제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

요약

여기에 설명된 제브라피쉬 배아를 활용하여 생체내에서 인간 암세포를 표적으로 하는 기능성 나노입자의 능력을 연구하는 방법이다. 이 방법을 통해 대규모 동물 및 임상 시험에서 향후 테스트를 위한 최적의 나노입자의 평가 및 선택을 가능하게 합니다.

초록

암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자를 개발하는 것은 나노의학 분야에 큰 관심을 가지고 있습니다. 생체 내 동물 모델은 나노 기술을 생체 의학 응용 분야에 연결하는 데 필요합니다. 마우스는 전임상 테스트를 위한 전통적인 동물 모델을 나타낸다; 그러나, 마우스는 각 어머니에게서 제한된 자손 때문에 오래 실험 주기를 유지하고 지키기 위하여 상대적으로 비쌉니다. 제브라피쉬는 암 연구를 포함한 발달 및 생물 의학 연구를 위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히, 그 광학 투명성과 급속한 발달로 인해, 제브라피쉬 배아는 암세포의 행동과 그들의 마이크로 환경과의 상호 작용의 생체 내 모니터링에 실시간으로 적합합니다. 이 방법은 투명한 캐스퍼 제브라피시 배아에서 인간 암세포와 기능성 나노입자를 순차적으로 도입하고 나노입자에 의한 암세포의 생체 인식 및 표적화를 실시간으로 모니터링하기 위해 개발되었다. 이 최적화된 프로토콜은 엽산기 그룹으로 기능화되는 형광으로 표지된 나노입자가 다른 형광크롬으로 표지된 전이성 인간 자궁경부 상피암세포를 구체적으로 인식하고 표적으로 삼을 수 있음을 보여준다. 인식 및 표적화 공정은 테스트된 나노입자의 30분 후 사출이 조기에 발생할 수 있다. 전체 실험은 성인 물고기의 몇 쌍의 번식을 필요로하고 완료하는 데 4 일 미만걸립니다. 더욱이, 제브라피시 배아는 기능적인 적응성 면역 계통이 부족하여 광범위한 인간 암세포를 이식할 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명된 프로토콜의 유용성은 포유류와 클리닉에서 향후 검사를 위해 각 특정 암 맥락에서 최적의 나노 입자의 선택을 용이하게하는 다양한 유형의 인간 암세포에 대한 나노 입자의 테스트를 가능하게 한다.

서문

암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자의 개발은 물리학자와 생물의학 연구자 모두에게 큰 관심사입니다. 나노의학의 출현은 리간드 및/또는 화학요법 약물^1,,2,,3을표적으로 하는 것과 같은 여러 나노입자의 개발로 이어졌다. 나노 입자의 추가 특성은 치료 응용 프로그램과 함께 고효율 및 정확도로 생물학적 사건을 감지하고 모니터링하면서 생물학적 시스템과의 상호 작용을 가능하게합니다. 금과 산화철 나노입자는 주로 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 이미징 응용 분야에서 각각 사용됩니다. 금과 산화철 나노입자의 효소 활동은 착색 분석법을 통해 암세포의 검출을 허용하지만, 형광 나노입자는 생체 내 이미징 응용 4에^{적합합니다.} 그 중에서도 초브라이트 형광 나노 입자는 입자가 적고 독성이 감소하여 암을 조기에 검출할 수 있기 때문에 특히 유용합니다^5.

이러한 장점에도 불구하고, 나노 입자는 적절한 나노 물질 및 합성 공정의 최적화를 위해 생체 내 동물 모델을 사용하여 실험을 필요로 한다. 또한 약물과 마찬가지로 나노 입자는 전임상 테스트를 위해 동물 모델에 의존하여 효능과 독성을 결정합니다. 가장 널리 사용되는 전임상 모델은 마우스로, 이는 상대적으로 높은 비용으로 유지보수가 오는 포유류입니다. 암 연구를 위해, 유전자 조작된 마우스 또는 이노이식 마우스는 전형적으로^6,7를7이용한다. 이 실험의 길이는 수시로 주에서 달에 걸쳐 있습니다. 특히, 암 전이 연구를 위해, 암세포는 꼬리 정맥 및 비장^8,,9,,10과 같은 위치에서 마우스의 순환 시스템에 직접 주입된다. 이 모형은 종양 세포가 멀리 있는 기관을 사치화하고 식민지화할 때 전이의 끝 단계를 나타냅니다. 더욱이, 가시성 문제로 인해, 마우스에 있는 종양 세포의 종양 세포 이동 및 나노 입자 표적을 감시하는 것은 특히 도전적입니다.

제브라피쉬(Daniorerio)는높은 균류, 저비용, 신속한 발달, 광학 투명성 및 유전적^{보존(11,,12)으로}인해 암 연구를 위한 강력한 척추동물 시스템이 되었다. 마우스 모델에 비해 zebrafish의 또 다른 장점은 물고기 계란 ex utero의 수정으로, 이는 배아가 그들의 발달 내내 감시될 수 있게 합니다. 배아 발달은 얼룩말에서 급속하고, 24 시간 이내에 후유증 (hpf), 척추 동물 바디 플레인은 이미^{형성했다 13.} 72 hpf에 의해, 계란은 초리온에서 부화되어 배아에서 튀김 단계로 전환됩니다. 특히^14개의제브라피쉬균의 투명성은 암세포의 이주와 살아있는 동물의 나노입자에 의한 인식과 표적화를 시각화할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. Casper 마지막으로, 제브라피쉬는 48hpf로 타고난 면역체계를 개발하며 적응형 면역체계가 뒤쳐지고 28일 후유분화^15일에만기능성으로 변한다. 이 시간 간격은 면역 거부를 경험하지 않고 제브라피시 배아로 인간 암세포의 각종 모형의 이식에 이상적입니다.

여기서 설명된 방법은 제브라피쉬의 투명성과 신속한 발달을 활용하여 생체내형 나노입자에 의한 인간 암세포의 인식 및 표적화를 입증하는 방법이다. 이 분석에서, 적색 형광 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 인간 자궁경부암세포(HeLa 세포)는 48hpf 배아의 생체내내혈관내로 주입되었다. 20-24 시간 후에, HeLa 세포는 이미 물고기 순환 계통을 통해 배아를 통해 퍼졌습니다. 명백한 전이를 가진 태아는 부유한 모세관 침대가 있는 눈 의 뒤에 나노 입자 용액의 ~0.5 nL로 마이크로인주사되었습니다. 이 기술을 사용하여, 초브라이트 형광 실리카 나노 입자는 20-30 분 사후 주입으로 빨리 HeLa 세포를 표적으로 할 수 있습니다. 그 단순성과 효과 로 인해, 제브라피쉬는 특정 암세포를 표적으로 하는 그들의 능력을 위해 다양한 나노 입자를 시험하는 강력한 생체 내 모형을 나타냅니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 프로토콜 #: PROTO201800543에 따라 보스턴 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 캐스퍼 제브라피쉬 배아 생성

1. 투명한 캐스퍼 제브라피시 배아를 생성하기 위해 자연 사육을 위해 적어도 3 개월 의 성인 캐스퍼 물고기를 선택하십시오.
2. 저녁에 물고기 물로 두 챔버 짝짓기 탱크를 채우고, 칸막이를 사용하여 상부 탱크를 분리하고, 한 마리의 수컷 물고기를 챔버의 한쪽에 놓고 한두 마리의 암컷 물고기를 챔버의 반대편에 놓고, 물고기를 하룻밤 사이에 분리하여 분리합니다.
3. 다음날 아침 8:00에 불이 켜지면 칸막이를 꺼냅니다. 인공 농축 식물을 추가하고 물 얕은 영역을 만들기 위해 상단 챔버를 약간 기울입니다. 물고기가 3-4 시간 동안 번식하도록 허용하십시오.
4. 물고기가 들어있는 짝짓기 탱크의 상단 챔버를 들어 올려 원래 탱크로 돌려보습니다.
5. 메쉬 그물을 통해 물을 부어 하단 챔버에있는 계란을 수집합니다. 계란을 멸균 페트리 접시에 접시 당 200 개 이상의 계란을 밀도로 옮기. 죽은 계란이나 수정되지 않은 계란을 제거하고 신선한 생선 물로 가득 찬 접시 2/3을 채웁니다.
   참고: 수정되고 건강한 계란은 반투명하고 둥글게 되어야 합니다. 흐리거나 흰색이거나 손상된 모든 계란은 제거해야 합니다. 어류는 어류 시설에서 어항에서 수산물을 얻습니다.
6. 하룻밤 사이에 28.5 °C에서 인큐베이터에서 배아를 배양합니다.
7. 다음날 아침 제브라피쉬 북^16에설명된 표준 프로토콜을 사용하여 배아를 표백하고 배아를 인큐베이터(선택적 단계)로 되돌려 놓습니다.
8. 오후에 인큐베이터에서 24 hpf 배아를 꺼내 pronase를 사용하여 배아를 비코로 보임하십시오.
   1. 페트리 접시의 배아에서 가능한 한 많은 생선 물을 제거하고 접시에 pronase 용액 (생선 물에 1 mg / mL)의 몇 방울을 추가합니다. 페트리 접시를 부드럽게 소용돌이치게 한다. chorions가 붕괴의 표시를 보여주면, 배아를 몇 번 위아래로 피펫하여 배아를 방출하기 위해 치오온을 분해합니다.
   2. 신선한 생선물을 페트리 접시에 즉시 넣고 대부분의 배아가 축에서 나오면 과정을 종료합니다. 물고기 물을 사용하여 배아를 3 배 더 헹구면 부동 치리온을 제거하십시오. 배아를 인큐베이터에 반환합니다.

2. 이식을 위한 인간 암세포의 준비

1. 인큐베이터 온도를 정확히 35.5°C로 설정합니다. 인큐베이터를 모니터링하여 인큐베이터 내부의 온도계를 사용하여 일관되고 안정적인 온도를 보장합니다.
2. 유리 병에 물고기 물 1 L을 자동 clave. 전기전도급 아가로즈 3g을 100mL의 오토클레이브 어수질에 추가하고 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 마이크로웨이브를 추가하여 3% 아가로즈 용액을 만듭니다.
   1. 뜨거운 아가로즈 용액을 페트리 접시에 붓고 3/4가 가득 차때까지 붓습니다. 아가로즈에 미세 주입 금형을 놓습니다. 금형이 페트리 접시의 바닥과 접촉하지 않고 아래에 거품이 형성되지 않았는지 확인합니다.
   2. 용액이 고화하고 플레이트에서 금형을 조심스럽게 제거할 수 있도록 합니다. 접시에 오토클레이브 생선 물로 채우고 접시를 4 °C로 보관하십시오. HeLa 세포를 수확하기 전에 35.5 °C 인큐베이터에서 아가로즈 플레이트와 생선 물을 미리 데우습니다.
3. 다음 설정을 사용하여 파이펫 풀러에 1.0mm O.D. x 0.78mm 보로실리케이트 유리 모세혈관을 당깁니다: 500에서 압력, 560에서 열, 100에서 당겨, 100에서 속도, 200에서 시간/지연. 에탄올 타월로 닦아 버린 큰 페트리 접시에 퍼티에 바늘을 보관하십시오.
   주의: 뽑은 바늘은 매우 날카롭고 깨지기 쉽습니다. 취급 시 주의하십시오.
4. MS222를 오토클레이브 어류 워터로 용해시켜 트리카인 메탄술포네이트(MS222, 4 mg/mL)의 스톡 솔루션을 준비합니다. 사용 하기 전에 소용돌이. 액수에서 MS222 스톡 용액 1:100을 희석(즉, 20mL의 어수질에 MS222 스톡 용액200μl을 추가하여 40 μg/mL의 최종 농도까지)를 첨가하여 다음 절차를 위해 배아를 마취한다.
5. 배양 hLabel HeLa 세포는 설명된 프로토콜을 사용하여 PLenti6.2_miRFP670 렌티바이러스로 변환하여^17을설명하였다. 수확 RFP + HeLa 세포 30 분-1 이식 전에 h.
   참고: 인간 HeLa 세포는 조직 배양 인큐베이터에서 최대 70%의 완전한 성장 배지(10% FBS를 갖는 DMEM 배지)에서 5%_CO2로보충하였다.
   1. 조직 배양 후드에 포부로 HeLa 세포 배지를 제거하십시오. 세포층을 멸균 PBS로 간략하게 헹구어 혈청의 모든 흔적을 제거합니다.
   2. 3.0 mL의 멸균 트립신-EDTA 용액을 T-75 플라스크에 넣고 세포를 37°C 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣고 효소 소화를 용이하게 합니다. 세포의 ~80 %가 일시 중단 될 때까지 현미경으로 플라스크를 관찰하십시오.
   3. 플라스크에 완전한 성장 배지의 6-8 mL을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 15mL 멸균 튜브로 수집합니다. 원심 분리기 135 x g에서 5 분 동안.
   4. 완전한 성장 배지의 3mL에서 슈퍼나탈을 흡인하고 HeLa 세포를 재중단한다. 위의 세탁 단계를 2배 반복합니다. 완전한 성장 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 현미경의 밑에 세포를 계산합니다.
   5. 세포를 다시 아래로 회전시키고, 상체를 제거하고, 5 x 10⁷ 세포/mL의 농도에서 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에서 세포를 재연한다. 물고기 시설로 운반 할 때 한 손에 튜브를 잡고 세포를 따뜻하게 유지합니다.
      참고: 배아를 주입하기 전이나 주입 하는 동안 35.5°C 인큐베이터 내부에 세포를 저장 하 여 항상 세포를 따뜻하게 유지 합니다.

3. 인간 암세포의 이식

1. 이식 전에 에탄올 수건을 사용하여 작업 영역을 청소하십시오(예: 가위, 핀셋, 플라스틱 파이펫, 면도날).
2. 플라스틱 파이펫을 사용하여 아가로즈 플레이트의 홈 내에서 배아를 정렬합니다. 전방이 앞으로 향하여 측면에 배아를 놓습니다.
   참고: 물고기물이 배아를 덮는지 확인하십시오. 암세포를 주입하지 않고 대조군으로 사용하기 위해 일부 배아를 따로 설정합니다.
3. 공기 소스와 마이크로 인젝터를 켭니다. 인큐베이터에서 HeLa 세포를 꺼내 P200 팁을 사용하여 세포를 위아래로 20-30배 위아래로 피펫합니다. 절단 끝이있는 젤 로딩 팁을 사용하여 즉시 바늘에 세포 혼합물의 3 μL을로드합니다. 조심스럽게 바늘의 날카로운 하단 끝쪽으로 팁을 삽입합니다. 필요한 경우 바늘을 흔들어 세포 혼합물이 바늘 아래로 이동하여 날카로운 끝을 채웁니다.
   1. 바늘을 바늘 홀더에 삽입합니다. 핀셋 한 켤레를 사용하여 바늘 끝을 조심스럽게 깨뜨게하십시오. 마이크로 인젝터의 압력과 시간 지속 시간을 조정하여 바늘 팁 내부의 모든 기포를 밀어 내립니다. 주사 액적의 크기가 ~1 nL일 때까지 압력 및 사출 지속 시간을 줄입니다.
   2. 주사판을 현미경 아래에 두어 바늘을 마주보고 있는 배아의 노른자 면을 갖는 적절한 위치에 놓습니다. 희석된 MS222 용액(40 μg/mL)의 5방울을 추가하여 배아를 마취한다.
   3. 인젝터를 배치하고 바늘이 각 배아의 각 배아의 각 각 배아의 각 각 성구멍을 만질 수 있도록 합니다.
4. 발 페달을 눌러 각성 구멍 아래 혈관 이면에 배아에 세포 혼합물을 주입한다.
5. 주입 판을 다음 배아로 이동하려면 지배적이지 않은 손을 사용합니다. 발 페달을 동시에 눌러 주입을 계속하면서 인젝터를 확장하고 철회하는 지배적 인 손을 사용합니다. 주입된 배아에 살균 물고기 물 몇 방울을 피펫. 접시에 있는 모든 배아의 주입이 완료되면, 멸균 생선물로 배아를 씻어멸균 페트리 접시에 넣고 즉시 35.5 °C 인큐베이터로 이동합니다.
6. 3 시간 후에 주입 된 배아를 검사하고 죽은 배아를 제거하십시오.
7. 살아있는 배아를 35.5°C 인큐베이터로 반환하고 HeLa 세포가 주입 부위에서 신체의 다른 부분으로 확산되도록 20-24 h에 대해 배양한다.
   참고: 배아는 세포가 28.5°C에서 잘 하지 않기 때문에 인간 암세포의 생존과 이주를 허용하기 위해 35.5°C 인큐베이터로 유지되며, 온도 물고기 배아는 일반적으로 배양된다.

4. 나노 입자 또는 차량의 주입

1. 다음날 아침 에 이식된 배아를 희석 된 MS222 용액 5 방울로 마취시킵니다. 이 배아를 죽일 것이기 때문에 너무 많은 MS222를 추가하지 마십시오. 형광 현미경으로 RFP + HeLa 세포의 꼬리 전이가있는 배아를 조심스럽게 집어 멸균 된 생선 물이있는 새로운 페트리 접시에 넣습니다.
2. 다음 설정을 사용하여 섹션 2에 이전에 설명된 바와 같이 주사 바늘을 만듭니다: 500에서 압력, 645에서 열, 60에서 당겨, 50에서 속도, 그리고 100에서 시간/지연.
3. 3.1-3.3 단계의 절차를 따라 배아 및 부하 차량(예: H₂O) 또는 나노입자 용액을 바늘에 정렬합니다.
4. 눈 뒤에 1 mg/mL 나노 입자 용액의 0.5 nL을 주입하고 단계 3.5-3.6(도 1B)에설명된 바와 같이 주사를 계속한다. 눈 뒤에이 위치는 모세 혈관으로 풍부, 나노 입자가 순환을 입력 할 수 있도록.
5. 유사한 절차에 따라, HeLa 세포가 이식된 태아로 나노입자를 중단하는 데 사용되었던 차량(예를 들어,_H2O)을 주입(예: 대조군)(도1A, C).
6. 35.5°C에서 모든 주입된 배아를 배양합니다.

5. 나노 입자 및 암세포의 이미징 및 추적

1. 0, 30, 60, 90, 120, 180 및 210 분 나노 입자의 후사 후 형광 현미경하에서 주입 된 배아를 검사하여 순환 및 암 세포 표적화의 정도를 모니터링합니다. 나노입자에 의한 암세포의 표적화는 테스트된 나노입자의 종류에 따라 30분 일찍 사후 주입을 관찰할 수 있다.
2. 파이펫 2-3 배아페트리 접시에 넣고 희석된 MS222 용액 5방울(40 μg/mL)을 추가하여 고정합니다. 배아가 수영을 중단하면 배아가 측면에 누워 있도록 대부분의 물을 제거하십시오.
3. 배아를 앞쪽으로 향하게 하고 한쪽 눈이 보이도록 배아를 정렬하기 위해 끝에 부착된 얇고 부드러운 브러시가 달린 파이펫을 사용합니다.
4. 전체 배율(2x)에서 적색, 파란색 및 밝은 필드 채널로 배아를 이미지하여 전체 배아를 캡처하고 더 높은 배율(6.4x)에서 반복하여 꼬리 영역을 캡처합니다. 나노 입자의 출혈을 피하기 위해 적색 채널 아래에 배아를 집중시킵니다.
   참고: 배아는 이미징 중에 이동해서는 안 됩니다. 모든 움직임은 흐릿한 이미지와 다른 채널의 이미지를 겹치지 못하게 합니다.
5. 이미징 직후 배아에 신선한 생선 물을 추가하고 인큐베이터에 반환합니다. 다른 시점에서 배아를 이미지하기 위해 5.2-5.4 단계를 반복합니다.

결과

그림 1의 프로토콜 회로도는 이 연구의 전반적인 절차를 보여줍니다. 투명한 캐스퍼 남성과 여성 성인 물고기는 배아를 생성하기 위해 사육되었다 (섹션 1). RFP+ HeLa 세포는 48hpf에서 제브라피시 배아의 각막 아래 혈관 으로 주입된 부위에 주입되었고, 비주입된 배아는 대조군(섹션 3)으로 주입되었다. 미세 주입경험이 있는 개인의 경우, 배아의 ...

토론

여기서 설명된 프로토콜은 나노입자가 전이성 인간 암세포를 인식하고 표적으로 하는 능력을 시험하기 위해 생체 내 시스템으로 제브라피쉬를 활용한다. 실험의 성공적인 실행에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, 배아는 48hpf에서 완전히 개발되어야 합니다. 배아의 올바른 발달 단계는 인간 적인 암세포의 이식을 견디고 살아남을 수 있게 합니다. 48 hpf 미만의 배아는 더 오래?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122