P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

요약

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.^- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

초록

f폐감염의 치료를 위한 약물 연구는 높은 복잡성의 시험관 내 모델을 향해 진행되고 있다. 폐 모형에 있는 박테리아의 다각적인 존재는 면역 세포가 마이크로 환경에서 박테리아에 대하여 선동적인 반응을 조정하는 동안 상피 배열을 재적응할 수 있습니다. 생체 내 모델은 낭포성 섬유증의 맥락에서 새로운 항 감염제를 테스트하기위한 선택이지만, 그들은 여전히 인간과 치료 결과에 그러한 질병의 생체 내 상태를 정확하게 모방하지 않습니다. 인간 세포 (기관지 상피 및 대식세포)와 관련 병원체에 기초한 감염된 기도의 복잡한 시험관 내 모형은 이 간격을 다리를 내고 진료소로 새로운 항 감염제의 번역을 용이하게 할 수 있었습니다. 이러한 목적을 위해, 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및^- THP-1 단낭세포 유래 대식세포의 공동 배양 모델이 설립되어 공기 액체 인터페이스(ALI) 조건에서 P. aeruginosa에 의한 인간 기관지 점막의 감염을 모방하였다. 이 모델은 7 일 안에 설정되며, 다음과 같은 매개 변수는 동시에 평가됩니다 : 상피 장벽 무결성, 대식 세포 간 변형, 세균 생존 및 염증. 본 프로토콜은 새로운 항 감염제를 발견하고 폐에 에어로졸 납품을 최적화하는 것과 관련이 있을 수 있는 약물 효능 및 호스트 반응을 평가하기 위한 견고하고 재현 가능한 시스템을 설명합니다.

서문

슈도모나스 아에루기노사는 낭포성 섬유증(CF)의 관련 병원체로 폐 조직 장애^1에기여한다. 알자네이트 및 기타 점액 외극성 과 같은 다당류의 생산은, 끈질긴 세균 준수로 이끌어 내는 질병의 진행을 조정하고, 박테리아에 대한 항생제의 전달을 제한하고 숙주 면역 계통에 대하여 박테리아를 보호합니다^2. 판자에서 생물막 형성으로의 P. aeruginosa의 전환은 이러한 맥락에서 중요한 문제이며, 또한 항생제 내성의 발생을 용이하게합니다.

CF의 맥락에서 마우스는 주로 모델로 사용되었습니다. 마우스는, 그러나, CF 돌연변이^3의도입과 함께 자발적으로 이 질병을 개발하지 않는다. 대부분의 세균성 생물막 개발 및 약물 감수성 연구는 페트리 접시와 같은 무생물 표면에서 수행되었습니다. 그러나 이 방법은 생체 내 복잡성을 나타내지는 않습니다. 예를 들면, 중요한 생물학 장벽은 면역 세포 뿐만 아니라 점막 상피를 포함하여 결석합니다. P. aeruginosa는 상피 세포에 아주 유독하더라도, 몇몇 단은 인간 기관지 세포와 이전 P. aeruginosa 생물막을 공동 경작하는 것을 관리했습니다. 이들 세포는 CFTR 돌연변이(CFBE41o-세포)를 가진^- 낭포성⁴ 섬유증 환자로부터 유래하고 항생제 효능^5을 평가하거나 감염⁶시 CFTR 단백질의 교정을 평가할 수 있었다. 이러한 모델은 약물 개발7의 후기 단계에서 실패한 약물문제의 특성화를 가능하게 하는 것 외에도 약물 효능의⁷예측 가능성을 향상시키는 것으로 나타났다.

그러나 폐에서는 점막 상피가 공기에 노출됩니다. 더욱이, 기도에 존재하는 면역 세포는 조직 대식세포같이, 흡입한 병원체 또는 입자에 대하여 필수적인 역할을^{합니다 8.} 대식세포는 기관지 루멘에 도달하고 감염을 싸우기 위하여 다른 세포 층을 통해 이동합니다. 더욱이, 흡입된 약은 또한 폐 공기-혈액 장벽^9의추가 비세포 원소로서 점액의 존재에 대처해야 한다. 실제로 생체 외 모델의 복잡한 3차원(3D)이 개발되어 생체 내 관련성을 높이는 것을 목표로 하고 있다. 공동 배양 시스템은 약물 발견을 위한 체외 시스템의 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다. 이러한 복잡성은 대식세포^{이동(10),호중구(11)에}의한 항균 펩티드의 방출, 감염^9에서점액의 역할, 및 과도한^{손상(12)에}대한 상피 세포 반응에 대한 연구에서 해결되었다. 그러나, CF의 유전돌연변이를 특징으로 하는 신뢰할 수 있는 CF-감염 체외 모델, 공기에 노출되는 (생리학적 상태 증가), 면역 세포를 통합하는 것은 여전히 부족하다.

이 격차를 해소하기 위해 감염된 기도의 안정적인 인간 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 P. aeruginosa에 감염되고 확산 및 면역 학적 장벽을 모두 나타내는 인간 CF 기관지 상피 세포 및 대식세포의 구성이다. 합리적으로 높은 처리량에서 항 감염제를 테스트하는 것을 목표로, 이 공동 배양은 두 개의 인간 세포주를 사용하여 웰 플레이트 인서트의 투과성 필터 멤브레인에 설립되었습니다: CFBE41o^- 및 THP-1 단백세포 유래 대식세포. 더욱이, 결국 에어로졸화^{항감염제(13)의}증착을 연구하기 위해, 이 모델은 액체 가루 조건(LCC)이 아닌 공기-액체 인터페이스(ALI)에 확립되었다.

우리가 여기에서 보고하는 바와 같이, 이 모형은 약 발달을 위한 필수적인 매개 변수인 항생 처리에 세균성 생존뿐 아니라 세포 세포 독성, 상피 장벽 무결성, 대식세포 변환 및 선동적인 반응에 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜은 폐기도의 흡입 치료를 위한 두 가지 관련 세포 유형을 결합합니다: 대식세포및 CF 기관지 상피. 이 세포는 투과성 지지 인서트의 반대쪽에 시드되어 공기에 세포 노출을 허용합니다(공기-액체 인터페이스(ALI) 조건이라고 합니다. 숙주 세포의 이러한 공동 배양은 이후에 P. aeruginosa에감염된다. 두 숙주 세포주 모두 인간 기원입니다: 상피 세포는 CF 채널(CFBE41o-)에 돌연변이를 가진 낭포성^-섬유증 기관지 상피를 나타내며, THP-1¹⁴ 세포는 잘 특징적인 대식세포와 같은 세포주이다. 동천상피층은 대식세포와 같은 세포가 반대 구획에 추가되기 전에 웰 플레이트 인서츠의 상부에 형성될 수 있게 된다. ALI에서 공동 문화가 확립되면, 시스템은 apical 측에 P. aeruginosa와 접종된다. 이 감염된 공동 배양 시스템은 항생제, 예를 들어 토브라마이신의 효능을 평가하기 위해 사용됩니다. 다음 종점은 분석된다: 상피 방벽 무결성 경피성 전기 저항 (TEER), 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 의한 세포 세포 및 세포 박테리아 상호 작용의 시각화), 식민지 형성 단위 (CFU), 숙주 세포 생존 (세포 독성) 및 사이토카인 방출의 계산에 의한 세균 생존.

프로토콜

1. 투과성 지원 인서치에서 세포의 성장과 분화

1. CFBE41o 재배^- 10% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 최소 필수 배지(MEM)의 13mL을 함유한 T75 플라스크에서, 1% 비필수 아미노산과 600 mg/L 포도당에서 37°C에서 5%_CO2 분위기를 이룬다. 2-3일마다 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
   1. 플라스크에서 70% 합류한 후 3mL의 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 15분 동안 37°C로 분리한다. 7mL의 신선한 MEM을 추가하고 실온(RT)에서 4분 동안 300 x g의 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 MEM의 새로운 10mL를 추가하면서 덩어리를 부드럽게 위아래로 피펫으로 막습니다.
   2. 자동 세포 카운터 또는 혈혈계 챔버로 세포를 계산합니다. 투과성 지지대가 있는 12웰 플레이트에서 2 x 10⁵ 셀/웰의 밀도를 가진 종자 세포(3 μm의 모공 크기, 재료 표참조).
      참고: 자동화된 셀 카운터는 셀수, 크기 분포 및 셀의 생존 가능성을 결정합니다(재료 표참조). 0.4 μm의 모공 크기의 투과성 지지대가 여기에서 사용될 수 있습니다. 그러나, 대식세포는, 이 조건에서, apical 측에 직접 추가되어야 하고, 그들의 세포간 이동은 이 경우에 평가되지 않을 것입니다.
   3. 액체 액체 상태(LLC)의 종자 세포는 포과성 지지체의 정압 측에 셀 서스펜션의 500 μL과 바소포측에 있는 신선한 배지의 1.5mL를 첨가함으로써. 그런 다음 세포를 5% CO₂미만의 37°C에서 72h로 배양합니다.
   4. 파종 후 3일째에 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 이동하려면 먼저 바소포측에서 배지를 제거한 다음, 정물측에서 제거한다. 바소쪽 측에 신선한 MEM 500 μL을 추가하고 세포가 컨물수 단일 층을 형성 할 때까지 매 2 일마다 배지를 변경합니다.
      참고 : 이 프로토콜에 사용되는 조건의 경우 CFBE41o^- 세포는 일반적으로 배양에서 3-7 일 후에 수렴됩니다.
   5. 7일째 CFBE41o-정면에서 500 μL 세포^- 배지를 가진 세포와 1시간 동안 바편측에 1.5mL, 5% CO₂미만의 37°C에서 상피 장벽 특성을 평가한다.
   6. STX2 젓가락 전극과 상피 볼트-옴미터를 통해 경피성 전기 저항(TEER)을 통해 장벽 특성을 측정합니다. 7 일 후이것은 300 Ω × cm² 보다 높습니다.
      참고 : 결국, 일부 멤브레인 삽입에서 세포는 낮은 TEER를 가지고 있습니다. 따라서 TEER & lt, 300 Ω×cm²를 사용한 투과성 인서트는 사용되지 않습니다.
2. THP-1 세포를 재배하기 위해, 13mL의 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 배지를 사용하여 T75 플라스크에서 성장하여 10 % FCS로 보충하고 5 % CO₂미만의 37 ° C에서 배양하십시오. 새로운 T75 플라스크에서 2 x 10⁶ 세포/mL 세포를 시드하여 매 2일마다 셀을 분할합니다.
   참고: 비분화 THP-1 세포는 현탁액의 단핵구로 재배됩니다.
   1. THP-1 세포를 다음과 같이 분화한다. T75의 원심 분리기 내용은 300 x g에서 4 분 동안. 상체를 버리고, 펠릿을 신선한 매체로 재보설하고, 새로운 T75에 넣습니다. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 37 °C에서 48 h및 5 % CO₂ 대기^15에대한 RPMI에서 세포를 인큐베이터.
      참고: PMA와의 분화 후 세포는 더 이상 증식하지 않고 플라스크에 부착하지 않습니다.
   2. THP-1 대식세포와 같은 세포를 분리하려면 37°C에서 인산염 완충식식염수(PBS)로 한 번 세척하고 실온에서 0.5mM EDTA를 함유하는 세포 분리 용액 3mL(예: accutase)로 배양한다.
   3. 반전된 현미경으로 세포를 검사하여 세포 분리를 찾습니다. RT에서 4분 동안 300 x g에 신선한 중간 및 원심분리기 7mL을 추가합니다.
      참고: 대식세포는 트립신-EDTA, 37°C로 20분 동안 분리할 수도 있습니다. 그러나 트립신은 선택한 셀 분리 용액보다 대식세포에 가혹합니다(재료표참조).
   4. 상체를 제거한 후, THP-1 배지의 3mL에서 대식세포 세포를 15mL 원심관으로 재중단한 후, 1.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 계산한다. 공동 배양을 설정하기 전에 5 % CO₂ 에서 37 °C에서 최대 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 현탁액내의 THP-1 세포는 생존성 염료로 염색되어 공동 배양을 더 이미지화할 수 있다. 이 단계에서는 아래 절차(1.2.5 단계)를 사용합니다.
   5. 세포 생존 성 염료의 10 μM을 가진 얼룩 대식세포 (세포 내 에스테라아에 의한 아세테이트 모이티의 변환에 기초하여, 재료의 표참조) 있는 세포 생존성 염료의 3 μL이 세포 현탁액에 적용됩니다. 37°C에서 20분 동안 세포를 배양한 다음, 5% CO_2로세포를 배양한 다음 PBS 37°C로 1x를 세척하여 염료를 제거합니다.
      참고: 실온(RT)에서 4분 동안 300 x g에서 염료를 제거하는 세포를 원심분리합니다.

2. 투과성 지원에 대한 상피 대식세포 공동배양 수립

1. CFBE41o^{사용 -} TEER ≥ 300 Ω × cm² (단계 1.1.6.)와 ALI에서 단층. 하부 챔버에서 배지를 제거하고 멸균 유리 페트리 접시 내부의 지지체(50mm x 200mm)를 조심스럽게 반전시키고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 멤브레인 모공을 통해 자란 세포를 제거한다.
   참고: 3 μm의 모공 크기로 인해 상피 세포는 기공을 통해 바소포측쪽으로 자라는 경향이 있습니다. 따라서 이 쪽의 대식대를 추가하기 전에 제거해야합니다. CFBE41o^- 폐 상피 세포는이 단계에서 얼룩질 수 있습니다. 단계 1.2.5의 절차를 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포 현탁액 대신, MEM의 염료 용액은 투과성 지지체에 부착된 셀에(500 μL apical 측만)가 적용됩니다.
2. PMA 분화 THP-1 대식세포의 세포 현탁액으로부터 2 x 10⁵ 셀/웰(RPMI의 200μL)을 사용하고 세포를 반전 된 인서트의 바칼랄 측에 놓습니다.
3. 페트리 요리를 조심스럽게 닫고 5 % CO₂에서 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
4. 인서트를 12웰 마이크로플레이트에 다시 넣고 ALI 조건을 유지하기 위해 투과성 인서트의 바소쪽 측에 500 μL의 MEM 배지를 추가합니다. 세포는 지금 감염을 위한 준비가 되었습니다.

3. P. 아루기노사에 의한 감염

참고: 여기에서 다음 단계는 모두 생물 안전 수준 2(BSL2) 실험실에서 수행해야 합니다.

1. P. aeruginosa PAO1-GFP의 단일 식민지와 에렌 마이어 플라스크 (50 mL)에서 300 μg / mL 암피실린으로 보충 된 리소제니 국물의 접종 15 mL (LB).
   참고: P. aeruginosa의 그밖 긴장은 또한 그들의 자신의 재배 프로토콜에 따라, PAO1 야생 모형, PA14, 또는 임상 긴장과 같은 여기에서 사용될 수 있었습니다.
2. 37°C에서 18시간 동안 박테리아를 배양하고 180rpm에서 흔들어 보배합니다.
3. 18h 이후의 내용을 50mL 원물 튜브로 옮기고 원심분리기는 3850 x g에서 5분 동안 전송합니다. 상체를 버리고 37 °C에서 멸균 PBS 10mL를 추가하십시오.
4. 파장 600 nm에서 분광계에 대한 광학 밀도를 측정하고 세포 배양 배지를 사용하여 박테리아의 농도를 2 x 10⁵ CFU/mL의 최종 농도로 조절한다. 이것은 상피 세포 당 1개의 박테리아의 감염 (MOI)의 복합성에 해당합니다.
5. 1시간 동안 5%_CO2 하에서 37°C에서 투과성 지지체(step 2.4.)의 정립측에 세균현탁액 100μL을 첨가하여 박테리아가 세포에 부착되도록 한다. 그런 다음 파이펫으로 정액액체를 조심스럽게 제거하여 ALI 조건을 복원합니다. 일부 샘플을 대조군으로 감염되지 않도록 유지합니다.
   참고: 이 단계에서 부착된 박테리아는 초기 박테리아 접종을 결정하기 위해 LB 한천(단계 5.4/5.5 참조)에서 도금되어야 합니다.
6. 세포내 세균성 유착 후 관심 있는 약물을 배양한다. 치료 실험의 경우, 세포 배지에서 희석된 약물 용액의 500 μL을 추가(이 프로토콜에서 토브라마이신 6 μg/mL사용)을 apical 측에 추가한다. 바소포측에 약물없이 세포 배지 1,500 μL을 추가합니다.
   참고: 약물을 용액으로 주입하는 대신 에어로졸 증착에도 적용할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, ALI의 세포는 세포 배지의 500 μL을 가진 바소포측으로부터 공급된다. 약물은 다음 먼저 분수 및 적절한 장치에 의해 정류 구획에 입금 할 수 있습니다 (여기에 설명되지 않음). 감염된 처리된 견본은 섹션 4-7에 설명된 끝점을 검사할 수 있습니다. 이 단계에서 투과성 지지체는 이미지(섹션 4)를 만들거나 박테리아 성장과 포유류 세포 생존가능성의 결과를 얻기 위해 사용될 수 있다(섹션 5-7).

4. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 대한 샘플 준비

1. 공동 배양, 감염 및 약물 치료가 수립된 후, 모든 배지를 정문 및 바소측으로부터 제거한다. PBS로 1x를 37°C로 세척한 다음 3% 파라포름데히드(PFA)로 세포를 RT(바소포탈의 경우 apical/600 μL에서 300 μL)로 고정합니다. 세포 핵은 실온에서 30 분 동안 DAPI-PBS의 5 μg /mL로 염색됩니다.
   주의: PFA는 위험합니다.
2. 메스를 사용하여 멤브레인을 자르고 장착 매체를 사용하여 두 개의 12mm 현미경 커버 슬라이드 사이에 배치합니다(재료 표참조). 4 °C에서 보관하기 전에 30 분 동안 유동 벤치 내부를 건조시키십시오. 공초점 스캐닝 현미경 검사로 시각화합니다.
   참고: 공동 배양 후 및 장착 전에, 단단한 접합 면역 스테인닝을 수행 할 수 있습니다. 이를 위해, 세포는 30분 동안 파라포름알데히드3%로 고정되고, PBS로 다시 세척하고, PBS에서 사포닌 0.05%/BSA 1%로 투과화된다. 이 프로토콜에서, 조눌라 폐백 단백질(ZO-1)은 마우스 항인간 ZO-1 항체(1:400, 하룻밤 사이에 4°C에서 배양)를 통해 검출되었다. 샘플은 염소 항마우스 IgG 항체 알렉사 플루어 633 (빨간색 1:2000)와 RT에서 2 시간 동안 배양되었다. 핵은 DAPI (1 μg/mL)로 염색하고 커버립에 장착 매체로 장착되었습니다.
3. 저장된 멤브레인을 이미징하기 위해 공초점 현미경을 사용합니다. 검출을 위해 405, 488, 505 또는 633 nm에서 25x 또는 63x 수분 침수 목표 및 레이저를 선택합니다. 이미지에는 1024 x 1024 픽셀 해상도가 있어야 합니다.
   참고 : 레이저는 사용되는 얼룩에 따라 선택됩니다.
4. 어포형 및 단면 뷰를 획득하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 3차원 모델을 구성하기 위해 제타 스택 모드(10-15 스택)를 사용합니다.

5. 식민지 형성 단위 (CFU)를 통한 세균 증식 측정

1. 비 부착 된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 apical 및 바식측 배지 (박테리아 함유)를 수집합니다. 정압및 바소포측에서 500 μL을 수집하고 풀을 구부리라.
   참고: 이 현탁액을 직접 사용하여 박테리아(5.4단계) 또는 원심분리기를 10분 동안 21,250 x g에서 계산하여 슈퍼나티(섹션 6)에서 젖산 탈수소효소(LDH)를 평가하고/또는 PBS에서 다시 일시 중단하여 세포외 균(단계 5.4)을 계산합니다.
2. 투과성 지지체의 각 구획에 멸균 분멸 된 차가운 물의 500 μL을 추가하여 세포에 부착 및 / 또는 내측화 된 박테리아의 생존을 평가합니다. 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
   참고: 샘플은 LB 한천(5.4단계 참조) 또는 나중에 도금할 경우 -20°C에서 냉동(전체 삽입 플레이트 참조)에 도금될 수 있습니다.
3. 응신/내수화된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 샘플을 37°C에서 10분 동안 해동하십시오(냉동된 경우). 각 웰에 대한 파이펫 팁을 사용하여 멤브레인 표면과 파이펫을 위아래로 긁어 부착된 모든 콘텐츠를 제거합니다.
   참고: 이 단계에서, 모든 상피 세포는 용해되고 부착/내부화 된 박테리아는 도금될 현탁액으로 유효합니다.
4. 두 분수에서 세균 현탁액으로, PBS에서 Tween-80 0.05 %를 사용하여 1/10 직렬 희석을 수행하고 LB 천판에 박테리아를 플레이트.
   참고: 1에서 10 사이 의 희석을 권장 합니다. 박테리아는 단일 식민지가 처음 확인된 가장 높은 희석에서 계산되어야 합니다.
5. 16-72h의 30°C에서 한천 판을 배양하여 식민지를 계산하고 그에 따라 CFU를 계산합니다.
   참고: 플레이트 인큐베이션 시 30°C의 온도는 처리된 시료와 콜로니의 지연된 성장을 관찰하는 데 필수적입니다.

6. 젖산 탈수소 효소 분석기를 통한 세포 독성 평가

1. LDH^분석16에대한 세포 생존 가능성에 대한 박테리아(5.1단계로부터)를 함유하는 감염된 세포의 상체를 사용한다. 상심분리기는 박테리아와 결국 나머지 세포를 펠릿하기 위해 10 분 동안 21,250 x g에서 상피합니다. 박테리아가 없는 상체를 사용하여 LDH 방출을 측정합니다.
   참고: 이 분석으로 LDH를 측정하기 전에 상체를 동결해서는 안 됩니다.
2. 상체의 100 μL을 96웰 플레이트로 옮기고 LDH 분석 용액의 100 μL을 추가합니다(재료 표참조). 어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 배양 한 다음 492 nm에서 흡광도를 읽습니다.

7. 인간 사이토카인의 방출 평가

1. 사이토카인 정량화의 경우 ELISA 또는 세포 측정 비드 어레이 면역^{분석17(재료} 표 참조)을 사용하십시오. 이를 위해 원심분리기 는 5.1 단계에서 21,250 x g에서 10분 동안 즉시 측정하거나 분석전까지 최대 15일 동안 -80°C를 저장합니다.
2. 상용 ELISA 키트로 수퍼네이츠를 평가합니다.
   참고: 이 절차는 포획 항체를 가진 플레이트의 코팅, 시료(100 μL) 및 사이토카인 표준의 추가, 인큐베이션, 세척 및 검출 항체의 첨가를 포함하는 제조 지침을 따르며 사이토카인의 존재에 대한 색측정을 제공한다. 또는, 유동 세포측정은 시판되는 키트를 통해 사이토카인을 측정하는 데 사용될 수 있다(재료표참조).

결과

도 1A는 투과성 지지의 정맥 및 바소포측에서 24시간 동안 모두 성장한 후 인간 기관지 상피 세포 및 대식세포의 결과공동배양체의 형태를 각각 나타낸다. 상피 장벽 무결성은 단단한 접합 단백질 ZO-1(도 1B)에대한 면역 염색에 의해 더 높은 TEER (834 Ω × cm²⁾및 CLSM에 의해 표시됩니다. 감염되지 않은 CFBE41o의 장벽 무결성 측면에서 관찰된 동일한

토론

본 논문은 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및 인간 단핵세포세포주 THP-1에 의해 구성된 감염된 기도의 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 약물 효능 및 숙주 반응을 동시에 테스트할 때 중요한 매개 변수인 상피 장벽 무결성, 대식세포 변형, 박테리아 생존 및 염증의 평가를 허용합니다. 모델의 참신은 급성 세균 감염(즉, Aeruginosa)을가진 상피 세포(즉, 인...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754