컷 흰 토끼(또는 몸크기에 해당하는 토끼)를 구입하십시오.
2. 토끼를 12시간 동안 밝은 -어두운 주기로 1주일 동안 적응시키고 시술 전에 일반 토끼 차우 다이어트를 먹입니다.

2. 마취 및 동물 설정

참고 : 모든 후속 절차는 무균 조건하에서 수행해야합니다. 수술 분야 및 장치는 사용하기 전에 10 % 포비돈 - 요오드 용액, 70 % 알코올 또는 사분면 암모늄 화합물로 소독해야합니다.

1. 양구리 정맥을 통해 펜토바르비탈 나트륨 (25 mg/kg)의 정맥 투여로 토끼를 마취시.
2. 토끼가 강도를 잃어 버렸는 것을 확인 한 후 수술대에 옮기고 척추 위치에 놓습니다. 마취 마스크로 코와 입을 덮습니다. 0.7-1.0 % 이소플루란 산소 혼합물을 흡입하여 전신 마취의 투여를 시작합니다.
   참고: 토끼가 움직이기 시작하면, 이소플루란의 일시적인 서지가 최대 2%까지 유효합니다.
3. 전동 헤어 클리퍼를 사용하여 목과 어깨에 털을 다듬습니다. 70 % 에탄올 또는 다른 살균 제를 분사하여 표면을 소독 한 후 면도기로 자궁 경부 부위의 나머지 모발을 면도하십시오. 10 % 포비도 요오드로 수술 분야를 소독하고 국소 마취로 피하 적으로 리도카인 염산염 (3 mg / kg)을 투여하십시오.
   참고: 기관의 반복적인 움직임을 검사합니다. 경정맥과 경동맥의 맥동을 관찰하십시오. 호흡기 와 맥동 속도가 감소하면 마취 투여의 일시적인 감소를 고려하십시오. 경피적 산소 포화도 및 맥박수 모니터링도 도움이 됩니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

3. 경정맥의 수확

참고 : 국소 마취제 (예 : 리도카인)는 피부 절개를하기 전에 사용해야합니다.

1. 피부 절개 전에 예방 적 enrofloxacin (5 mg / kg)을 피하적으로 투여하십시오. 진통의 경우, 3 일 동안 하루에 두 번 피하 로 부프레 노르핀0.05 mg/kg을 투여하십시오.
   참고: 체온의 하락을 피하기 위해, 절개 부위의 외과 용 스크럽은 동물의 신체에 70 % 에탄올을 뿌리는 대신 사용할 수 있습니다.
2. 자궁 경부 부위의 50-60mm를 세로로 수술메스로 절개하십시오. 경정맥의 20-30 mm 세그먼트를 노출시키기 위하여 피하 조직 및 근막을 무딘 해부합니다. 4-0 실크 봉합사로 노출 된 정맥의 모든 가지를 리게이트하십시오.
3. 내부 및 외부 경정맥 주위에 2-0 실크 봉합사를 놓고 다음 단계에서 경정맥을 절개 한 직후결찰을 수행합니다.
4. 정맥의 말단 측의 정맥 벽 (약 1mm)을 절개합니다. 절단에서 정맥의 근측쪽으로 2-French 풍선 카테터를 삽입합니다. 경정맥의 말단 부위에 2-0 실크 봉합사를 리게이트하십시오.
5. 0.2 mL의 공기로 풍선을 팽창시. 내피 각질 제거를위한 카테터의 세 구절을 사용하여 정맥의 intima를 제거하십시오.
   참고 : 이 절차는 내피 각질 제거를 일으키는 인간의 재혈관 수술에서 사혈 정맥 이식의 팽창과 동등한 것으로 간주됩니다.
6. 정맥의 근위 쪽 끝을 리게이트합니다. 수확 정맥을 잘라.
   참고 : 동맥에 대한 해부학은 거꾸로 수행되어야하기 때문에 수확 된 정맥의 말단과 근위 말단을 조심스럽게 구별하십시오 (즉, 정맥의 말단은 동맥의 근위 말단에 해부학되어야합니다). 예를 들어, 특정 측에서 정맥 카테터를 삽입하는 것은 마커로 작동합니다.
7. 수확된 경정맥에 대한 치료 조작의 경우, 수확된 정맥을 각 연구 질문(예: 전기천공²⁶ 또는 정맥내로 마이크로RNA를 트랜스듀싱하기 위한 용액^27과 직접 침지)으로 치료한다.
   참고: 이 프로토콜의 경우, 정맥 이식편을 인산염 완충식염수, 대조군 마이크로RNA 및 마이크로RNA-145에 담가 두었습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 수확된 경정맥에 의한 경동맥 개입

1. 원소 측경동맥의 20-30 mm 세그먼트를 노출시. 동맥을 근처의 정맥과 신경에서 조심스럽게 분리하십시오. 4-0 실크 봉합사로 노출 된 정맥의 모든 가지를 리게이트하십시오.
2. 헤파린 나트륨을 정맥 내 투여 (200 IU / kg). 3-4분 동안 기다립니다.
3. 수술 용 클램프로 동맥의 근위 및 말단을 고정하십시오. 클램프 사이의 중간에 동맥을 잘라. 절개 된 경동맥에 정상적인 식염수를 근위축하여 동맥을 제거하십시오.
   참고: 토끼 경동맥은 수축하는 경향이 있습니다. 잘 부풀어 있는 사이트를 해부학 사이트로 선택하십시오.
4. 뒤집힌 종단 간 방식으로 수확된 정맥을 동맥에 아나스토모스합니다.
   1. 20 G 정맥 카테터를 말단에서 근위 방향으로 수확한 정맥에 삽입하여 말단 기압 계수 기재 동안 정맥 내강을 열어 두십시오.
   2. 8-0을 사용하여 동맥의 말단끝까지 정맥의 근위 말단을 모시다 폴리 프로필렌은 봉합사를 중단. 사이트와 반대 쪽 사이트에 두 개의 앵커 stiches를 배치합니다. 앵커 stiches 사이의 해부학 선의 위쪽을 stiches 추가합니다.
   3. 동맥과 정맥 이식편을 거꾸로 뒤집습니다. 해부학 선의 나머지 부분에 stiches를 추가합니다.
   4. 정맥에서 정맥 카테터를 제거하십시오. 정맥 이식편을 조점으로 고정하고 경동맥을 분리하여 분리합니다. 정맥 이식편이 점차 확대되고 있는지 확인하십시오.
   5. 8-0을 사용하여 동맥의 근위 끝에 정맥의 말단을 anastomose 폴리 프로필렌은 봉합사를 중단. 해부학 사이트에서 출혈을 확인하기 위해 동맥을 분리합니다. 필요한 경우 지혈에 대한 봉합사를 추가하십시오.
      참고 : 거즈와 대기와 출혈 부위의 부드러운 압축은 지혈에 충분 할 수있다. 근위 식 탈파 후 정맥 이식의 즉각적인 팽창과 강한 맥동을 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 4.4.2-4.4.3 단계를 반복하는 것이 좋습니다.
5. 가난한 유출 상태를 시뮬레이션하고 친밀한 증식을 촉진하기 위해 4-0 실크 봉합사로 내부 경동맥을 리게이트.
6. 식염수로 상처를 닦습니다. 3-0 폴리글락틴(910)을 사용하여 상처를 닫고, 층별로 층을 감는다.

5. 수술 후 절차

1. 마취를 종료하고 동물의 자발적호흡을 확인한 후 마취 마스크를 제거하십시오. 마취에서 회복 될 때까지 동물의 상태를 자주 확인하십시오.
2. 호흡 기능이 완전히 회복될 때까지 동물을 다른 동물과 분리하십시오. 필요한 경우 수동으로 호흡을 지원합니다. 완전한 회복이 될 때까지 동물을 더 큰 그룹으로 되돌리지 마십시오.
3. 마취에서 회복 한 후 음식과 물 섭취량을 확인하고 적절한 영양 지원을 제공합니다. 진통제를 투여 (예를 들어, buprenorphine 0.05-0.2 mg / kg 피하 3 일 동안 하루 2 배) 불편 이나 통증의 흔적을 확인.

결과

도 1A는 정맥 중보 수술 후 2주 후에 성공적인 종양 성 증식의 대표적인 이미지를 나타낸다(상부 패널). 하부 패널은 친위 증식(lower panel)을 감쇠시킨 마이크로RNA-145-로드 폴리(젖산-코글리콜산) 나노입자의 치료 효과를 나타낸다. 도 1B는 인산완충식염수 대조군(PBS), 대조군 마이크로RNA(Cont-miR), 및 마이크로RNA-145(miR-145) 군을 이용한 대조군 간의 친혈 증식...

토론

본 프로토콜은 VSMC가 증식상태에서 수축 상태로 의 한 표현형을 제어하고 이어서 생체 내에서 정맥 친위증의 진행을 감쇠시키기 위한 다양한 분자 또는 유전적 개입을 테스트하기 위한 실험 플랫폼을 제공하도록 설계된다. 이 모델을 사용하여, 우리는 성공적으로 수술 후 2 주에 친시 증식을 준비(그림 1A)VSMC 표현형을 제어하는 microRNA-145의 치료 잠재력을 표시^26...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia