엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

요약

유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.

초록

맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.

여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.

서문

생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다^{1,,2,,3,,4,,5}. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조^6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자^구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.

다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에 민감한 엘라스틴과 같은 단백질 (ELP)과 같은 양과 성 단백질을 포함^5,8,9, 재조합 올레오신¹⁰및 인공 단백질 양서류¹¹. 온도 트리거 방법은 미셀의 조립을 주도하고있다^4,10,12섬유¹³시트¹⁴및 소포^9,15,16. 유기 용매와 관련된 방법은 동적 단백질 기반 소포의 형성을 위해 적용되었습니다.^8,11,14. 지금까지 소포 형성을 위한 응용 프로토콜은 마이크로미터 크기의 어셈블리에 대한 조립 제어가 부족한 경우가 많습니다.^16,17또는 조립 수율이 제한되어 있습니다.⁵. 또한, 일부 보고 ELP 기반 소포 는 캡슐화 잠재력을 손상¹²또는 시간이 지남에 따라 제한된 안정성⁹. 이러한 단점을 해결하는 제시된 프로토콜은 뚜렷한 물리화학적 특성, 양호한 캡슐화 잠재력 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조의 자체 조립을 가능하게 합니다. 맞춤형 양서류 ELP는 구형 응고체와 고도로 주문된 꼬인 섬유 번들에서 적용된 프로토콜 및 관련 환경 조건에 따라 unilamellar 소포에 이르기까지 다양한 범위의 상분자 구조로 조립됩니다. 큰 수피 단백질 막 기지를 둔 구획 (PMBC)는 리포좀과 유사한 막 융합 및 상 분리 행동과 같은 모든 주요 표현형을 밝힙니다. PMBC는 간단한 epifluorescence 현미경 검사법을 사용하여 모니터링할 수 있는 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 효율적으로 캡슐화합니다. 이 연구에서 사용되는 반복적 인 ELP 도메인은 단백질 기반의 초분자 아키텍처를위한 매력적인 빌딩 블록입니다.¹⁸. ELP 펜타펩타이드 반복 유닛(VPGVG)은 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서 네 번째 위치(발린, V)에서 프롤린 외에 다른 aa를 견딜 수 있는 것으로 알려져 있습니다.¹⁹. 특유의 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양과성 ELP의 설계는 뚜렷한 소수성, 극성 및 전하를 가진 VPGXG 반복에 aa 게스트 잔류물 (X)을 삽입함으로써 실현되었습니다.²⁰. 친수성 도메인이 충전된 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)을 게스트 잔류물로 함유하는 동안 소수성 페닐알라닌(F) 또는 이솔루신(I)을 구비한 양과성 ELP 도메인. 적격 한 양과 성 ELP 구문 및 해당 aa 시퀀스의 목록은 보충 정보 및 참조에서 찾을 수 있습니다.^8,21. 형광 현미경 검사법을 통해 시각화를 위한 작은 형광 염료 또는 형광 단백질을 갖춘 모든 빌딩 블록. mEGFP 및 기타 형광 단백질은 ELP 양서류의 친수성 도메인에 N-말단 융합되었다. 유기 염료는 구리가 없는 균주를 통해 공액화되었고 알키네-아지드 사이클로아더(SPAAC)를 동시 도입된 부자연 아미노산(UAA)으로 촉진시켰다. UAA의 공동 번역 편입para-아지도페닐알라닌 (파즈프)²²친수성 ELP 도메인의 N 말단 수정을 허용합니다. 이에 녹색 형광염료 BDP-FL-PEG₄-DBCO(BDP) 또는 변형된 사이클로크틴을 가진 임의의 작은 형광 분자는 형광 프로브로서 사용될 수 있다. UAA pAzF의 성공적인 통합과 SPAAC를 통한 염료의 사이클로추가는 해당 트립틱 펩타이드의 효율적인 이온화로 인해 LC-MS/MS를 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.⁸. 이 작은 유기 염료는 형광 단백질이 대부분의 유기 용매와 호환되지 않으므로 조립 프로토콜에 대한 용매 선택을 넓히기 위해 적용되었습니다. 실험실에서 개발된 상분자 구조에 대한 가장 효율적인 조립 프로토콜 2개는 아래에 설명되어 있습니다. THF 팽윤 방법은 유기 염료 변형 양과성 ELP와만 호환됩니다. 대조적으로, 1-부탄올(BuOH) 압출 방법은 형광 프로브와 같은 많은 단백질과 호환되며, 예를 들어 mEGFP, 기재된 방법은 이들 융합 단백질의 형광을 완전히 보존하기 때문이다. 또한, 소분자 및 수혈융합 거동을 캡슐화하는 것은 BuOH 압출 방법을 채택함으로써 가장 잘 작동한다.

프로토콜

1. 양과성 엘라스틴과 같은 단백질의 설계 및 복제 (ELP)

1. 다른 곳에서 설명한 대로 구성을 복제하고^{디자인합니다 8,,20}. 플라스미드는 요청 시 이용 가능합니다.

2. 단백질 발현, 정제 및 준비

1. F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현
   1. 하룻밤 사전 배양에서 0.3의 OD_600까지 메인 발현 배양액을 접종합니다. 37°C에서 배양, 멸균 된 400 mL LB 배지에서 2 L 플라스크에서 적절한 항생제로 보충.
   2. 초순수에서 발현 배양의 유도를 위한 IPTG 스톡 솔루션(1M)을 준비한다.
   3. OD₆₀₀ 0.5-0.8에 도달하면 발현 배양에 IPTG를 추가하여 최종 농도인 1 mM을 추가하고 인큐베이션 온도를 20°C로 줄입니다. 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오.
2. UAA pAzF를 포함하는 양과성 ELP의 발현
   1. 2개의 플라스미드 pEVOL pAzF 및 예를 들어 pET28-NMBL-(TAG)를 포함하는 하룻밤 대장균 사전 배양으로부터 의 주요 발현 배양으로부터 의 OD_600에 0.3의 그의 접종(아미노산 서열에 대한 보충 정보 참조). 37°C에서 배양하고, 2L 플라스크에 카나마이신과 클로람페니콜을 보충한 멸균 400 mL LB 배지에서 200 rpm을 배양하였다.
   2. 초순수에 100 mMM pAzF 스톡 솔루션을 준비하십시오. 10 mL의 pAzF 스톡 솔루션의 경우 206.2 mg의 pAzF를 측정하고 8 mL의 초순수로 다시 일시 중단하십시오. pAzF를 용해시키기 위해 용액의 pH를 3 M NaOH로 올리고 격렬하게 혼합한다. pAzF가 용해되면 pH를 10.5로 조심스럽게 낮추고 최종 부피 인 10 mL에 초순수를 추가하십시오. 멸균 필터(0.22 μm)를 사용하고 2 mL 반응 튜브에서 용액을 알리쿼트합니다.
   3. 초순수에 1M IPTG 스톡 솔루션과 초순수에 20% 아라비노스 스톡 솔루션을 준비합니다.
   4. OD₆₀₀ 0.5-0.8에 도달하면, 2 mM의 최종 농도에 발현 배양에 pAzF를 추가한다. pAzF 섭취를 허용하도록 10분, 37°C, 200 rpm동안 배양배양한다.
   5. IPTG (1 mM) 및 아라비노스 (2%)의 동시 첨가를 통해 필요한 tRNA /t-RNA 합성물의 표적 단백질 발현 및 발현 유도 인큐베이션 온도를 20°C로 낮추십시오.
   6. 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오. 4°C, 4000 x g,40분에서 원심분리에 의한 수확 발현 배양.
3. 세포 용해 및 단백질 정제
   1. 리소자임(0.1 mg/mL) 및 PMSF(0.1 mg/mL)를 함유하는 용해 완충액(배양 리터당 10 mL, 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% 트리톤 X-100)에서 대장균 펠릿을 재중단시켰다. 얼음에 30 분 동안 배양하고 액체 질소에 샘플을 침수하여 나중에 두 번 동결 및 해동.
   2. 현탁액을 초음파 처리 (30%, 15 회, 30 초 : 10 초 휴식)를 원심 분리를 통해 용해 (4 °C, 40 분 동안 10,000 x g)를 제거하십시오.
   3. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다(예를 들어 분획 수집기에 연결된 FPLC 시스템을 사용하여 1 mL 니켈 컬럼에서; 재료 표참조). 용출 완충제 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M 우레아, 250-500 mM 이미다졸)로 단백질을 용출하고 추가 처리 될 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
   4. SDS-PAGE를 통해 정제 효율을 분석합니다.

3. SPAAC를 통한 ELP의 염료 수정

1. ELP 용액의 농도를 대략 추정합니다.  pAzF-R40F20 서열은 UV 범위에서 흡수되는 아미노산이 결여되어 있기 때문에 농도 평가를 위한₂₈₀ 흡수는 가치가 없다. 따라서, 이전에 는 동약 및 가중 ELP 양피필SSS PAGE 대역 비교를 위한 참고자료로 사용될 수 있다. ELP 솔루션에서 SDS PAGE 대역의 합산된 회색 값 의 영성을 비교하여 알려진 농도와 시료의 대략적인 농도를 추정할 수 있습니다.
2. 형광 염료 BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM 스톡 솔루션; 20 μM 최종 농도)를 ELP 용액 의 500 μL (~20 μM)에 추가합니다. 15°C에서 약 10시간 동안 반응을 배양하면서, 흔들면서 빛으로부터 보호하였다.
3. 추가 사용에 대 한, 과도 한 BDP를 제거 하는 반응을 투석.
   1. 10 분 동안 초순수에서 투석 막 (예 : 12 kDa 컷오프)을 평형화. 투석 막을 올바른 크기로 잘라 클릭 한 ELP 용액을 함유한 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다. 개구부에서 투석 막을 고정하려면 개구부에 코어를 펀칭하여 반응 튜브 뚜껑을 놓아 튜브를 닫습니다.
   2. 반응 튜브를 선택한 버퍼에 거꾸로 놓습니다. 투석 후 버퍼(2-5L)를 매번 적어도 3시간 동안 교환합니다. 투석 막과 완충제 사이에 갇힌 기포를 제거하여 성공적인 투석을 보장합니다.

4. THF 붓기 프로토콜

1. 투석 균질 ELP 용액은 안정된 pH 7.5를 가진 인산염 또는 트리스 완충액(10 mM)에 대하여 그의 태그 정제로부터 염 및 잔여 화합물을 제거한다.
2. 동결 건조를 위해 동결 건조를 시작하고 온도로 식히십시오.
3. 1.5 mL 반응 튜브 (튜브 당 50-500 μL)에서 투석 단백질 용액을 알리쿼트하고 액체 질소에서 충격 동결. 동결 건조 중에 다른 단백질 용액의 원치 않는 혼합을 방지하기 위해, 작은 구멍이있는 캡을 반응 튜브 위에 올려 부분적으로 밀봉 할 수 있습니다.
4. 액체 질소에서 냉동 된 단백질 샘플을 가지고 즉시 동결 건조를 시작하기 위해 동결 필로에 배치합니다. 시료가 완전히 건조되면 동결 건조가 완료됩니다 (약 24-48 시간). 그 후, 건조 N_2와공기 애호가 ELPs를 환기, 다음 즉시 공기 수분과의 접촉을 피하기 위해 반응 튜브 뚜껑을 닫습니다.
5. 용약 샘플 (ELP, 5-10 μM)에 순수한 THF를 추가하고 THF에서 ELP의 팽윤을 허용하기 위해 얼음 물이 함유 된 수조 초음파 처리기에 용액을 15 분 동안 놓습니다.
6. 소포 형성을 위해 30-60 °C또는 섬유 형성을 위해 최대 90 °C까지 열열 처리하고 초순수 또는 완충액을 포함하는 새로운 반응 튜브를 준비합니다 (50 mM NaH₂PO₄/ Na₂HPO_4,50 mM NaCl, pH 5-13). 구형 응고체는 pH 9-13 내에서 20°C에서 주로 조립됩니다. 소포 형성은 pH 7과 9 사이의 50-60°C에서 선호된다. 섬유 형성은 pH 5 와 12 사이에서 60°C 이상으로 미리 유도된다.
7. 초음파 처리 단계 후 ELP /THF 용액과 준비된 초순수 또는 완충액을 열순환기에서 넣고 원하는 온도까지 5 분 동안 가열하십시오. 온도에 도달하면 예열 된 ELP / THF 용액은 예열 된 초순수 또는 완충액 위에 신중하게 계층화해야합니다. 고유한 인터페이스를 가진 두 단계의 명확한 분리가 표시되어야 합니다.
8. 혼합물을 다시 열사이클러에 넣고 20 분 동안 배양하여 계면에서 소포 또는 섬유 형성을 허용합니다. 그 후, 형광 현미경 또는 투석을 통해 분석하기 전에 샘플을 실온으로 10 분 동안 식힙니다.
9. 초순수 또는 완충액에 대한 초분자 구조를 함유하는 투석액(50 mM NaH₂PO_4/Na2HPO_4,50 mM NaCl, pH 7-10).

5. BuOH 압출 프로토콜

1. 초순수 또는 완충액(50 mM pb pH 7.5, 100 mM NaCl, 최대 4M 우레아을 함유할 수 있음)에서 1-50 μM ELP 용액을 준비한다. 양과성 ELP F20R20-mEGFP 및 F20R20-mCherry 용액의 농도는 어금니 소멸 계수(F20R20-mEGFP A_{280= 22015} ^{M-1 cm-1} 및 F20R20-mCherry A₂₈₀₌ 34380^M-1)를 사용하여 결정될 수 있다.^-1
2. 10%-20%(v/v) 1-부타놀을 추가하고 즉시 파이펫팅또는 주사기를 여러 번 통해 그려서 용액을 혼합합니다. 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 일반적인 100 μL 파이펫 또는 해밀턴 주사기를 적용할 수 있습니다. 혼합 중 용액의 탁도가 증가하여 소포 형성을 나타냅니다. 1-옥탄놀 5%-15% (v/v) 또한 1-부탄올 대신 소포 압출에 사용할 수 있습니다.
3. 좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 실온에서 1 μm의 기공 크기의 멤브레인을 통해 미니 압출기를 사용하여 소포를 압출한다. 압출에 사용되는 멤브레인 크기는 소포의 상부 크기 컷오프를 결정합니다.
4. 상기와 같이 소포를 투석(단계 3.3)하여 잔류 1-부탄올을 제거한다.

6. BuOH 압출 프로토콜로 염료 캡슐화

1. 약 40 μL ELP 용액을 10 mM Tris-HCl, pH 8과 1 μL Dextran 텍사스 레드 (0.0025 mg/mL 최종 농도)로 혼합합니다.
2. 용액에 BuOH 10 μL을 추가하고 0.25 x 25mm 바늘이 장착 된 주사기를 통해 5-10 회 돌출시하십시오.

7. 형광 현미경을 이용한 초분자 구조 분석

1. 유리 슬라이드에 보강 링을 놓고 접착제 면을 유리에 단단히 누릅니다.
2. 철근 링 안쪽에 시료 5 μL을 추가하고 커버 슬립을 위에 놓습니다.
3. 분석 중에 샘플이 증발하지 않도록 커버 슬립 가장자리에 매니큐어로 시료를 밀봉합니다.
4. 앞서 설명한 대로 형광 현미경 검사법을 수행^8.

결과

소포 생산을 위한 프로토콜 개발
그림 1은 두 가지 다른 소포 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 좌측의 THF 팽윤 방법은 3개의 연속적인 단계로 구성되며 온도에 따라 ELP의 상이한 상이한 분자 어셈블리를 초래한다. 그림 1A 에피오레스내시크 현미경 이미지는 BDP-R20F20에서 조립된 소포와 BDP-R40F20에서 조립된 섬유소 ?...

토론

정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.

양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth