하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

요약

이 프로토콜은 점성 재료의 표준화되고 재현 가능한 혼합을 위한 포괄적인 자습서역할을 하며, 새로운 오픈 소스 자동화 기술이 있습니다. 새로 개발된 오픈 소스 워크스테이션 의 작동, 오픈 소스 프로토콜 디자이너의 사용, 재현 가능한 혼합물을 식별하기 위한 유효성 검사 및 검증에 대한 자세한 지침이 제공됩니다.

초록

점성 재료의 현재 혼합 단계는 주로 낮은 처리량 모드에서 수동으로 수행되는 반복적이고 시간이 많이 소요되는 작업에 의존합니다. 이러한 문제는 궁극적으로 연구 결과의 불복시 발생할 수 있는 워크플로우의 단점을 나타냅니다. 수동 기반 워크플로우는 생물 의학 응용 분야에 사용되는 하이드로겔과 같은 점성 물질의 발전과 광범위한 채택을 더욱 제한하고 있습니다. 이러한 과제는 표준화된 혼합 프로세스와 자동화된 워크플로우를 사용하여 재현성을 높여 이를 극복할 수 있습니다. 이 연구에서는 오픈 소스 프로토콜 디자이너를 사용하고, 오픈 소스 워크스테이션을 운영하고, 재현 가능한 혼합물을 식별하는 단계별 지침을 제시합니다. 특히 오픈 소스 프로토콜 디자이너는 실험 적인 매개 변수 선택을 통해 사용자를 안내하고 워크스테이션을 작동하도록 즉시 사용할 수 있는 프로토콜 코드를 생성합니다. 이 워크스테이션은 점성 재료의 파이펫팅에 최적화되어 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 점성 재료에 대한 양수 변위 파이펫 및 피펫 팁 끝에서 과도한 재료를 제거하는 옵션 팁 터치 도크를 통합하여 자동화되고 신뢰성이 높은 취급을 가능하게 합니다. 혼합물의 검증 및 검증은 오렌지 G의 빠르고 저렴한 흡광도 측정에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 80% (v/v) 글리세롤 혼합물, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)에 대한 희석 계열, 5%(w/v) GelMA 및 2% (w/v) 알기네이트의 이중 네트워크 하이드로겔을 획득하는 결과를 제시한다. 프로토콜 채택을 지원하는 문제 해결 가이드가 포함되어 있습니다. 설명된 워크플로우는 여러 점성 재료에 광범위하게 적용되어 자동화된 방식으로 사용자 정의 농도를 생성할 수 있습니다.

서문

재현성과 복제성은 과학적 작업^1,2,3,4에서 가장 중요합니다. 그러나, 최근 기록은 기초 과학에 있는 고충격 생물 의학 연구 뿐만 아니라 번역 연구에 있는 중요한 도전을 강조했습니다4,5,6,7. 불쌍하거나 편향된 연구 설계^6,8, 불충분한 통계 적 힘^3,9, ^{보고 표준 준수} 누락, 게시 압력 ⁶ 또는 사용 불가능한 방법 또는 소프트웨어 ^code6,9과 같이 돌이킬 수없는 결과에 기여하는 요인은 복잡하고 다양합니다. . 그 중에서도 실험 실행시 프로토콜과 인간의 실수에 대한 미묘한 변화는 불변성을 차지하는 추가 요소로 확인되었습니다⁴. 예를 들어 수동 파이펫 팅 작업은 개별 ^{내 및 개별} 간 부정확성을 ^{도입하고 사람의} 오류 ¹⁴의 확률을 증가시면 됩니다. 상업용 액체 취급 로봇은 이러한 단점을 극복할 수 있으며 액체 ^15,16,17에 대한 신뢰성을 높일 수 있지만 점성이 중요한 특성을 가진 재료의 자동 취급은 여전히 어렵습니다.

상업용 액체 처리 로봇은 일반적으로 에어 피스톤 또는 공기 변위 파이펫이라고도 하는 공기 쿠션 파이펫을 사용합니다. 시약과 피스톤은 디스펜싱 단계에서 수축하고 경각선 단계에서 확장되는 에어 쿠션으로 구분됩니다. 공기 쿠션 파이펫을 사용하여 점성 재료 '흐름'은 팁 안팎에서 천천히 유입되며, 저수지에서 파이펫을 조기에 철수하면 기포의 포부를 초래할 수 있습니다. 디스펜싱 작업 중에 점성 재료는 공기에 의해 강제 될 때 천천히 또는 전혀 '흐르다'내부 팁 벽에 필름을 둡니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 양성 변위 파이펫은 고체 피스톤을 사용하여 팁에서 점성 물질을 적극적으로 내다추기 위해 상업적으로 도입되었다. 이러한 양수 변위 파이펫은 점성 재료의 정확하고 신뢰할 수 있는 처리를 가능하게 하지만, 양수 변위 파이펫을 갖춘 자동화된 솔루션은 여전히 학술 실험실 설정에 너무 비싸므로 점성 재료가 있는 대부분의 워크플로우는 수동 파이펫팅 작업에만 의존합니다¹⁸.

일반적으로 점도는 유체의 흐름 저항으로 정의되며 점도 재료는 물의 점도가 큰 재료로 더욱 정의되고 있다(0.89 mPa·s 25°C). 생물 의학 응용 분야에서, 실험 설정은 종종 물보다 더 큰 점도와 여러 물질을 포함, 디메틸 설프산화물(DMSO; 1.99mPa/s 25°C), 글리세롤(208.1mPa·s 25°C~90% 글리세롤[v/v]), 트리톤 X-100(25°C),수분부폴리머, 하이드로겔, 수성포겔, 수성포겔 등 ²⁰. 하이드로겔은 세포 캡슐화, 약물 전달 및 소프트 액추에이터 ^19,20,21,22를 포함하여 다양한 용도에 사용되는 물리적 또는/화학 적 모드로 배열된 친성 폴리머 네트워크입니다. 하이드로겔의 점도는 폴리머 농도 및 분자량¹⁹에 따라 달라집니다. 생체 의학 응용 분야에 일상적으로 사용되는 하이드로겔은 1에서 1000 mPa 사이의 점도 값을 나타내며, 특정 하이드로겔 시스템은 최대 6 x ¹⁰⁷ mPa·s19,23,24의 값으로 보고되었습니다. 그러나 하이드로겔의 점도 측정은 측정 프로토콜 및 샘플 준비 측면에서 표준화되지 않으므로 다른 연구 간의 점도 값을 비교하기가 어렵습니다.

하이드로겔용으로 특별히 설계된 상용 자동화 솔루션은 누락되거나 비용이 많이 들기 때문에 하이드로겔의 현재 워크플로우는 수동 취급에 따라 달라집니다¹⁸. 하이드로겔의 파이펫팅을 위한 현재 수동 기반 워크플로우의 한계를 이해하려면 필수 처리 작업을 이해하는 것이 중요합니다¹⁸. 예를 들어, 새로운 하이드로겔 소재가 합성되면, 다양한 농도를 가진 원하는 농도 또는 희석 계열이 생성되어 신뢰할 수 있는 합성 프로토콜및 기계적 특성의 후속 분석과 교차 연결 특성을 식별합니다25,26,27,28 . 일반적으로, 주식 용액은 제조 또는 구입, 그리고 혼합물을 얻기 위해 희석 및 / 또는 다른 시약과 혼합. 혼합 작업은 대부분 웰 플레이트(또는 임의의 출력 형식)에서 직접 수행되지 않으며 일반적으로 마스터 믹스라고 하는 별도의 반응 튜브에서 수행됩니다. 이러한 준비 작업 동안, 점성 물질을 전송하고, 시약을 혼합하고, 혼합물을 출력 형식으로 전송하기 위해 다양한 심스피링 및 분배 단계가 필요합니다(예를 들어, 96 웰 플레이트). 이러한 작업은 많은 양의 인간 ^labor18, 긴 실험 시간을 필요로 하며 잠재적으로 부정확한 결과로 나타날 수 있는 인간의 실수의 확률을 증가시다. 또한 수동 처리는 상세한 특성화를 위해 다양한 파라미터 조합을 선별하기 위해 높은 샘플 번호를 효율적으로 준비하지 못하게 합니다. 수동 처리는 또한 약물 개발 중 유망한 화합물의 식별과 같은 고처리량 스크리닝 응용 프로그램에 대한 하이드로겔의 사용을 방해합니다. 현재 수동 기반 준비 단계는 수천 개의 약물로 구성된 약물 라이브러리를 검사하는 것이 불가능합니다. 이러한 이유로, 자동화된 솔루션은 효율적인 개발 프로세스를 제공하고 약물 선별 응용 프로그램을 위한 하이드로겔의 성공적인 번역을 가능하게 하는 데 필요합니다.

수동 기반 워크플로우에서 자동화된 프로세스로 이동하기 위해 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 모세관 피스톤 팁을 사용하는 기성품 양성 변위 파이펫 사용, 파이펫 팁 세척을 위한 옵션 팁 터치 도크 를 통해 점성 물질을 취급하기 위한 상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇을 최적화했습니다. 이 파이펫팅 로봇은 새로 개발된 오픈 소스 워크스테이션에 파이펫팅 모듈로 더욱 통합되었으며, 이 로봇은 즉시 설치할 수 있는 모듈^18,29로 구성되어 있습니다. 하드웨어 및 소프트웨어 파일을 포함한 개발된 워크스테이션에 대한 자세한 어셈블리 지침은 GitHub(https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) 및 제노도 리포지토리(https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757)에서 자유롭게 액세스할 수 있습니다. 하드웨어 개발 외에도 오픈 소스 프로토콜 설계 응용 프로그램이 프로그래밍되어 릴리스되어 매개 변수 선택 프로세스를 통해 사용자를 안내하고 즉시 사용할 수 있는 프로토콜 코드(https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp)를 생성합니다. 이 코드는 상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇뿐만 아니라 개발 된 오픈 소스 워크 스테이션에서 실행됩니다.

본 명세서에서 점성 물질에 대한 혼합 작업을 자동화하기 위해 오픈 소스 워크스테이션의 작동에 대한 포괄적인 튜토리얼이 제공됩니다(그림 1). 튜토리얼별 프로토콜 단계는 개발된 오픈 소스 워크스테이션뿐만 아니라 상업용 오픈 소스 파이펫팅 로봇을 통해 수행할 수 있다. 자체 개발한 오픈 소스 프로토콜 설계 애플리케이션, 글리세롤, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 및 알기네이트에 필요한 농도의 자동화된 혼합 및 준비에 의해 지원된다. 글리세롤은 잘 특성화되어 있기 때문에이 튜토리얼에서 선택되었습니다^30,31, 그것은 저렴하고 쉽게 사용할 수 있으며, 따라서, 일반적으로 자동화 된 파이펫 작업에 대한 점성 참조 재료로 사용된다. 생물 의학 응용 분야에 사용되는 하이드로겔의 예로, GelMA 및 알지네이트 하이드로겔 전구체 솔루션은 자동화된 혼합 실험에 적용되었습니다. GelMA는 세포 캡슐화 연구에 가장 일반적으로 사용되는 하이드로겔 중 하나를 제시^32,33, alginate는 이중 네트워크 하이드로겔을 제조 하는 능력을 입증 하기 위해이 연구에서 선택 되었다^34,35. 오렌지 G를 염료로 사용하여 분광계계¹⁶을 사용하여 혼합 결과를 검증하고 검증하기 위해 빠르고 저렴한 절차가 구현되었습니다.

상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇은 개발된 오픈 소스 워크스테이션(그림 2a)에 파이펫팅 모듈로 통합되어 있으며, 따라서 '파이펫팅 모듈'이라는 이름은 파이펫팅 로봇을 설명하기 위해 더 많이 사용된다. 설치된 하드웨어에 대한 자세한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어나무로 하며 오픈 소스 플랫폼의 일반 어셈블리에 대한 단계별 지침도 포함하는 제공된 리포지토리를 통해 사용할 수 있습니다. 파이펫팅 모듈에는 축 A(오른쪽)와 축 B(왼쪽)에 설치된 두 개의 파이펫(단일 또는 8채널 파이펫)이 장착될 수 있습니다(그림 2b). 파이펫팅 모듈은 미국 국립 표준 연구소/실험실 자동화 및 스크리닝 협회(ANSI/SLAS) 표준에 따라 10데크 용량을 제공하며, 다음과 같은 위치 위치는 갑판에 정의됩니다: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2(그림 2c). 하이드로겔 용액의 사진 유도 중합화를 시작하려면 별도의 크로스링커 모듈이 필요하며 워크스테이션에 추가되었습니다. 크로스링커 모듈에는 파장이 400nm인 LED가 장착되어 있으므로 가시광선 파장에서 흥분하는 물질은 리튬 페닐-2,4,6 트라이메틸벤조일포스파이네이트(LAP)^36,37과 같은 전류 시스템과 함께 사용될 수 있다. LED의 강도(mW/^cm2)는 프로토콜 설계 응용 프로그램에서 사용자가 상호 연결 동작³⁸을 연구할 수 있습니다. 워크스테이션에는 처리량 증가를 위한 스토리지 모듈도 포함됩니다. 그러나 이 모듈은 이 스터디 내에서 사용되지 않으므로 더 이상 설명되지 않습니다. 일반적으로, 샘플 오염을 피하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 파이펫팅 모듈을 작동하는 것이 좋습니다. 파이펫팅 모듈을 작동하는 주요 전력 회로는 대부분의 국가에서 저전압 응용 프로그램으로 간주되는 12 V 회로입니다. 모든 전기 부품은 전용 제어 상자에 기반을 두고 있어 사용자가 전기 위험의 근원과 접촉하지 못하게 합니다.

이러한 표준화된 혼합 프로토콜을 준수함으로써 연구자들은 점성뿐만 아니라 점성이 없는 재료에 대한 신뢰할 수 있는 혼합물을 자동화된 방식으로 달성할 수 있습니다. 오픈 소스 접근 방식을 통해 사용자는 혼합 시퀀스를 최적화하고 새로 개발된 프로토콜을 커뮤니티와 공유할 수 있습니다. 궁극적으로, 이러한 접근법은 여러 요인 간의 상호 의존성을 조사하기 위해 다중 파라미터 조합의 스크리닝을 용이하게 하고, 따라서, 생체 의학 응용을 위한 점성 물질의 신뢰할 수 있는 적용 및 개발을 가속화할 것이다.

프로토콜

참고: 프로토콜은 (1) 소프트웨어에 대한 소개와 (2) 필요한 설치 및 워크스테이션을 사용자에게 익숙해지기 위한 하드웨어 설정으로 시작합니다. (3) 재료 제제 및 (4) 프로토콜 디자이너 응용 프로그램의 사용에 대한 섹션에 따라, (5) 파이펫팅 모듈의 보정 및 (6) 자동화 된 프로토콜의 실행이 자세히 강조된다. 마지막으로(7) 흡광도 판독 및 데이터 분석을 포함한 검증 및 검증 절차가 설명됩니다. 개별 작업이 있는 일반 프로토콜 워크플로가 그림 1에 표시됩니다.

1. 소프트웨어 설정

참고: 이 섹션에는 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스(API)와 필요한 프로토콜 디자이너 응용 프로그램 및 교정 단자설치에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 다음 지침은 라즈베리 파이 (RPi) 단일 보드 컴퓨터에 대 한 작성; 그러나 또한 윈도우 8, 10 및 macOS 10.13+ 성공적으로 API 및 응용 프로그램과 함께 사용 되었습니다.

1. 컴퓨터 환경을 설정합니다.
   참고: ^Python39의 기본 사항, 라즈베리 ^Pi40,41을 설정하고 사용하는 방법, ^internet42에 연결하는 방법에 대해 잘 알고 있어야 합니다. 다음 튜토리얼 단계는 프로토콜 별 단계에 초점을 맞추고 라즈베리 파이의 사용에 대한 추가 정보는 온라인으로 사용할 수 있습니다⁴⁰.
   1. 작업 표시줄 또는 응용 프로그램 메뉴에서 터미널 창을 엽니다.
   2. 시스템의 패키지 목록을 업데이트합니다.
      sudo apt-get 업데이트
   3. 설치된 모든 패키지를 업그레이드합니다.
      sudo apt-get dist-upgrade
   4. 라즈베리 파이 를 다시 시작:
      스도 재부팅
   5. 설치된 파이썬 버전을 확인합니다.
      파이썬3 --버전
      파이썬 3.5 이상이 설치되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 최신 버전⁴³을 설치합니다.
   6. 파이썬 패키지 ^Index44와 파이썬 패키지를 게시 파이썬 핍설치:
      sudo apt-get 설치 python3-핍
   7. 종속성 설치:
      핍 설치 numpy
      파이썬 크기 조정 이미지 설치
      참고 : Windows를 사용하는 경우, 당신은 통해 윈도우 저주 패키지를 설치해야합니다 : 파이썬 - m 핍 설치 윈도우 저주
2. 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스(API)를 설치합니다.
   참고: API는 실험 프로토콜 스크립트를 작성하고 워크스테이션을 작동하도록 설계된 간단한 Python 프레임워크를 제공합니다. 생성된 프로토콜 코드를 성공적으로 실행하려면 다음 두 API가 필요합니다.
   1. 워크스테이션 API 설치:
      핍 설치 오픈 워크 스테이션
   2. 파이펫팅 모듈을 작동하려면 Opentrons API를 설치합니다.
      핍 설치 오픈트론 ==2.5.2
   3. API가 성공적으로 설치되었는지 확인합니다.
      파이썬3
      >>> 오픈워크스테이션 가져오기
      >>> 수입 오픈트론
      참고: API 및 프로토콜 디자인 응용 프로그램의 크기는 각각 2.2MB 및 1.2MB입니다. 제한된 디스크 공간(200MB)으로 사용할 때 설치 중에 문제가 발생하지 않았습니다. 그러나 디스크 공간 요구 사항은 운영 체제에 따라 다릅니다.
3. 파일 다운로드를 위한 디렉토리(교정 터미널, 프로토콜 설계 응용 프로그램 등)를 선택합니다.
   참고: 나중에 다른 곳에서 파일을 복사하여 붙여넣기할 수 있습니다.
4. GitHub 리포지토리에서 파일을 복제:
   git 클론 https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
   참고: 'git 클론' 명령 클론을 사용하면 모든 파일을 디렉토리에 저장하며, 이 때 터미널에서 열립니다. 리포지토리에는 어셈블리의 하드웨어 파일도 포함되어 있기 때문에 전체 리포지토리가 제시된 프로토콜을 실행하는 데 필요하지 않습니다. 실험을 복제하는 데 필요한 모든 파일은 보충 파일 로 사용할 수 있으며 GitHub 리포지토리에서는 "/예제/게시-JoVE"에서 사용할 수 있습니다.
5. 다운로드한 폴더를 엽니다. 전체 리포지토리를 다운로드한 경우 '게시-JoVE' 폴더를 통해 탐색합니다.
   CD 오픈워크스테이션/예제/출판-조브
   참고: 이 폴더에는 워크스테이션 작동 및 프로토콜 디자이너 응용 프로그램 및 교정 터미널의 사용에 필요한 파일이 포함되어 있습니다.

2. 하드웨어 설정

1. 작업스테이션을 생물학적 안전 캐비닛에 배치하여 시료 오염을 방지합니다.
2. 워크스테이션에 파이펫을 설치합니다.
   1. 실험 설정에 따라 파이펫 크기를 선택합니다. 일반적으로 흡인할 볼륨이 범위의 상한 끝에 있는 파이펫 크기를 취하십시오. 특정 설정(예: 2mL의 심스피링/디스펜싱)에 대해 1mL 이상의 부피와 혼합 작업이 필요한 경우, 1,000μL의 최대 매시링/분배 부피를 사용하여 M1000E를 선택하여 파이펫팅 단계를 최소화하고 시간을 절약하십시오.
      참고: 공기 변위 파이펫에 대한 자세한 지침은 온라인으로 확인할 수 있습니다⁴⁵. 개발된 파이펫팅 모듈은 다음과 같은 기성 양수 배변 파이펫을 통합할 수 있습니다: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-). 50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100-1,000 μL).
   2. M4 알렌 키를 사용하여 나사를 풀고 조입니다.
   3. 두 개의 파이펫 고정 플레이트(흰색 아크릴 플레이트)를 알루미늄 레일에 부착하고 M5 나사를 느슨하게 조입니다.
   4. 파이펫을 두 파이펫 고정 플레이트에 삽입하고 파이펫의 인체공학적 꼬리가 아크릴 장착 플레이트의 반대편에 놓여 있는지 확인합니다.
   5. 두 파이펫 고정 플레이트의 네 나사를 단단히 조입니다.
   6. 아크릴 장착 플레이트에 부착된 두 개의 사각형 고정 너트를 z축의 압출 슬롯에 넣고 나사를 조입니다.
      참고: 파이펫을 단단히 고정하여 작동 중에 움직임을 방지합니다.

3. 재료 준비

참고: 점성 물질(글리세롤, GelMA, alginate)은 본 연구에서 제시된 실험에 사용되며, 따라서 준비된 볼륨 및 처리 작업(예를 들어, 5mL 반응 튜브에 5mL의 스톡 용액을 추가)은 이러한 실험용 설정에 특별히 사용된다.

1. 젤라틴 메타크릴 (GelMA)
   참고: GelMA 기능화, 투석 및 lyophilization은 이 논문의 범위가 아니며, 단계별 프로토콜은 로스너 외.³³에서 사용할 수 있다. 프로토콜은 사내에서 준비하거나 상업적으로 구입할 수 있는 lyophilized GelMA를 사용하여 시작합니다.
   1. 방정식을 사용하여 원하는 최종 주식 농도(_cGelMA) 및 부피(_VGelMA)를 기준으로 필요한 질량을 계산합니다.
      _mGelMA = _cGelMA x _VGelMA
      참고 : VGelMA는 실험 설정에 따라 다르며 20-30 % 초과 재료를 준비하는 것이 좋습니다. 제시된 프로토콜은 주식 솔루션으로 20%(w/v) GelMA의 5mL로 시작합니다.
   2. 필요한 양의 lyophilized GelMA를 계량하고, 50 mL 반응 튜브에 추가하고 필요한 양의 인산염 완충식식염(PBS)을 추가합니다.
   3. GelMA를 하룻밤 동안 4°C에서 용매에 담그거나 수조에서 60°C로 가열하여 젤마를 섞는다.
      참고: 멸균 GelMA 용액은 적어도 6개월 동안 4°C에서 빛으로부터 보호받을 수 있습니다.
   4. GelMA의 5mL를 5mL 반응 튜브로 채웁니다.
2. 포토니티에이터: 리튬 페닐-2,4,6트리메틸벤졸벤졸포이산 (LAP)
   참고: LAP가 빛에 민감하기 때문에 객실 조명에 추가 노출을 피하십시오.
   1. 방정식을 사용하여 원하는 최종 재고 농도(_cLAP) 및 필요한 부피(VLAP)를 기준으로 필요한 LAP(_mLAP)의 질량을 계산합니다.
      _mLAP = _cLAP x _VLAP
      참고: 3% (w/v) 스톡 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다.
   2. 필요한 양의 LAP의 무게를 측정하고 15mL 반응 튜브에 추가하고 PBS를 추가합니다.
   3. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸서 사진으로 인한 분해를 방지합니다.
   4. 반응 튜브를 37°C에서 37°C로 2시간 또는 완전히 용해될 때까지 배치하여 LAP를 녹입니다.
   5. 5mL 튜브에 LAP 스톡 솔루션 1mL를 채우십시오.
3. 알기네이트
   1. 방정식을 사용하여 원하는 최종 재고 농도(_calginate) 및 부피(_Valginate)를 기준으로 필요한 양의 알기네이트(_malginate)를 계산합니다.
      잘_기네이트 = _calginate x _Valginate
      참고 : 발기네이트는 실험 설정에 따라 다르며 20-30 % 초과 재료를 준비하는 것이 좋습니다. 제시된 프로토콜은 주식 솔루션으로 4% (w/v) 알기네이트의 5mL로 시작합니다.
   2. 필요한 알기네이트 질량의 무게를 측정하고 50mL 반응 튜브에 추가하고 PBS를 추가합니다.
   3. 알긴산 믹스를 37°C의 수조에 넣고 4시간 동안 넣습니다.
      참고: 소용돌이 믹서의 사용은 용해 공정을 가속화할 뿐만 아니라 기포를 생성합니다. 용존 된 알기네이트는 적어도 6 개월 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
   4. 5mL 반응 튜브로 알게네이트 5mL를 채웁니다.
4. 5 mL 반응 튜브에 글리세롤 5 mL을 채웁니다.
5. 오렌지 G 솔루션
   1. 50 mL 반응 튜브에 오렌지 G의 10 mg / mL 재고 용액을 준비합니다.
      참고: 볼륨은 실험 횟수에 따라 다릅니다. 희석형에 따라 초순수, PBS 또는 적절한 희석제 시약으로 스톡 솔루션을 준비합니다. 제시된 실험에서, 초순수수는 GelMA 및 alginate희석을 위해 글리세롤과 PBS를 희석시키는 데 사용되었다. PBS는 GelMA 및 alginate용 희석제로 사용되었으며, 정제를 사용하여 준비하거나 기성품을 구입할 수 있다.
   2. 소용돌이에 의해 10 s에 대 한 혼합.
   3. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸서 사진으로 인한 분해를 방지합니다.
      참고: 스톡 솔루션은 주황색 G의 적절한 용해를 보장하기 위해 24시간 후에 사용할 수 있습니다.
   4. 50mL 반응 튜브의 1 mg/mL 작동 용액에 스톡 용액을 희석시.
   5. 실험 용 설정에 적합한 플라스크 / 튜브로 작업 솔루션을 전송합니다.
      참고: 제시된 실험의 경우 작업 용액을 5mL 튜브로 채워졌습니다. 오렌지 G 스톡 및 작업 용액은 4 °C에서 저장하고 준비 시 3 개월 이내에 사용할 수 있습니다.
   6. 5 mL 반응 튜브에 1 mg / mL 오렌지 G 작업 용액의 5 mL을 채웁니다.

4. 프로토콜 디자이너 응용 프로그램으로 프로토콜 코드 생성

참고: 4.2-4.7 단계의 지정된 매개 변수는 재료의 재고 농도및 최종 출력 농도를 제외하고 모든 수행 된 실험에 대해 동일합니다. 이러한 매개 변수는 표 1 에 요약되고, 다음에서 매개 변수는 5 % (w / v) GelMA, 2 % (w / v) alginate, 0.15 % (w / v) LAP 및 PBS를 희석제로 이중 네트워크 하이드로겔을 준비하는 데 사용됩니다.

1. '프로토콜디자인앱.html'을 실행하여 프로토콜 디자이너 응용 프로그램을 엽니다.
   참고: 앱 "ProtocolDesignApp.html"은 매개 변수 선택 프로세스를 통해 사용자를 안내하고 워크스테이션을 작동하도록 즉시 사용할 수 있는 프로토콜을 자동으로 생성합니다. 사용자 인터페이스는 일반적으로 사용되는 모든 인터넷 브라우저(예: 크롬, 파이어폭스, 사파리, 에지, 인터넷 익스플로러)에서 실행됩니다.
2. 설정 페이지에 프로토콜 이름(예: 이중 네트워크 하이드로겔)을 입력합니다.
3. 프로토콜 이름을 확인하고 다음 단계로 진행하려면 '계속'을 클릭합니다.
4. 드롭다운 메뉴와 다음 입력 매개 변수에서 '3x4 가열 블록'을 선택하여 입력 트레이를 정의합니다.
   1. 드롭다운 메뉴에서 '젤 1'을 선택하고, 'GelMA'라는 이름을 입력하고, 재고 농도 '20%'를 입력하고, '샘플 수'를 '3'로 설정하여 하나의 열을 채웁니다. 항목을 저장하려면 '+추가'를 클릭합니다.
   2. 드롭다운 메뉴에서 '젤 2'를 선택하고 이름을 입력합니다: 'Alginate', 주식 농도 '4%'를 입력하고, '샘플 수'를 '3'로 설정하여 하나의 열을 채웁니다. 항목을 저장하려면 '+추가'를 클릭합니다.
   3. 드롭다운 메뉴에서 '포토니티에이터'를 선택하고 이름을 입력합니다: 'LAP', 재고 농도 '3%'를 입력하고, '샘플 수'를 '3'로 설정하여 하나의 열을 채웁니다. 항목을 저장하려면 '+추가'를 클릭합니다.
   4. 드롭다운 메뉴에서 'Diluent 1'을 선택하고 이름을 입력합니다: 'PBS', '샘플 수'를 '3'로 설정하여 하나의 열을 채웁니다. 항목을 저장하려면 '+추가'를 클릭합니다.
      참고: 입력 트레이의 시각화가 자동으로 업데이트되고'+add'를 클릭하면 자동으로 업데이트됩니다. 트레이의 용량보다 더 많은 입력이 추가되면 사용자에게 '이 트레이에 대한 샘플이 너무 많다'는 경고가 사용자에게 표시됩니다.
5. '사진 교차 연결'을 확인하고 몇 초 만에 시간을 입력하여 교차 연결 매개 변수를 정의, '30', '2'와 강도 W / ^m2 .
6. 'CONTINUE'를 클릭하여 입력 설정을 완료합니다.
7. 잘 플레이트 유형에 대한 드롭다운 메뉴에서 '96 웰 플레이트'를 선택하여 출력 트레이 설정을 정의합니다.
8. 'Group1'을 클릭하여 샘플 그룹을 만들어 출력을 정의합니다.
   1. 각 입력에 대해 필드에 원하는 농도 및 샘플 볼륨을 입력하여 출력 컴포지션을 지정합니다: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0.15', 총 볼륨 = '60'.
   2. 고급 믹싱 프로토콜을 적용하려면 확인란을 선택합니다.
9. '표본수': '96'에 샘플 수를 입력하여 샘플 수를 지정합니다.
   참고: 샘플 트레이의 시각화가 자동으로 업데이트되고'+그룹 추가'를 클릭하면 자동으로 업데이트됩니다. 트레이의 용량보다 더 많은 샘플이 추가되면 사용자에게 '이 트레이에 대한 샘플이 너무 많다'는 경고가 사용자에게 표시됩니다.
10. '계속'을 클릭하여 출력 설정을 완료합니다.
    1. 데크 레이아웃에서 트레이 위치를 선택하고 그에 따라 플랫폼을 준비합니다.
    2. 필드 '슬롯 A1'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Empty_Cell'를 선택합니다.
    3. 필드 '슬롯 A2'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Trash_Cell'를 선택합니다.
    4. 필드 '슬롯 B1'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Tips_Cell_100 μL'을 선택합니다.
    5. 필드 '슬롯 B2'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Tips_Cell_1000 μL'을 선택합니다.
    6. 필드 '슬롯 C1'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Input_Cell'를 선택합니다.
    7. 필드 'SLOT C2'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Empty_Cell'를 선택합니다.
    8. 필드 '슬롯 D1'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Mixing_Cell'를 선택합니다.
    9. 필드 '슬롯 D2'에서 체크표시를 확인하고 드롭다운 메뉴에서 'Output_Cell'를 선택합니다.
    10. 첫 번째 파이펫(M100E)의 유형과 특성을 정의하고, 드롭다운 메뉴에서 '10-100μL 양성 변위'를 선택하고, 스피링 속도 = '600', 디스펜싱 속도 = '800'을 설정하여 '파이펫 레프트'를 선택합니다.
    11. 드롭다운 메뉴에서 '100-1000μL 양성 변위'를 선택하고, 스피링 속도 = '800', 디스펜싱 속도 = '1200'을 설정하여 두 번째 파이펫(M1000E)의 유형과 특성을 정의합니다.
11. '프로토콜 생성'을 클릭하여 설정을 확인하고 프로토콜 스크립트를 생성합니다.
    참고: 개발된 프로토콜 디자이너 앱은 새 프로토콜이 생성될 때마다 자동으로 새 폴더를 생성합니다. 이 실험에 필요한 모든 파일과 워크스테이션을 작동하는 데 필요한 모든 파일은 프로토콜 이름의 이름을 따서 명명된 이 폴더에 저장됩니다. 폴더는 문제를 일으키지 않고 다른 디렉터리로 복사할 수 있습니다.
12. 프로토콜을 실행하는 데 사용되기 때문에 인터페이스를 닫지 마십시오(단계 6.6.참조).

5. 파이펫팅 모듈의 교정

참고: 컨테이너(예: 음판, 팁 랙, 휴지통) 및 파이펫(예: M1000E)은 처음에 교정해야 합니다. 컨테이너 및/또는 파이펫 위치가 수정/변경된 경우 새 위치를 보정해야 합니다.

1. 프로토콜 폴더로 이동하여 터미널 윈드록스에서 파일 'calibrate.py'을 실행하여 교정 터미널을 엽니다(1.1.1 단계 참조)
   phython.calibrate.py
   참고: 'calibrate.py' 인터페이스는 데크 설정 및 파이펫의 보정을 통해 사용자를 안내합니다. 파일이 프로토콜 파일 및 모듈 파일과 동일한 폴더에 있는지 확인합니다. 4.10 단계에서 자동으로 생성됩니다.
2. 플런저스, y,z 무브먼트에 대한 운동 증분 선택 0.1mm용 '1' 0.1mm, '2'용 0.5mm, '3'용 1mm용 3mm, '4'for 5mm, '6용 20mm용 5' 20mm, '7', 80mm용 '8'
3. 파이펫을 보정합니다.
   1. 키보드 단축P 를 눌러 파이펫 크기를 선택합니다.
   2. 키보드 단축자 V 를 눌러 플런저 교정 모드로 들어갑니다.
      참고: 피펫 헤드의 증분 크기와 움직임 동작에 익숙해지려면 작은 증분(2, 5 및 10mm)으로 시작하는 것이 좋습니다.
   3. 양수 변위 파이펫에 대해 다음 플런저 위치를 보정: T-Top = 휴게소; B-Bottom = 플런저는 저항이 충족될 때까지 푸시됩니다. P-픽업 = 플런저는 피스톤 팁을 부착할 수 있는 위치로 푸시됩니다. E-배출 = 플런저는 연결된 팁이 배출될 때까지 푸시됩니다. 키보드의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 플런저 위치를 변경하고 키보드에서 S 를 사용하여 최종 위치를 저장합니다.
   4. 키보드 단축자 V를 눌러 파이펫 플런저 교정 모드를 그대로 둡니다.
4. 파이펫 팁을 기준으로 컨테이너 위치를 보정합니다.
   1. 키보드 단축자 P 를 눌러 파이펫 유형을 선택합니다. 팁이 선택한 파이펫에 연결되어 있는지 확인합니다.
   2. 키보드 바로 가기 C 를 눌러 컨테이너 유형을 선택합니다.
   3. 적절한 이동 증분을 선택하고 파이펫 팁을 다음 위치로 이동합니다. 웰 플레이트의 경우 하단의 'A1' 웰 위치로 보정합니다. 팁 랙의 경우 'A1' 위치로 보정합니다. 휴지통의 경우 팁이 휴지통에 배출될 수 있는 위치(점정의)를 선택합니다.
   4. 키보드 바로 가기 S 를 눌러 위치를 저장합니다.
   5. 선택한 파이펫 유형에 대해 'C'에 나열된 모든 컨테이너에 대해 5.3.1-5.3.3 단계를 반복합니다.
   6. 두 번째 파이펫 유형에 대해 5.3.1-5.3.5를 반복합니다.
   7. 교정 스크립트를 닫습니다.

6. 워크스테이션을 가진 프로토콜 실행

참고: 프로토콜 파일은 리포지토리를 통해 액세스할 수 있으며 보충 파일로도 사용할 수 있습니다.

1. 데크에 휴지통 용기, 팁 랙, 입력 트레이, 믹싱 트레이 및 출력(4.3 단계에서 정의)을 배치합니다.
2. 섹션 5에 정의된 대로 파이펫과 계측기 보정합니다.
3. 필요한 경우 온도 도크 ON을 전환하고 입력 및 믹싱 트레이의 온도를 선택합니다.
   참고: 이 튜토리얼의 실험은 글리세롤용 온도 조절 없이 40°C, GelMA 및 알기네이트 파이펫팅을 위한 37°C에서 수행하였다.
4. 선택한 설정에 따라 온도 도크의 알루미늄 블록에 입력 시약이 있는 위치 튜브.
5. 입력 시약이 원하는 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
   참고: 적절한 온도 분포를 보장하기 위해 GelMA 및 alginate에 30분의 인큐베이션 시간을 권장합니다.
6. 'RUN PYTHON 스크립트'를 클릭하여 프로토콜 파일 실행
   참고: 선택한 프로토콜은 이제 워크스테이션에서 실행됩니다. 함께 제공되는 비디오는 GelMA의 자동 혼합과 60 μL을 96 웰 플레이트로 분포시키는 것을 강조합니다.
7. '완료'가 표시되면 실행이 완료됩니다.

7. 검증 및 검증 프로세스

1. 워크스테이션에서 웰 플레이트를 제거하고 샘플이 있는 웰 플레이트를 분광광계로 운반합니다.
2. 450 nm에서 분광계로 흡광도를 읽으십시오. 결과를 비교하고 일관된 결과를 보장하기 위해 각 플레이트 2x를 읽습니다.
3. 흡광도 판독값을 내보내고 저장합니다.
4. 데이터 분석.
   참고: 실험 데이터는 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 분산(CV) 값의 평균, 표준 편차 및 계수를 평가하기 위해 제공된 템플릿에 개별적으로 처리하거나 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.
   1. '오픈워크스테이션/예제/출판-JoVE'에서 GitHub 리포지토리 내에서도 사용할 수 있는 보충 파일 'supplementary_template 분석.xlsx'을 엽니다.
   2. 흡수도 판독값을 '원시 데이터' 시트에 복사하고, 모든 셀 참조가 모든 테이블에 올바르게 정의되었는지 확인하고, '분석' 시트를 클릭하여 평균, 표준 편차 및 분산(CV) 값의 계수에 대한 정보를 확인합니다.
      참고: 웰 플레이트의 샘플 분포에 따라, 다음 사전 설정 평가 유형은 템플릿과 함께 사용할 수 있습니다: '균일' 유형은 모든 샘플이 동일한 컴포지션을 가질 때 사용되며, 다른 행의 샘플이 다른 조성물을 가질 때 '행별' 유형이 사용되며, 다른 열의 샘플이 다른 조성물을 가질 때 '열별' 유형이 사용되며, '열별' 유형이 사용되며, 샘플 위치가 사용자별일 때 '사용자 지정' 유형이 사용됩니다.

결과

이 자습서에서는 글리세롤(그림 3)과 LAP 및 알기네이트를 곁들인 GelMA(그림 4)를 가진 실험에 대한 결과를 제공합니다.

80%(v/v) 글리세롤 용액의 생성은 온도 조절(실온, 22°C) 및 팁 터치 없이(설정 1로 정의), 온도 제어(40°C) 및 팁 터치(40°C) 없이 또는 온도 제어(40°C) 및 팁 터치(3)를 가진 것으로 조사하였다. 이들 두 가지 온도 설정은 글리세롤의 점도가 22°C(139.5mPa·s)에서 40°C(46.6mPa·s)³⁰으로 가열될 때 거의 3배씩 감소하기 때문에 처리 차이를 평가하기 위해 선택되었다. 글리세롤의 85% (v/v) 스톡 용액은 최종 농도인 80%로 희석되고 96웰 플레이트(설정당 96개)로 균일하게 분포하였다. 각 물질의 분배를 혼합 튜브로 분배하는 것을 포함하는 실험 시간은, 각각의 혼합 작업 및 샘플 분포를 96 웰 플레이트로, 30분 42s였다. 희석 혼합물 간의 차이를 식별하기 위해, 초순수 수-글리세롤희석제로서-1 mg/mL 오렌지 G로 제조하였다. 흡광도 판독값은 온도 조절과 팁 터치의 통합이 혼합물(p < 0.0001)에 크게 영향을 미친다는 점을 강조합니다. 수행된 차이(ANOVA)의 수행된 양방향 분석 외에도 CV 값을 계산하여 상대표준 편차를 평가했습니다. 변형 계수는 평균과 관련하여 편차 정도를 식별하는 표준화된 지표를 설명하고 백분율로 표현됩니다. 샘플 수단이 특히 관심 지점이 아니라 측정 내의 가변성인 경우 변형 계수는 재현 가능한 혼합물⁴⁶을 식별하는 추가 통찰력을 제공합니다. 세 가지 설정을 이용한 이 실험에서 흡광도 값은 CV 값이 5.6%, 4.2%, 설정 1, 셋업 2 및 셋업 3의 CV 값이 각각 2.0%로 감소하여 온도 도크의 상당한 영향을 나타내고 팁 터치 기능이 신뢰할 수 있는 결과를 생성하는 것으로 나타났습니다(그림 3a-ii). 설정 3(표본 번호 #1 ~ 96웰 플레이트)에 대한 샘플 흡광도 값을 플로팅하면 실험 전반에 걸쳐 값이 증가하거나 감소하지 않으므로 흡광도 값에 대한 샘플 위치의 영향을 나타내지 않습니다(그림 3a-iii). 히트 맵을 사용하여 측정된 각 웰 플레이트의 데이터를 시각화하면 특정 행 또는 열또는 분배 작업 전반에 걸쳐 다양한 흡광도 값에 대한 이질성을 식별할 수 있는 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다. 세 개의 설정에 대한 시각화된 히트맵은 셋업 1에서 셋업 3(그림 3b)까지 전체 웰 플레이트에 걸쳐 이질성이 감소합니다. 마지막으로, 실시된 혼합의 복제성은 8개의 독립 실행(그림 3c-i,ii) 내에서 평가되었으며, 각 실행은 6분 57초였습니다. 단일 혼합 실행은 1.1%에서 2.6%의 낮은 CV 값을 보였으며 이는 개별 런에 대해 매우 신뢰할 수 있는 혼합 및 디스펜싱 작업을 나타냅니다. 8개의 런 모두의 흡광도 값은 CV 값을 3.3%로 산출하고 확립된 혼합 프로토콜의 재현성을 입증했습니다.

GelMA 희석 시리즈는 PBS를 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 및 0%(w/v)로 PBS로 20%(w/v) 스톡 솔루션을 희석하고 LAP를 0.15%(w/v)(그림 4a-i)의 일정한 농도로 추가하여 총 55분 12분으로 조정하였다. 실험 프로토콜 스크립트에 명시된 바와 같이, 하이드로겔은 400 nm에서 2.0 mW/^cm2의 강도로 30s를 교차했다. 혼합물 간의 차이를 평가하기 위해, PBS-는 GelMA 및 alginate에 대한 희석제로서 -1 mg/mL 오렌지 G.로 제조되었기 때문에, 한 혼합물 내의 샘플 과 직렬 희석 사이의 흡수도 차이는 분광광계로 확인되었다. 각 농도 단계의 측정 된 흡광도 값은 현저하게 상이하며 (p < 0.0001) 농도 단계 (n = 12 농도 단계 당)에 걸쳐 1.2 %와 3.4 % 사이의 매우 낮은 CV 값을 갖는다. 선형 회귀는 R² 값 0.9869(도 4a-ii)와 히트맵으로 높은 적합성을 입증하여 각 농도에 대한 균질 분포와 농도 간의 차이를 확인하였다(도 4a-iii). 4개의 시약의 자동 혼합은 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginate, 0.15% (w/v) LAP, 및 PBS를 희석제(setup 2) 및 (설정 3) 터치 팁(각 설정에 대해 96)과 동일한 교차 연결 파라미터(30^, 2.02)를 실시하였다. 4개의 재료를 분배하고, 혼합하고, 96웰 플레이트로 분배하는 데 32분 22초가 걸렸습니다. GelMA 및 alginate를 가진 모든 실험은 GelMA의 파이펫팅을 방지하는 열 겔화를 방지하기 위하여 37°C에서 실시되었습니다. 팁 터치 옵션을 사용하면 CV 값이 5.2%에서 3.4%로 감소했으며, 특히 팁에서 초과 재료를 제거하여 하부 지역의 이상값을 방지하였다(그림 4b-i). 설정 2 및 설정 3의 평균 값은 1.927 및 1.944이지만 변형 계수는 평균과 관련하여 감소하는 편차를 강조합니다. 96 웰 플레이트의 단일 행은 열 매핑 시각화를 사용하여 행 및/또는 열 차이를 감지할 수 있습니다(그림 4b-ii).

그림 1: 개별 작업을 갖춘 프로토콜 워크플로우입니다. 설명된 워크플로는 설정, 준비, 실행 및 분석으로 구분되는 7개의 작업으로 나뉩니다. 처음에는 소프트웨어(작업 1)와 하드웨어(작업 2)를 설정해야 합니다. 재질(task 3)과 프로토콜 스크립트(task 4)의 생성을 준비한 후, 파이펫팅 모듈은 파이펫 및 컨테이너 위치(task 5)를 정의하여 보정된다. 다음으로, 프로토콜 스크립트는 워크스테이션(task 6)에서 실행되고 혼합물의 유효성 검사 및 검증(작업 7)이 수행되어 혼합물을 평가한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 파이프 모듈의 오픈 소스 워크스테이션 및 데크 설정입니다. (a) 개발된 워크스테이션은 샘플이 서로 다른 모듈을 통해 전송되는 조립 라인 접근 방식에서 영감을 받았으며, 파이펫팅, 크로스링커, 스토리지, 전송 및 계산 모듈과 같은 모듈로 구성됩니다. (b) 파이펫팅 모듈의 데크는 실험 레이아웃(예: 음판 유형, 튜브 부피 등)에 따라 설정됩니다. 표시된 데크 설정은 제시된 실험에 사용되었으며 10-100 μL(M100E) 및 100-1,000 μL(M1000E), 모세관 피스톤(CP)이 있는 팁 랙(CP10000) 및 100μL(CP10000) 및 CPL(100,000)의 범위의 양양성 배피페로 구성됩니다. 입력 시약용 믹싱 트레이 및 입력 트레이. (c) 사용 가능한 데크 위치는 표시된 숫자로 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 글리세롤 혼합물의 자동 파이펫팅 에 대한 결과. (a) 유연한 워크스테이션 설계를 통해 세 가지 설정(i)을 평가하여 재현 가능한 결과를 위한 최적의 매개 변수를 식별할 수 있습니다. (ii) 재료의 팁 터치 및 가열의 첨가는 분산(CV) 값의 계수를 감소시키고 셋업 3에 대한 매우 재현 가능한 혼합물을 초래하였다. 각 실험은 96개의 샘플로 수행되었다. (iii) 단일 샘플 값의 플로팅은 파이펫팅 시퀀스에 영향을 미치지 않았다. (b) 각 설정의 실험 결과는 원시/열 차이, 모서리 또는 마스터 혼합물에 미치는 영향을 식별하기 위해 열 맵으로 시각화되었습니다. (c) 셋업 3의 재현성은 (i) 중앙값, 표준 편차, CV 값 및 (ii) 히트맵을 사용하여 8개의 독립 실행 내에서 분석되었다. 패널 a-ii (n = 96) 및 b-i (n = 12)의 데이터는 수단및 단일 데이터 포인트로 제시된다. 통계적 유의성은 분산(ANOVA)의 양방향 분석을 사용하여 0.0001< 0.0001로 정의되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 하이드로겔과 작업을 혼합한 결과. (a) 젤라틴 메타크릴(GelMA) 20% (w/v) 스톡 용액에서, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 및 0%(w/v)의 연속 희석은 96웰 플레이트(n=12)를 사용하여 하나의 실험 실행 내에서 생성되었다. (i) 분산(CV) 값의 계수는 준비된 농도 전반에 걸쳐 1.2%와 3.4% 사이였으며, (ii) 선형 회귀는 R² 값0.9869로 높은 적합을 보였다. (iii) 균질 희석제는 생성된 히트맵을 통해 시각적으로 확인되었다. (b) 더블 네트워크 하이드로겔은 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) 알기네이트, 팁 터치 없이 0.15% (w/v) LAP(i)로 생성되었으며, 400nmm2에서 2.0mW/^cm2 의 강도로 30s를 교차 연결하였다. 팁 터치의 통합으로 CV 값이 5.2%에서 3.4%로 감소했습니다. (ii,iii) 히트맵은 팁 터치를 사용하여 팁에서 과도한 재료를 제거할 때 편차를 줄입니다. 패널 a-i 및 b-i 의 데이터는 수단과 단일 데이터 요소가 표시됩니다. 통계적 유의성은 0.05< 0.05, *p < 0.001, +p < 0.0001로 정의하였다 분산(ANOVA)의 단방향 분석을 이용하여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 점성 생체 재료에 대한 파이펫 유형 차이 및 문제의 요약. (a) 시약과 피스톤은 디스펜싱 단계 동안 수축하고 경각 단계에서 확장되는 에어 쿠션으로 분리됩니다. 점성 물질을 흡입하고 분배할 때, 느린 '흐름'은 기포및 불규칙한 파이펫팅 동작과 같은 문제를 소개합니다. (b) 양극기 피펫은 팁 내부의 피스톤을 사용하여 점성 물질을 안정적으로 흡입하고 분배할 수 있게 합니다. (c) 고점성 물질의 파이프팅(예를 들어, 4% (w/v) 알기네이트)는 팁에 과잉 물질이 축적되어 실험 전반에 걸쳐 부정확성을 유발할 수 있다. (d) 간단한 팁 터치 트레이의 구현은 팁에 초과 된 재료를 제거하고 정확한 흡입 및 분배 볼륨을 초래한다. 팁 랙 용기에 놓인 웰 플레이트 뚜껑의 내부면을 이용하여 실현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

소재 #1 (재고 농도)	재료의 최종 농도 #1	소재 #2 (재고 농도)	재료의 최종 농도 #2	재료 #3 (재고 농도)	재료의 최종 농도 #3	딜루엔트 (오렌지 G 작업 솔루션)	혼합물의 최종 오렌지 G 농도	그림으로 표시
글리세롤 (85% (w/v))	80% (/v)					물 (1 mg / mL 오렌지 G)	0.059 mg/mL	그림 3a-c
겔마 (20% (w/v)	0% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	1 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	2% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.85 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	4% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.75 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	6% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.65 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	8% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.55 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	10% (/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.45 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	12% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.35 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	14% (/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)			PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.25 mg/mL	그림 4a
겔마 (20% (w/v)	5% (w/v)	알기네이트 (4% (w/v)	2% (w/v)	랩 (3% (/v))	0.15% (w/v)	PBS (1 mg/mL 오렌지 G)	0.2 mg/mL	그림 4b

표 1: 수행된 실험에 대한 매개 변수 개요입니다.

프로토콜 단계	문제	가능한 이유	용액
1.1	소프트웨어를 설치하거나 업데이트할 수 없습니다.	SD 카드의 디스크 공간이 부족함	SD 카드의 디스크 공간을 확인합니다. 필요한 경우 불필요한 품목, 빈 빈 빈 을 제거하거나 적절한 크기의 SD 카드를 사용
1.2	API를 설치할 수 없습니다.	설치에 대한 사용자 기능이 제한됩니다(루트 사용자 권한 없음)	지정된 명령 앞에 'sudo' 명령을 사용하여 관리자 권한을 얻습니다. 리눅스에서, 액세스의이 종류를 슈퍼 사용자로 알려져 있다.
3.1	GelMA의 문제	기능화, 투석 또는 용우화	Loessner 외.33에서 사용할 수 있는 문제 해결 목록을 포함한 자세한 단계별 프로토콜.
5.1 및 6.2	워크스테이션은 명령에 반응하지 않습니다.	연결 문제	모든 것을 돌리고 컴퓨터를 종료합니다. 전원 공급 장치를 10s로 끕합니다. 컴퓨터와 워크스테이션을 다시 켜고 전원을 공급할 수 있습니다.
5.1 및 6.2	워크스테이션은 명령에 반응하지 않습니다.	연결 문제	컴퓨터가 USB 연결을 인식하고 USB 포트가 올바르게 정의된지 확인합니다. 방화벽이 연결 프로세스를 방해하지 않는지 확인합니다(표 2 아래 링크 참조).
5.1 및 6.2	파일을 열 수 없습니다.	잘못된 디렉토리	디렉터(폴더 경로)를 확인하여 올바른 경로가 사용되고 있는지 확인합니다. 파일(예: interface.py)을 찾을 수 없는 경우 잘못된 경로가 사용중일 수 있습니다.
6.6.2	팁이 제대로 부착되지 않았거나 이동 중에 떨어지지 않습니다.	교정 문제	파이펫에 대한 교정 단계를 반복하고 모세관 피스톤이 파이펫과 제대로 연결되어 있는지 확인합니다.
6.6.2	팁이 제대로 부착되지 않았거나 이동 중에 떨어지지 않습니다.	첨부 파일 문제	파이펫은 파이펫 축에 제대로 연결되지 않고 이동 단계 중에 이동합니다. 나사를 단단히 조이서 이를 방지합니다.
6.6.2	팁은 재료 위에 땀을 흘리고 있습니다.	교정 문제	높이를 제대로 정의하려면 이 트레이 유형의 교정을 반복합니다.
6.6.2	팁은 재료 위에 땀을 흘리고 있습니다.	교정 문제	튜브에서 볼륨을 확인하고 볼륨이 프로토콜 디자이너 응용 프로그램에 정의된 볼륨과 동일한지 확인합니다.
6.6.2	움직임 중에 재료가 찍어	팁에 너무 많은 과잉 재료	팁 터치 도크 옵션을 추가; 선택적으로 팁 터치 시간도 늘릴 수 있습니다.
6.6.2	재질은 파이펫팅에 대해 단단하거나 점성이 너무 큽다.	물질의 열 반응 행동	열 반응 성 재료 특성을 확인하고 그에 따라 온도 도크의 가열 / 냉각 온도를 조정합니다.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

표 2: 확인된 문제, 가능한 이유 및 문제를 해결하는 솔루션이 있는 문제 해결 테이블.

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토론

점성 물질의 파이프팅, 특히 생체 의학 응용 을위한 하이드로겔19,20,21,33,47, 다양한 농도의 사용자 정의 농도 또는 희석 시리즈를 준비하는 많은 연구 실험실에서 일상적인 작업입니다. 반복적이고 실행이 다소 간단하지만 주로 낮은 샘플 처리량¹⁸로 수동으로 수행됩니다. 이 자습서에서는 점성 물질을 위해 특별히 설계된 오픈 소스 워크스테이션의 작동을 도입하여 원하는 농도의 재현 가능한 생성을 위해 점성 재료의 자동 혼합을 가능하게 합니다. 이 워크스테이션은 하이드로겔의 파이펫팅에 최적화되어 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 점성 재료의 양수 변위 파이펫 및 팁에서 과도한 재료를 제거하는 옵션 팁 터치 도크를 통합하여 자동화되고 신뢰성이 높은 취급을 가능하게 합니다. 파이펫팅 모듈은 표준화되고 자동화된 방식으로 점성 물질의 처리를 가능하게 하기 위해 특별히 최적화되었습니다. 에어 쿠션 파이펫(도 5a)과 비교하여, 양수 변위 파이펫(그림 5b)은 잔류 물질을 팁에 남기지 않고 점성 물질을 분배하여 정확한 흡입 및 분배 부피를 초래합니다. 옵션 팁 터치 도크는 팁(그림 5c,d)에서 과도한 샘플 재료를 제거하며 접착제 재료(예: 4%(w/v) 알기네이트에 유용합니다.

프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 하이드로겔을 위해 특별히 프로그래밍되었으며 서로 다른 농도와 최대 2개의 희석제를 가진 최대 4개의 시약을 희석할 수 있습니다. 사용자가 원하는 농도 또는 직렬 희석 단계만 선택하므로 최종 희석 계산에 오류가 발생할 위험이 이 응용 프로그램에서 방지됩니다. 필요한 지망생 및 분배 볼륨은 자동으로 계산되고, 별도의 문서 텍스트 파일에 저장한 다음 프로토콜 스크립트로 채워지게 됩니다. 이 프로토콜 설계 응용 프로그램은 사용자에게 모든 실험 매개 변수(예: 파이펫 팅 속도)를 완전히 제어할 수 있으며 중요한 매개 변수에 대한 내부 문서화를 보장합니다. 프로토콜 설계 앱은 저수지의 충진 수준을 고려하여(예: 음)를 고려하여 점성 재료에 불필요한 침지 방지를 위해 심스피링/디스펜싱 높이를 변화시합니다. 이 통합 기능은 팁의 외부 벽에 재료 축적을 방지하고, 따라서, 프로토콜 전반에 걸쳐 신뢰할 수있는 흡입 및 디스펜싱 작업을 보장합니다. 프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 하이드로겔 희석 단계를 위해 개발되었지만 오렌지 G 염료와 같은 비협화분액의 희석에도 사용할 수 있습니다. '/예제/게시-JoVE'에서 리포지토리를 통해 액세스할 수 있는 프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 프로토콜 섹션에 설명되어 비디오에서 강조 표시된 버전입니다. 이 버전은 업데이트되지 않습니다. 그러나 프로토콜 디자이너 응용 프로그램의 업데이트된 버전은 기본 리포지토리 페이지를 통해 사용할 수 있습니다. 교정 단말은 처음에 ^Sanderson48에 의해 개발되었으며 양수 변위 파이펫의 교정에 최적화되었습니다.

프로토콜 섹션 4에 설명된 바와 같이, 파이펫과 컨테이너는 처음에 보정되어야 합니다. 이 교정 프로세스는 이동 증분을 계산하는 데 사용되는 위치를 정의하고 저장하는 데 매우 중요합니다. 따라서 성공적인 프로토콜 실행은 잘못된 교정 지점이 팁이 컨테이너에 충돌할 수 있으므로 잘 정의된 교정 위치에 의존합니다. 파이펫의 플런저 위치를 수동으로 보정해야 하므로 파이펫팅 정확도와 정밀도는 수행된 교정에 크게 의존합니다. 이러한 교정 절차는 파이펫팅 모듈의 사용자 경험에 매우 의존하므로 적절한 교정 절차를 보장하기 위해 숙련 된 직원과의 교육을 처음부터 권장합니다. 파이펫팅 모듈의 수동 교정 외에도 파이펫 자체를 보정하여 정확한 파이펫팅을 보장해야 합니다. ISO 8655에 명시된 대로 수용 기준을 충족하기 위해 적어도 12개월마다 파이펫을 보정하는 것이 좋습니다. 내부적으로 파이펫 교정을 평가하기 위해 Stangegaard et ^al.16에서 설명한 바와 같이 유효성 검사 및 검증을 사용할 수 있습니다.

신뢰할 수 있는 데이터 집합의 생성을 위해 고품질의 시약으로 시작하는 것이 중요합니다. 이는 일괄 처리 대 일괄 처리 변형이 이 프로토콜 내에서 생성된 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 하이드로겔 처리 작업에 특히 중요합니다. 일괄 처리 대 배치 변화 외에도 소량 의 준비에 미묘한 변화가 속성 차이에 기여할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 전체 실험에 사용할 수 있는 더 큰 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.

검증 및 검증 절차는 신뢰할 수 있는 혼합물을 식별하기 위해 염료 사용에 의존합니다. 제시된 프로토콜은 Orange G의 적용을 설명하지만 일반 프로토콜 및 분석 워크플로는 형광 ^dyes49,50에 맞게 조정할 수도 있습니다. Orange G의 사용은 분광계의 기술적 요구 사항을 줄이고 빛에 노출 된 후 형광 염료의 표백을 방지하기 위해 취한 예방 조치를 제거합니다. 염료의 용해 동작 또는 클러스터 형성의 문제점은 실험 중에 제시된 물질로 관찰되지 않았지만 다른 물질과 함께 나타날 수 있다. 잠재적인 클러스터 형성 및, 따라서, 염료와 물질 사이의 상호 작용은 현미경으로 쉽게 검출될 수 있었습니다.

이 자습서에서 제시된 절차와 기술은 점성 재료의 현재 워크플로우에 자동화 기능을 추가하여 최소한의 인력으로 매우 신뢰할 수 있는 작업을 수행합니다. 제공된 문제 해결 테이블(표 2)에는 식별된 문제가 포함되어 있으며 문제를 해결하기 위한 솔루션뿐만 아니라 가능한 이유를 제시합니다. 제시된 워크스테이션은 천연(젤라틴, 겔란 껌, 마트리겔) 및 합성(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) [PEG], 플루론 F127, 루트롤 F127) 중합재료에 성공적으로 적용되어 자동화된 파이펫팅 작업을 위한 폴리머 소재이다. 특히, 오픈 소스 워크스테이션과 점성 물질용으로 설계된 오픈 소스 프로토콜 설계 응용 프로그램의 조합은 생물 의학 공학, 재료 과학 및 미생물학 분야에서 일하는 연구자에 매우 유용할 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 reaction tubes	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-959-53A
5 mL tubes	Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)	SCT-5ML	size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reaction tubes	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-432-22
70% w/w Ethanol	LabChem, Inc. (USA)	aja726-5Lpl
96-well plate	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)		https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginate	NovaMatrix	4200001	https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water
Gelatin methacryloyl (GelMA)	Synthetized in-house		detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich, Inc. (USA)	900889
M4 and M5 Allen key	OpenBuilds, inc. (USA)	179, 190	also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG	Fisher Scientific (USA)	O267-25	https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)	14190-144	alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Aluminium blocks for temperature dock	Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)	SB16	blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytical balance	Sartorius AG (Germany)	ED224S
Open source liquid handling robot: commercial product	Opentrons Laboratories, Inc. (USA)	OT-One S Pro	https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source liquid handling robot: open source hardware	Assembled in-house following an open source approach		hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positive displacement pipette: MicromanE	Gilson, Inc. (USA)	FD10006	depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH (Germany)	CLARIOstar
Tips: capillary pistons	Gilson, Inc. (USA)	F148180	depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191