쥐에 있는 이종 심혼 및 심장 근육 세포 이식을 위한 면역학 모형

요약

우리는 쥐에 있는 이종 성 복부 심혼 이식의 모형을 기술합니다, 현재 전략의 수정을 암시하는, 이는 단순화한 외과 접근으로 이끌어 내는. 추가적으로, 우리는 쥐에 있는 추가 이식 면역학 분석을 허용하는 중요한 심장 근육 세포의 귀 주입에 의하여 새로운 거부 모델을 기술합니다.

초록

쥐에서의 이종성 심장 이식은 50년 이상 다양한 면역학적 연구에 일반적으로 사용되는 모델이었다. 1964년 첫 번째 설명 이후 몇 가지 수정 사항이 보고되었습니다. 쥐에서 이종성 심장 이식을 수행 30 년 후, 우리는 쉽게 가르치고 추가 수술 훈련이나 배경없이 수행 할 수있는 단순화 된 수술 접근 방식을 개발했다.

오름차순 대동맥과 우수하고 열등한 기병 및 폐 정맥의 폐 동맥 및 결찰을 해부한 후, 기증자 심장을 수확하고 이어서 헤파린으로 보충 된 얼음 차가운 식염수 용액으로 관류합니다. 수용인 복부 혈관을 클램핑하고 절개한 후, 기증자는 오름차순 대동맥과 폐 동맥을 각각 연속 적인 실행 봉합사를 사용하여 수용자 복부 대동맥 및 열등한 정맥에 해부학됩니다.

다른 기증자-수령인 조합에 따라, 이 모형은 동종 이식의 급성 또는 만성 거부의 분석을 허용합니다. 이 모형의 면역학 중요성은 중요한 심장 근육 세포의 귀 주입의 새로운 접근 및 배수 자궁 경관 림프조직의 후속 분석에 의해 더욱 강화됩니다.

서문

이종성 심장 이식은 이식 허용 오차, 급성 및 만성 동종 이식 거부, 허혈 재관류 손상, 기계 관류 또는 심장 리모델링에 관한 다양한 조사를 위해 자주 사용되는 실험 모델입니다. 다른 장점 들 중에서도, 이식 기능은 촉진및 이식 실패에 의해 비침습적으로 모니터링될 수 있으며 신장이나 간과 같은 다른 장기와 달리 수용자의 중요한 손상을 유발하지 않는다.

에서 1964, Abbott 외. 처음에 쥐에 이종 성 복 부 심장 이식 설명^1. 나중에, 1966년에, 해부학을 위한 종단 간 기술은 Tomita 등^2에의해 기술되었습니다. 현재 사용되는 모델의 기초는 1969 년 오노와 린지에 의해보고되었다³. 지난 수십 년 동안, 결합된 이종성 심폐 이식^4,,5,,6을포함하여 언로드, 부분적으로 로드되거나 로드된 좌심실 심장 이식의 다른 모형을 만들기 위하여 몇몇 수정이 간행되었습니다. 면역학 분석을 위해 비부적 부하 심장 이식 이식이 가장 일반적으로 수행됩니다. 이 경우, 혈류는 기증자가 대동맥을 상승하고 이어서 관상 동맥으로 역행하게 들어간다. 정맥 배수는 관상 동맥 부비동을 따라 오른쪽 심방과 심실로 발생합니다(그림 1A-B). 따라서 좌심실은 테베시안 정맥에서 혈액의 한계 양을 제외하고 혈류에서 제외됩니다. 이것은 또한 좌심실 보조 장치 치료 동안 병리 생리학적 메커니즘을 연구하기 위한 유용한 모형^7.

이종성 심장 이식은 마우스, 토끼, 돼지 등 다양한 종에서 수행되어 왔으며 심지어 인간^{8,9,10,,11에서}단일 또는 쌍심실 보조 장치로 사용되어 왔다.^9, 쥐는 여전히 이식 모델에 대한 인기 있는 실험 동물을 나타내며, 특히 상이한 쥐 균주 조합에 대한 이식 편이식 생존 시간이 과거에 잘 정의되어 왔기 때문에 많은 수의 면역학적 시약이 접근^{가능12,,13.} 마우스와는 달리, 쥐는 면역학적 분석을 위한 림프 조직에 더 큰 만들기 수술 및 접근이 더 실현 가능한^12입니다. 더욱이, 최근 래트에서 상업적 복제 기술의 도입은 실험적인 쥐^{모델(14)에}대한 반복적인 관심을 유도할 가능성이 크다.

일반적으로, 이종성 심장 이식편은 자궁 경부 또는 복부 해부학을 수행함으로써 수용자 혈관에 부착될 수 있다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 대퇴문 해부학이 수동 촉진 또는 경피 심초음파에 대한 더 나은 접근 때문에 향상한 감시를 용이하게 하고 이렇게 접목 실패의 더 정확한 검출을 허용한다는 것을^{건의합니다 15,,16.}

동작 시간, 합병증 비율, 결과 및 이식편 생존 시간에 관한 차이가 없는 것으로 나타났다^17. 분명히, 충분한 수의 배수 림프절의 가용성은 자궁 경부 해부학의 이점으로 언급되어야합니다. 그러나, 더 긴 훈련 기간이 필요합니다. 대조적으로, 복부 문합은 면역 학적 조사를 위해 덜 복잡하고 동등하게 가치가 있습니다, 특히 알로겐성 심장 근육 세포및 후속 자궁 경부 림프절 절제술의 귀 내 주사의 새로운 방법의 결과와 결합 될 때. 두 모델의 조합은 개입 후 면역 학적 분석의 광범위한 스펙트럼을 제공합니다.

다음 프로토콜은 허혈 시간을 줄이기 위해 외과 의사의 쌍으로 작동을 말합니다. 그러나, 모든 실험은 한 사람에 의해 수행 될 수있다. 심장 박식 및 이식을 위한 기기 및 재료의 설정은 그림 2A-B에표시됩니다.

프로토콜

모든 동물 체험은 니더작센(LAVES, 올덴부르크, 독일)의 소비자 보호 및 식품 안전을 위해 지역 당국의 지역 윤리 동물 검토 위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 승인 된 IDs 12/0768 및 17/2472.

1. 심장 박식 및 관류

참고: 접목 기증자로서, 7-22주 령의 나이에 암컷 또는 수컷 쥐가 사용되었다.

1. 이소플루란 흡입으로 기증자 쥐를 마취시요(5%에서 유도,_O2 1L/min의 3%로 유지보수). 주입 5 카프로펜의 mg 을 피하 적으로 perioperative 진통에 대 한 체중의 킬로그램 당 고 투 박 금 반사의 부재에 대 한 확인.
2. 눈 윤활제를 바르고 기계식 클리퍼를 사용하여 복부 및 흉부 털을 제거합니다.
3. 기증자를 척추 위치에 놓고, 탄력있는 밴드로 수술 대위에 사지를 고정하고 70 % 에탄올 또는 다른 충분한 대안으로 피부를 살균하십시오.
4. 국소 마취제 의 적용 후 세로 방향으로 피부를 절개 (예를 들어, 리도카인 0.2 %) 가위를 사용하여 중간 개복술을 수행합니다.
5. 리트랙터를 삽입하고, 기증자의 왼쪽에 소장을 동원하고, 멸균 된 면봉으로 열등한 정맥을 노출하십시오.
6. 항응고를 위해, 열등한 베나 카바를 천공하여 얼음-차가운 동위 원소 식염수 용액 1 mL에 용해된 헤파린 500 I.U.를 정맥내로 주입한다. 바늘을 철회 한 후 면봉으로 가벼운 압축으로 펑크 부위에서 출혈을 멈춥니다(그림 3A).
7. 다이어프램을 절개하고 기증자의 양쪽에 측면 대두 절제술을 수행합니다.
8. 흉부의 동원된 복부 벽을 수술대에 고정합니다.
9. 두 개의 마이크로 니들 홀더를 사용하여 무딘 준비로 심낭과 미근 신경을 제거합니다.
10. 기증자를 추방하고 심장을 내리기 위해 복부 혈관의 절제술을 수행하십시오.
11. 프로브 의 무딘 분기를 트랜스버 심낭 부비동에 삽입하고 젖은 압축으로 심장의 가벼운 코그트랙 견인하에 가능한 한 말단으로 승천 대동맥과 폐 동맥을 분리합니다(그림 3B).
12. 우수하고 열등한 정맥과 폐 정맥 주위에 단일 5-0 합자를 놓고 가능한 한 등등으로 조입니다(그림 3C).
13. 조직을 등도를 합자에 분리하고 심장을 추출합니다(도3D).
14. 이식된 심장을 정맥 카테터로부터 오름차순 으로 캐뉼라와 폐 동맥을 통해 30 mL의 얼음-차가운, 이소톤 식염수 용액을 1000 I.U.로 보충하고 15 mL 튜브에 심장을 얼음에 담사(그림3E-F)로주입하였다.

2. 심장 이식

참고: 수령인으로, 10-14 주 오래 된 여성 또는 남성 쥐 사용 되었다. 기증자와 수령인은 대략 무게가 일치했습니다.

1. 또한 isoflurane 흡입을 사용하여 받는 쥐의 마취를 수행 (5 %에서 유도 및 유지 보수 1.5-2% O₂ 의 흐름 1 L / 분). 주입 5 카프로펜의 mg 을 피하 적으로 perioperative 진통에 대 한 체중의 킬로그램 당 고 투 박 금 반사의 부재에 대 한 확인.
2. 눈 윤활제를 바르고, 복부 털을 제거하고, 팔다리를 고치고, 기증자 준비와 유사하게 피부를 살균하십시오. 최적의 수술 후 결과를 위해, 수술 중 저체온증을 방지하기 위해 가열 매트에 작업을 수행합니다.
3. 피부의 세로 절개 후, 복부 근막에 리도카인 (0.2 %)과 같은 국소 마취제를 적용하십시오. 중간 개복술로 복강을 열고 리트랙터를 삽입합니다.
4. 수령인의 왼쪽 상단에 소장을 동원하고 따뜻하고 젖은 압축에 놓습니다.
5. 십이지장과 근위축을 각각 동원한 후, 5-7배 배율로 수술용 현미경(또는 돋보기)을 사용하여 면봉으로 무딘 제제로 복부 대류와 열등한 정맥을 노출시켰다. 복부 혈관을 분리하지 마십시오.
6. 요추 정맥을 손상시키지 않고 두 개의 마이크로 니들 홀더를 사용하여 복부 혈관을 높이고 쿨리 혈관 클램프를 배치합니다(그림 4A).
7. 30-45 ° 아치형 27 G 캐뉼라로 복부 혈관을 뚫습니다(그림 4B).
8. Potts 가위를 사용하여 천자 부위를 확대하여 기증자 혈관의 내강 크기와 일치하는 세로 절개를 만들고(그림 4C-D)응고를 제거하고 수술 후 혈전증을 예방하기 위해 수용자 혈관에 식염수 용액을 주입합니다.
9. 이식편을 소동에 넣고 기증자가 오름차순을 두 개의 간단한 중단 바늘로 받는 복부 대동맥에 고정시다 (8-0) 세로 절개절의 두개골 및 꼬리 모서리에서 모노필라멘트 비-재음봉합사(그림4E).
10. 8-0을 실행하여 수령인의 복부 대와 기증자의 오름차순 대단을 anastomose 두 단계로 모모노 필라멘트 봉합사 : 먼저, 수신자 혈관의 오른쪽에 접목을 배치하고 해부학의 전반을 수행(그림 4E). 이어서, 접목을 수용자 혈관의 왼쪽에 놓고 해부학의 후반을 수행한다(그림 4F).
11. 대동맥 항문과 유사하게 열등한 정맥에 공여폐 동맥을 고정 (8-0) 모노필라멘트 비-레서블 봉합사). 혈관의 내발측에서 정맥 해부학의 전반부를 봉합(그림 4G-H).
12. 말초 색전증을 방지하기 위해 매듭을 조이기 전에 식염수로 해부학을 직접 씻어 내보하십시오.
13. 지혈 거즈를 두 해부학 주위에 놓고 이식의 재관류가 시작될 수 있도록 쿨리 혈관 클램프를 조심스럽게 놓습니다. 살균 된 면봉으로 가벼운 압축으로 해부학을 따라 출혈을 처리하십시오.
    참고 : 접목은 약 60 초 후에 치기 시작해야합니다.
14. 장내를 패션과 같은 구불구불한 것으로 교체하십시오. 장 내 괴사 또는 기계적 방해를 방지하기 위해 장간막 방랑색의 부회전이 없는지 확인하십시오.
15. 연속 3-0 폴리 필라멘트 실행 봉합사를 사용하여 복부 근육 / 근막과 피부를 별도로 닫습니다.

3. 수술 후 치료

1. 수술 후 진통의 경우, 첫 번째 수술 후 날 (POD)에 체중 kg 당 카프로펜 5 mg의 추가 피하 주사를 수령인에게 공급하십시오. 또한, 세 번째 POD까지 500 mL의 식수에 메타미졸 1 g을 추가하십시오.
2. 세 번째 POD에서 매일 복부 촉진으로 심장 이식 기능을 모니터링하기 시작합니다.
   참고 : 세 번째 POD 전에 접목 실패의 경우, 면역 장애보다는 수술을 고려해야합니다. 그러나, 이것은 물론 선택된 균주 조합 및 각각의 면역학적 모델(예를 들어, 사전 예방 접종 후과급성 거부)에 의존한다.
3. 이식 거부 에 이어, 유세포 분석 또는 면역 조직 화학을 통해 추가 면역학 분석을 위한 해부학, 비장, 혈액, 흉선 및 이식의 배수 후배 회액 림프절 과 같은 조직을 추출합니다.

4. 심장의 효소 소화와 귀에 심장 세포의 피하 주입

1. 이종성 심장 이식과 유사하게 심장 박식 및 관류를 수행합니다(1단계 참조).
2. 멸균 메스 또는 멸균 가위를 사용하여 3 mm x 3 mm 블록으로 심장을 파쇄하고 0.5 mg / mL 콜라게나아제를 함유 한 배양 배지에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   참고: 특히 FCS가 콜라게나아제 소화를 억제하기 때문에 태아 송아지 혈청(FCS)없이 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유한 배양 배지를 사용하는 것이 중요합니다.
3. 소화 된 조직을 큰 체에 추가하면서 배양 배지를 제거하고 철저히 다진 후 중요한 심장 근육 세포, 주로 죽은 단일 심장 세포 및 남아있는 혈액 세포의 현탁액을 얻습니다. 멸균 동위 원소 식염수로 셀 서스펜션을 두 번 씻으소서.
   참고 : 원심 분리 설정 : 10 분, 200 x g, 20 °C
4. 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 걸러내고 동위 원소 식염수 용액의 5-10 mL로 세포 스트레이너를 플러시하여 중요한 세포 붕어를 수집합니다.
5. 원심 분리 후, 5x10⁵ 세포/mL의 농도로 용해된 식염수로 심장 근육 세포를 다시 중단하고 세포 용액을 1 mL 주사기로 끌어올.
6. 이종성 심장 이식에 대해 수용인 마취(단계 2 참조)에 대해 기재된 프로토콜과 유사하게 마취를 수행한다.
7. 양면 테이프를 사용하여 수신자를 측면 위치에 놓고 손가락으로 귀를 고정합니다(그림5A).
8. 27 G cannula s.c.를 통해 심장 근육 세포 용액 (1 x 10⁴ 세포 포함)의 20 μL을 시각적 모세관 혈관에 가까운 수령인의 귀에 주입합니다(그림 5B).
9. 정의된 관찰 기간(선택된 균주 조합 및 거부강도에 따라), 배수 자궁 경부 림프절을 추출하고 유세포 분석 또는 공동 배양과 같은 추가 분석을 수행한다(그림5C).
   참고 : 또한, 피나 조직학적 분석은 세포 침투를 결정하기 위해 수행 될 수있다.

결과

과거에는 다른 면역학 적 문제가 모델에 기초하여 해결되었으며, 이는 95% 이상의 생존율을 가진 500개 이상의 이식에 의해 작업 군에서 검증되었으며,^{13,,18,,19,,20,21, 22,,,,23,,24....}

토론

앞서 설명한 쥐의 이종성 심장 이식 방법은 주로 1969년 오노와³린지의 설명에 기초한다 3. 그 이후로, 이 모형의 넓은 다양성으로 이끌어 내는 각종 종에서 몇몇 수정이 소개되었습니다. 이러한 수정의 몇 가지를 결합하고 실험실에서 이종 성 심장 이식을 수행의 30 년 이상에서 발생하는 우리 자신의 경험을 소개, 우리는 긴 훈련 기간이나 수술 배경을 필요로하지 않는 가능한 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R