혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

요약

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

초록

배아 성 신장 organotypic 문화, 특히 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드는 발달 과정을 따르고 신장 질환을 모델링하기위한 훌륭한 도구입니다. 그러나, 모델은 혈관화 및 기능의 부족에 의해 제한된다. 이를 해결하기 위해, 조류 배아의 융모란투막(CAM)에 세포 및 조직을 이식하는 방법에 대한 개선된 프로토콜이 개발되어 혈관을 혈관화하고 혈류의 회복을 얻었다. 접목은 샘플을 CAM에 고정하고 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지를 공급하는 맞춤형 미니 저장소로 오버레이됩니다. 개선된 배양 방법은 이종이식을 최대 9일 동안 자랄 수 있게 합니다. 원고는 또한 이전에 간행된 고정 Z 방향 (FiZD) 방법을 사용하여 신장 오르가노이드 및 orgnotnotypic 문화의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 유리 커버슬립과 멤브레인 사이에 배아 장기 또는 오르가노이드를 다량의 배지로 부드럽게 압축하고 최대 12일 동안 이미징을 위한 우수한 조건을 제공합니다. 함께, 이 방법은 향상한 공초점 화상 진찰을 가진 신장 오르가노이드 및 organotypic 신장 문화에 혈관화 그리고 혈류량을 허용합니다. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 신장의 기본 및 적용 기능을 연구하는 데 매우 유용합니다. 두 방법 모두 다양한 유형의 조직 및 오르가노이드에 적용 가능합니다.

서문

배아 신장의 오르가노티픽 배양은 수십 년 전^신발생을연구하는 중요한 모델이 되었다^1,2,,3. 신장 오르가노이드는 건강하고 병에 걸린 신장의 발달을 연구하기위한 고급 모델 시스템을 나타냅니다^4. 그러나 두 방법의 주요 단점은 두 방법 모두 신장의 주요 기능인 혈액 여과를 다시 요약하지 않는다는 것입니다. 네프론과 신장 혈관 구조는 생체 내 발달의 초기 단계와 유사하게 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화에서 개발; 그러나, 시험관내에서 형성된 사구체는 avascular^5. 생체내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 혈관화는 생체내 조건 하에서만 이식 실험에서 이전에 입증되었다. 예를 들어, 마우스 신장 캡슐 하에 인간 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드의 이식은 기능적 단계^6에오르가노이드에서 네프론의 발달을 허용한다.

순전히 생체외 배양과 생체 내 이식 방법 사이의 중간 접근법은 조류 배아의 CAM에 대한 이종이식이다. 그대로 마우스 신장 프리모르디아의 혈관화는 이전에 이 시스템을 사용하여 입증되었다^7,,8. 그러나, 또한, 이종이이식된 뮤린 신장에서의 신장 혈관구조는 이식편^9가아닌 숙주 내피로부터 유래된 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 실험 조건이 공여자 유래 내피 세포의 생존을 위해 허용되지 않기 때문에 신장 혈관구조의 개발을 연구하기 위해 배아 신장의 키메라(조류-포유류) 모델의 잠재력을 현저히 감소시켰습니다.

이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 제시 조류 계란의 CAM에 마우스 배아 신장의 재배에 대 한 향상 된 방법, organotypic 문화와 이종 이식의 미세 환경 조건을 결합. 이전 방법의 주요 개선은 마우스 배아 신장과 신장 오르가노이드를 CAM에 직접 배치하는 대신 이식 된 조직을 공급하는 배양 배지로 채워진 투과성 미니 저장소로 겹쳐져 있다는 것입니다. 영양분과 함께 건조로부터 보호합니다. 실험의 성공률은 크게 증가하고 기증자 유래 혈관 구조의 개발을위한 조건이 향상됩니다. 이 방법을 이방법에서 이방법 으로 이식 배양하는 것은 공여자 신장으로부터 내인성 내피 세포로 구성된 사구체 혈관구조의 발달을 초래한다.

세포 형태 형성의 상세한 분석은 신장 문화 모형의 또 다른 중요한 응용입니다. 신장 배양의 타임랩스 이미지 획득의 이전에 보고된 방법은 배아 신장의 전반적인 형태 및 패터닝의 분석에만 충분하지만, 개별^{세포(10)를}추적하는 것은 아니다. 최근, 신장 오르가노이드 및 오르노티픽 배양의 고해상도 공초점 3D 타임랩스 영상을 겨냥한 새로운 고정 Z-Direction(FiZD) 방법을^{11개기하였다.} 이 방법에서, 오르가노이드와 배아 기관은 샘플의 두께가 70 μm에 도달 할 때까지 맞춤형 설계 플레이트에 트랜스 웰 삽입의 유리 커버 슬립과 투과성 멤브레인 사이에 부드럽게 압축되어 이미징을위한 최적의 광학 조건을 제공합니다. 방법의 두 번째 부분에서는, 장기 오르가노이드 화상 진찰을 위한 사용자 정의 디자인한 격판덮개 및 FiZD 실험의 설치를 위한 상세한 프로토콜이 기술됩니다.

프로토콜

동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 사용을위한 핀란드 의 국가 법률, 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약 (ETS 123), EU 지침 86/609 / EEC에 따라 시행되었습니다.

1. 닭 CAM에 마우스 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 재배를위한 미니 저수지의 제조 및 이종이식 실험을 설정

1. 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 트랜스웰 세포 배양 인서트를 사용하십시오.
   참고: 특정 실험에 따라 크거나 작은 미니 저장소를 사용할 수 있습니다. 최대 8개의 배아 신장을 이식하거나 동일한 닭 배아에 여러 개의 미니 저장소를 놓을 때(예: 동일한 닭 CAM에서 실험 및 대조군 샘플을) 작은 미니 저장소를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
2. 원형 톱날 또는 핸드 톱이 달린 회전식 멀티툴을 사용하여 인서트 의 측면을 잘라내어 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.
3. 메스 나 날카로운 칼로이 미니 저수지의 가장자리를 연마.
4. 미니 저장소를 70% 에탄올로 1시간 이상 살균합니다.
5. 미니 저수지를 오토클레이브 이중 증류수로 세척하고 층상 후드에서 건조시키십시오.
6. PBS 및 배양 매체 (고혈당 DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토미신)에서 미니 저장소를 헹구고 있습니다.
7. 페트리 접시에 저수지를 놓고, 멤브레인이 위를 향하여 배양 배지의 한 방울(600 μL/400 μL) 위에 놓습니다.
8. 파이펫 또는 유리 모세관의 도움으로 멤브레인에 골고루 해부 된 생체 내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드를 배열하십시오. 신장 주위에 액체를 많이 남기지 마십시오.
9. 샘플을 37°C 및 5%_CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 2-24시간 동안 멤브레인에 부착시키십시오.
   참고: 최대 8개의 E11.5 배아 마우스 신장 또는 신장 오르가노이드를 작은 삽입에 배열할 수 있습니다. 큰 삽입은 배아 조직의 더 큰 조각이 CAM의 더 큰 지역에 xenotransplant 또는 세포 하이드로겔 혼합물을 위해 사용될 경우에 추천됩니다.
10. 세포 배양 인큐베이터^12,,13에서이전에 공표된 방법에 따라 제조된 8일된 전 오보 배양 배아 닭을 복용한다.
11. 접목이 CAM을 향하도록 미니 저장소를 CAM으로 옮기고 멤브레인이 오버레이되도록 합니다. 닭 배아를 덮지 않도록 CAM 주변에 미니 저장소를 놓습니다.
    참고: 12개의 웰 플레이트용 트랜스웰 인서트에서 제작된 소형 미니저장소를 사용할 경우 하나의 CAM에 최대 3개의 미니 저장소를 배치할 수 있습니다.
12. 500 μL (6 웰 인서트를) 또는 300 μL (12 웰 삽입)의 배양 배지를 미니 저장소에 추가합니다.
13. 치킨 CAM에서 샘플을 최대 9 일 동안 재배하십시오. 매일 미니 저수지의 배양 매체를 교체하십시오.
    참고 : 시료의 혈관 화는 이식 후 24-48 시간 즉시 관찰 할 수 있습니다.

2. 맞춤형 플레이트 제작 및 FiZD 문화 설정

1. 6 웰 플레이트의 바닥에 20mm 직경 구멍을 뚫습니다.
   참고: FiZD 실험의 경우 깊이가 16mm인 6개의 웰 플레이트를 사용합니다(재료 표에명시됨).
2. 카운터싱크 드릴 비트, 메스 또는 날카로운 칼이 있는 전기 드릴을 사용하여 구멍의 테두리(특히 위쪽)를 연마합니다.
3. 플레이트를 70% 에탄올로 살균하여 1시간 이상 살균합니다.
4. 오토클레이브 이중 증류수로 플레이트를 세척하고 멸균 조건에서 건조시키십시오.
5. 철저하게 70 % 에탄올로 22mm x 22mm 유리 커버 슬립을 세척하거나 Saarela 등^11에의해 게시 된 프로토콜에 따라 청소합니다.
6. 무독성 조직 접착제를 사용하여 6 웰 플레이트의 구멍의 상부에 덮개 입술을 붙입니다. 구멍 주위에 접착제를 바르고 커버슬립을 가볍게 두어 덮습니다. 접착제를 말리십시오.
7. 스테레오현미경으로 플레이트를 검사하고 필요한 경우 커버슬립 표면에서 여분의 건조 접착제를 제거합니다.
   참고: 커버슬립 위에 접착제가 없는지 확인하여 시료를 균일하게 압축합니다.
8. 폴리스티렌 비드(70 μm 입자 크기)를 동일한 양의 하이드로겔과 혼합합니다. 웰당 50-100 μL의 부피는 충분합니다.
   참고 : 하이드로 겔과 폴리스티렌 구슬의 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
9. 트랜스웰 삽입을 해부 현미경 아래에 멤브레인을 위로 배치합니다.
10. 시료(예를 들어, 생체내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드)를 막에 고르게 배열한다.
11. 연약한 조직에 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 샘플 옆에 하이드로겔 / 폴리스티렌 비드 혼합물을 추가합니다.
12. 트랜스웰 인서트를 뒤집어 서식샘플이 있는 멤브레인이 아래를 향할 수 있도록 합니다.
13. 수정 된 6 웰 플레이트의 웰에 삽입을 부드럽게 놓고 샘플이 구슬 수준으로 압축되도록 부드럽게 누릅니다.
    참고 : 현미경을 사용하여 압축의 진행 상황을 따르십시오.
14. 인서트를 한 손으로 우물에 살짝 누르고 인서트 주변의 3점에서 납땜 인두로 플라스틱을 녹여 플레이트에 고정시십시오.
15. 인서트가 플레이트에 고정되면 배양 배지 2 mL (DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토마이신)을 웰에 추가하고 동일한 방법으로 플레이트에 남아있는 우물을 계속 조립하십시오.
16. 시간 경과 이미징을 위해 반전 된 현미경의 무대 인큐베이터에 완성 된 플레이트를 전송합니다.
17. 적절한 실험 설정을 사용하여 샘플의 타임랩스 이미징을 수행합니다.
    참고: 타임랩스 실험 중에 플레이트의 우물에서 배양 배지를 변경하는 것은 필요하지 않지만 인서트가 있는 구멍을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

결과

여기에 제시된 CAM 배양 프로토콜은 닭 CAM에 대한 이종이식의 결과로 신장 오르가노이드 및 배아 신장의 고효율 혈관을 가능하게하였다(그림 1, 영화 1). 배양 배지를 함유한 미니저수지는 기증자 조직에 영양분을 공급하고 적절한 혈관을 지정하기 전의 기간 동안 건조로부터 보호하였다. 이 방법은 기증자 유래 내피 세포가 성장하기 위한 관대한 조건을 제공했?...

토론

2개의 상세한 프로토콜은 고전적인 신장 organotypic 문화 방법을 구체화하고, 전 생체 내 배아 신장 및 오르가노이드의 혈관 세포화, 확장된 발달 및 최적 4D (즉, 3D 심상 및 시간) 화상 진찰을 가능하게 합니다 제시됩니다. 이 섹션에서는 메서드의 중요한 단계를 중대하고 문제 해결에 대해 설명합니다.

다른 CAM 배양 방법과 이 개선된 치킨 CAM 배양 방법의 유의한 차이점은 CAM에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610