비보에서 확장 된 심근병증의 독소루비신 유도 뮤린 모델

요약

설명된 것은 독소루비신의 장기 내류 주사를 통해 마우스에서 독소루비신 유도된 확장된 심근병증(DCM) 모델을 확립하는 프로토콜이다.

초록

팽창된 심근병증(DCM)은 고혈압, 용기, 선천성 또는 허혈성 심장 질환이 없는 경우 심실 팽창 및 우울한 심장 성능을 특징으로 하는 이질성 심근 장애의 스펙트럼을 말하며, 감염, 자가면역 또는 대사 이상 또는 가족 상속과 관련이 있을 수 있다. 그것은 가난한 예후와 혼잡 한 심부전으로 진행 될 수 있습니다. 독소루비신(Dox)은 화학요법 치료제로 널리 사용되고 있지만, 심근의 DCM과 같은 변화를 일으키기 때문에 그 사용은 제한적이다. 심근 독성은 산화 스트레스, 만성 염증 및 심근 세포 세포 세포증에 기인합니다. 이러한 독스 유도 DCM 증상을 악용하는 DCM의 모델이 확립되지 않았습니다.

서문

심장 마비의 가장 흔한 원인 중 하나 인 DCM은 심실 팽창 및 심장 기능 감소를 특징으로하며 전 세계적으로 심장 이식의 가장 일반적인 이유입니다^1. 그것의 병인을 더 조사하고 효과적인 처리를 찾아기 위하여는, 성숙한 동물 모형에 접근은 특히 중요합니다. 설명된 실험의 목적은 인간 DCM과 유사한 DCM의 안정적인 마우스 모델을 확립하는 것이다.

DCM의 복잡한 병인으로 인해 해당 동물 모델을 만드는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 자발적인 DCM 모델^2는 비교적 안정적이지만 비용이 많이 들고 쉽게 사용할 수 없습니다. 유전자 변형 된 동물 모델³ 잘 설립되지 않고 더 많은 실험적 사용이 필요합니다. 바이러스 감염⁴ 또는 자가 면역 결함^5에 의해 유도된 DCM 동물 모델은 쉽게 얻을 수 있지만, DCM을 전적으로 대표하지는 않는다. 심근 독성과 관련된 모델은 알코올 유도 DCM 모델 과 독스 유도 DCM 동물 모델을 포함한다.

독스 유도 심근병증 모델은 Dox^6의회대 내 주입에 의해 얻어진다. 이 모델은 Dox의 가장 심각한 만성 부작용을 악용합니다: Dox 노출 후 환자는 임상 균일성^7을가진 늦은 발병 DCM 증상을 개발한다. 독스 유도 산화 스트레스⁸ 및 미토콘드리아 손상^9,심근 세포 세포 세포증으로 이어지는, DCM의 병인에 있는 증상이다. 급성 및 만성 독스 치료 모델이 있습니다: 독스(15 mg/kg)의 단일 고용량은 심근병증^10에대한 단기 모델을 유도하고, 반복적인 저용량 Dox 주사(주간 6회, 3 mg/kg)는 심근병증에 대한 장기 모델을 유도한다^11. 제시된 연구에 기초하여, 야생형 마우스는 치료 종료시까지 DCM의 특성과 일치하는 심장의 5 mg/kg 디스플레이 형태 및 조직학으로 한 달에 한 번 주 1회 주입하여 DCM 모델을 확립하는 이상적인 방법을 제공한다.

프로토콜

동물 실험은 난징 드럼 타워 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 시약 및 동물의 준비

1. 독소루비신 염산염(화이자, 미국)을 살균된 물에 용해합니다. 소용돌이는 1 mg / mL의 독스 용액을 얻고 4 ° C에서 유지합니다.
2. C57BL/6 마우스를 사용 하 여 (8-10 주 오래 된; 25-30 g 무게). 이 연구를 위해, 마우스는 난징 대학의 모형 동물 연구 센터에서 구입하고 난징 드럼 타워 병원의 동물방에 보관되었습니다.
3. 병원체가 없는 마우스 케이지는 23°C의 일정한 온도에서 12h 빛/어두운 주기 하에서 유지되었다. 모든 동물은 정상적인 차우 다이어트에 공급되었고 음식과 물 광고 리비툼을 얻었습니다.

2. DCM 동물 모델 설립

1. 마우스를 정상(n = 5) 그룹과 Dox(n= 5) 그룹으로 무작위화한다.
2. Dox 그룹에 대해 일주일에 1mL 살균 주사기를 사용하여 5 mg/kg의 용량으로 Dox 용액을 주체로 관리하십시오. 동일한 양의 식염수 용액으로 대조군 마우스를 동일한 방식으로 치료합니다.
3. 매주 두 그룹의 체중을 측정합니다. 이에 따라, 총 4주 동안 체중에 따라 주출량을 조절하고, 누적 투여량은 20mg/kg(그림1)이다.
   참고: 4주에서 심초음파가 두 그룹 간의 심장 기능에 상당한 차이를 보였기 때문에 4주의 기간이 선택되었다.

3. 심초음파 검사

1. 넷째 주 말에, 마우스의 심초음파 검사를 실시합니다.
2. 2%의 이소플루란으로 마우스를 마취시다. 마우스가 이빨이 있는 트위저로 피부 의 꼬집에 반응하지 않거나 발가락과 꼬리를 자극하지 않으면 프로토콜을 계속하십시오.
3. 동물 취급 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 마취를 유지하기 위해 동물의 코와 입을 코 콘으로 덮고 2 % 이소플루란을 전달하십시오.
   참고: IP 마취의 경우 0.2 mL/20 g의 용량으로 4% 염산 수분을 주입하십시오.
4. 전기 면도기로 가슴 털을 조심스럽게 제거합니다. 트랜스토라시 코름카이그래피를 사용하여 생체 내 심장 기능을 평가합니다.
5. 233Hz의 프레임 속도로 파라스테탈 긴축 및 단축 뷰 모두에서 LV 심초음파를 수행합니다.
6. M 모드 추적에서 평균 LV 종자 수축기 직경(LVIDd), LV 엔드 다이확장지름(LVID), 심실 중격 두께(IVS), LV 후방 벽 두께(LVPW)를 3-5심장 박동에서 측정합니다. 또한 에코카르디그래피를 기반으로 배출 분획(EF) 및 분수 단축(FS)을 계산합니다.

4. 조직학적 염색

1. 심초음파 분석 후, 염화칼륨 10%의 심폐실 주입으로 마우스를 희생한다.
2. 간과 폐가 창백해질 때까지 해부 후 약 30mL의 식염수로 심장을 퍼퓨즈하십시오.
3. 심장을 절제하고 혈액을 돌출하기 위해 인산염 완충액으로 철저히 씻으십시오.
4. 24 시간 동안 실온에서 심장을 4 % 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스가 냉각되고 고화되도록 파라핀 상자에 조직을 치료합니다.
5. 병리학적 염색을 위해 하트를 5 μm 두께의 슬라이스로 자른다.
6. 모세 근육을 포함하는 절개 를 해체하고 재수화합니다.
   1. 인큐베이션은 55°C에서 30분 동안 슬라이드를 합니다. 그런 다음, 자일렌 2x로 각각 2분 씩 배양; 각각 2분 동안 100% 에탄올 2배; 각각 2분 동안 95% 에탄올 2x; 80% 에탄올 2 분; 75% 에탄올 2 분; 및 50% 에탄올은 2분 동안.
7. 헤마톡시린과 에신(H&E)과 마슨의 얼룩을 사용한 얼룩.

결과

심장 기능
확장된 심근병증은 진보적인 심실 팽창 및 수축 기능 장애를 특징으로 합니다. 도 2는 두 그룹의 대표적인 심초음파 이미지를 나타낸다. 독스 처리된 마우스는 현저하게 감소된 좌심실 방출 분획 및 좌심실 분수단축(도 3A, B)을보였다. LV 직경은 또한 확장기와 수축기 상 모두에서 증가(도 3

토론

Dox는 임상^{실습(12)에}일반적으로 사용되는 비특이적 주기적인 항종양 화학요법 약물이다. 주요 부작용은 심근병증 및 후속^{심부전(13)을}특징으로 하는 심근독성이다. 근본적인 기계장치는 심근 지질 과산화의 손상, 심근 육종 망상 Ca²⁺-ATPase 활동의 억제 및 심근 국소 레닌-안지오텐신 시스템의 활성화를 포함하며, 그 결과 AT II 생산 및 세포내 칼슘 과부하<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB