자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

요약

신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

초록

게놈 전체 협회 연구가 많은 신경 질환의 이기종 유전 기초에 빛을 발산으로, 뇌 개발 및 기능에 특정 유전자의 기여를 연구 할 필요가 증가. 생생 마우스 라인이 매우 비용이 많이 들고 많은 새로운 질병 관련 유전자가 아직 상업적으로 이용 가능한 유전 라인을 가지고 있지 않기 때문에 특정 유전 조작의 역할을 연구하기 위하여 마우스 모형에 의지하는 것은 항상 가능하지 않습니다. 또한 마우스 선을 만드는 데 수년간의 개발 및 유효성 검사가 걸릴 수 있습니다. 자궁에서 전기 기공은 특정 유전 적 조작을 달성하기 위해 DNA 플라스미드를 개발해야만 하는 생체 내에서 세포 형 특정 방식으로 유전자 발현을 조작하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공한다. 자궁 전기화의 양자는 전두엽 피질 피라미드 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 유전자 전달 방법과 행동 접근법을 결합하면 전두엽 피질 네트워크의 기능과 청소년 및 성인 마우스의 사회적 행동에 대한 유전 조작의 효과를 연구 할 수 있습니다.

서문

게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 뇌 병리^1,2,3,4와관련된 새로운 후보 유전자의^발견을주도했다. 이러한 연구는 정신 분열증 (SCZ)과 같은 치명적인 신경 정신 장애를 이해하는 데 특히 도움이되었으며, 새로운 유전자의 조사는 새로운 연구 및 치료 개입 라인의 시작 점으로 사용되었습니다^5,6. SCZ에 대한 위험을 품고 있는 유전자는 산전 및 조기 산후 발달 중 전두엽 피질(PFC)에서 편향된 발현을 나타내며, 이는 여러 신경정신장애의 병리학에 연루된^{영역(7)이다.} 또한, 정신 장애의 마우스 모델은 PFC 네트워크^6,8,9에서비정상적인^활성을나타낸다. 이 결과는 SZC 관련 유전자가 이 지역의 발달 배선에 있는 역할을 할 지도 모른다는 것을 건의합니다. 동물 모델을 이용한 추가 조사는 PFC에 있는 연결의 설치에 이 후보 유전자의 기여를 이해하고 이 유전자가 신경 정신병 장애의 병인에 있는 원인 역할이 있는지 결정하기 위하여 요구됩니다. 산전 및 조기 산후 발달 중 특정 뉴런 회로에 대한 유전자 발현 변화를 연구할 수 있는 마우스의 유전자 조작 기술은 유전자 발현 변화를 PFC 기능 장애에 연결하는 분자 메커니즘을 이해하는 유망한 방법이다.

유전 마우스 라인은 뇌 발달과 기능에 특정 유전자의 영향을 연구하는 방법을 제공합니다. 그러나, 형질 전환 쥐에 의존하는 것은 신경 회로 개발에 특정 유전자의 효력을 검토하기 위하여 항상 상업적으로 이용 가능한 라인이 없기 때문에 제한될 수 있습니다. 또한 사용자 지정 마우스 라인을 개발하는 데 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 형질전환 마우스와 바이러스 접근법을 결합한 교차 유전자 조작 전략의 사용은 뇌^10,11,12의 이해에 혁명을^{일으켰습니다.} 많은 진보에도 불구하고, 바이러스 전략은 바이러스^{발현(13)과} 바이러스 발현(14)과 관련된 세포 독성을제한할 수 있는 포장 용량의 한계를 포함하여 바이러스 벡터 유형에 따라 일정한 한계를 가지고 있다. 더욱이, 대부분의 실험 조건에서, 아데노 관련 바이러스를 이용한 강력한 유전자 발현(AAV)은 약 2~4주^15일이필요하며, 조기 산후 발달 시 유전자를 조작할 수 없는 일상적인 바이러스 전략을 만드는 것이다.

자궁 전기기화(IUE)에서 신속하고 저렴한 유전자 전달을 허용하는 대체 접근법은^형광 라벨링 및 약리유전학 적 또는 광유전학적 접근법과 결합될 때, 뉴런 회로의 기능을 해부하는 강력한 플랫폼을 제공한다. 또한, CRISPR-Cas9 게놈 편집 유전자의 발달과 함께 특정 유전자의 세포형 특이적 노크다운 또는 노크아웃을 통해 또는^{프로모터(18,19)의}변조를 통해 과발성 또는 정확하게 변경될 수 있다. IUE를 이용한 유전자 조작 접근법은 유전자가 좁은 발달^창(20)동안 시험될 필요가 있을 때 특히 유리하다. IUE는 다목적 기술이며 특정 프로모터 하에서 발현 벡터에 유전자를 삽입하여 쉽게 수행될 수 있다. 유전자 발현의 추가 제어는 상이한 강점의 프로모터를 이용하여 발현을 구동하거나 유전자^{발현(21,22)을}일시적으로 조절할 수 있는 유도성 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 추가적으로, IUE는 특정 피질 층, 세포 모형 및 두뇌 지구 내의 세포의 표적을 허용합니다, 다른 접근을 사용하여 항상 가능하지 는 않습니다^5,17. 보다 효율적인 전극 분포를 생성하는 3개의 전극의 사용에 기초한 IUE 구성의 최근 발전은 이 방법의 기능적 레퍼토리를 확대하고 과학자들이 새로운 세포 유형을 표적으로 하고^23,24를표적으로 할 수 있는 세포의 효율, 정확성 및 수를 증가시킬 수 있게 하였다. 이 기술은 최근 PFC 기능 및 초기 인식^5에서SCZ에 연결된 유전자인 보완 성분 4A(C4A)의 원인 역할을 결정하는 데 사용되었다.

여기에 제시된 유전자 전송 접근은 PFC를 포함하여 전두엽 피질에 있는 흥분성 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하는 유전자 전송 접근을 결합하는 실험 적인 파이프라인입니다, 세포 및 회로 수준 변경의 연구 결과를 가능하게 하는 행동 패러다임, 그러나 또한 초기 산후 발달 및 성인기에 걸쳐 행동을 감시할 수 있습니다. 먼저 설명된 방법은 정면 피질 영역에서 층(L) 2/3 피라미드 뉴런의 큰 집단을 양자간 횡단하는 방법이다. 다음으로, 청소년과 성인 마우스의 사회적 행동을 분석하는 작업이 설명되어 있습니다. 세포 수는 세포 형질의 범위와 위치를 정량화하기 위해 행동 작업이 완료되면 얻을 수 있습니다. 더욱이, 전형된 세포의 수는 행동 데이터와 상관관계가 있을 수 있고, 더 많은 수의 전과세포가 행동에 더 큰 혼란을 초래하는지 확인할 수 있다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 동물 연구를위한 국립 보건원 (NIH) 지침에 따라 수행되었으며 보스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. DNA 용액 준비

1. 바람직한 프로모터와 플라스미드로 관심 있는 유전자를 상업적 플라스미드 또는 서브클론을 구입하십시오. 여기서, CAG 프로모터(pCAG-EGFP)의 밑에 EGFP를 함유하는 플라스미드가 사용되었다.
   참고: 필요한 식 수준에 따라 원하는 프로모터를 결정합니다. 일반적으로 CAG 프로모터 의 밑에 플라스미드는 세포 모형 특정 프로모터 (예를 들면, 뉴런을 위한 시냅신)가 보다 적게 활성화되는 경향이 있는 반면, 트랜스진의 상부를 달성하기 위하여 이용될 수 있습니다. 실험자는 각 플라스미드에 대해 적절한 식 수준을 경험적으로 결정해야 합니다.
2. 박테리아를 변형 하 고 적절 한 항생제와 세균 성 매체에서 주식을 성장.
   1. -80°C에서 유능한 세포(DH5α 셀)를 제거하고 20분 동안 얼음 위에서 해동하십시오.
   2. 플라스미드 DNA의 100 pg-100 ng를 유능한 세포의 30 μL과 혼합합니다. 20 분 동안 얼음에 혼합물을 배양.
   3. 42°C 수조에서 45s의 수조를 배양한 다음 튜브를 얼음으로 다시 2분 동안 되돌려 주어 열 충격을 수행합니다.
   4. 변형된 유능한 세포에 200 -1,000 μL의 LB 미디어를 추가하고 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 자랍니다.
   5. 변형된 세포의 플레이트 200 μL은 적절한 항생제를 함유하는 LB 천판으로 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   6. 다음 날, 하룻밤 동안 흔들리는 인큐베이터에 37 °C에서 적절한 항생제로 LB 국물의 200 mL에 하나의 세균 식민지를 배양.
3. 맥시프레프 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.
   1. 획득한 맥시프레플 키트에 제공된 지침을 따르십시오. 용출 단계의 경우 용출 버퍼에 DNA를 엘로트하지 마십시오. 대신, 멸균 1x PBS 또는 분자 급수의 200 μL을 사용하여 DNA를 엘테.
   2. DNA의 최종 농도가 1 μg/μL보다 큰지 확인합니다. 관심 있는 유전자를 함유하는 플라스미드가 리포터 유전자를 포함하지 않는 경우, 또한 전관된 세포의 시각화를 허용하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 기자 분자와 공동 트랜스펙트를 플라스미드를 준비한다.
4. 플라스미드 DNA를 1x PBS로 희석하여 각 플라스미드의 1 μg/μL 최종 농도로 희석하여 수술용 DNA 용액을 준비한다. DNA 용액에 빠른 녹색 염료를 추가하여 최종 농도0.1%를 추가합니다. 양자 주사의 경우 댐 당 60 μL의 용액(약 10개의 새끼)을 준비하십시오.
   참고: 플라스미드가 리포터 유전자를 포함하지 않는 경우 GFP와 공동 전극합니다. 공동 전기화 속도는 전형적으로 95% 이상입니다. 우리의 손에, 형질 효율은 공동 형질에 의해 영향을받지 않았다. 모든 전기폴리플라스미드는 1μg/μL로 희석되어야 합니다.

2. 임신 중 시간 임신 한 마우스를 주문하거나 사육

1. 시간 제임신 마우스를 주문하는 경우, 배아의 날(E) 13 또는 그 이전에 마우스가 도착하여 댐이 동물 주택에 적응할 수 있는 충분한 시간을 허용하도록 명령한다.  이 프로토콜에서, CD-1 아웃레드 마우스는 모든 실험에 사용된다.
   참고: 며칠 전에 주문하면 동물의 스트레스를 줄이고 새끼의 생존율이 높아집니다.
2. 임신 시간 임신 한 마우스를 사육하는 경우, 하룻밤 남성과 여성 마우스를 쌍, 일주일에 한 번. 다음날 아침(E0.5)에 질 플러그의 존재를 확인합니다. 여성 마우스의 무게를 모니터링하여 임신을 결정합니다.
   참고 : 다른 마우스 균주는 임신을 통해 다른 체중 증가를 가지고, 그래서 사용되는 마우스 변형에 대한 전형적인 체중 증가를 결정합니다.
3. 마우스를 주문하거나 사육하든 댐의 스트레스를 줄이기 위해 케이지에 둥지 패드와 마우스 하우스를 배치하십시오. 스트레스를 감소하면 새끼의 생존율을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 3개의 갈래 전극의 설계 및 조립

1. 전극 접점용 재고 재료로 두께 0.063의 두께가 있는 2등급 티타늄 시트를 사용하십시오.
2. 표준 가공 기술 이나 정밀 한 손 도구를 사용 하 여 다음과 같은 치수와 전극을 확인: 20 mm x 5 mm 둥근 팁과 홈 백. 미세한 모래 사포를 사용하여 거친 가장자리 나 버를 제거하십시오.
3. 전극 접선을 와이어하려면 전극의 홈 주위에 22 G 좌초 구리 와이어를 감싸고 납땜하여 고정하십시오. 열 수축 튜브를 사용하여이 관절을 보호하십시오.
4. 그런 다음, 연결된 전극을 두 개의 음극을 만들기 위해 추가열 수축 튜브를 사용하여 자동 절충성 비 전도성 집게에 부착합니다. 단일 양극을 자동 실행 가능한 비전도성 재료(예: 헤드에서 톱질된 칫솔 손잡이)에 부착합니다. 표준 바나나 플러그로 와이어의 열린 끝에 맞습니다.

4. 수술 준비

1. 수술 전 최소 30분 전에 임신한 댐을 수술 부위로 가져와 동물 시설에서 수송한 후 스트레스 수준이 감소할 수 있도록 하십시오.
2. 살균 된 생식 기물 물티슈와 70 % 에탄올을 사용하여 전체 수술 부위를 살균하십시오. 수술을 시작하기 전에 장갑을 교체하십시오.
3. 유리 비드 멸균기에서 자동 사용 도구를 살균합니다.
4. 멸균 1x PBS(댐당 약 50mL)를 50mL 원물 튜브로 옮기고 38-40°C로 가열된 수조의 튜브 랙에 배치한다. 온도계로 멸균 식염수 온도를 확인하십시오.
5. 수술 시작 전에 37°C로 따뜻해지도록 물 가열 순환 펌프를 켭니다. 이것은 수술 기간 동안 마우스의 체온을 유지합니다.
6. 압력 인젝터와 전기 포레이터를 켜고 수술 전에 적절한 기능을 보장하십시오.
7. 테이블 위원심 분리기에서 플라스미드 DNA 용액(1.4단계에서 얻은)을 잠시 회전시키고 얼음 위에 놓습니다.
8. 피펫 풀러에 유리 파이펫을 당겨 당겨 당겨 유리 파이펫의 끝이 직경약 50 μm되도록합니다.
9. 20-40 μL의 DNA 용액으로 파이펫을 채웁니다(1.4단계에서 획득).
10. 모발 제거 로션, 요오드, 70% 에탄올, 면스왑, 눈 연고, 봉합사, 거즈 등 수술에 필요한 모든 아이템을 설정합니다.
11. 수술 시트를 준비하고 마우스 ID와 체중, 수술 일자, 외과 의사 이름 등과 같은 필요한 정보를 작성하십시오.

5. 자궁 전기 기공 수술에서

1. 수술 전에 마우스의 무게를 측정하고 수술 시트에이 주의하십시오.
2. 4% (v/v) 산소-이소플루란 혼합물로 유도 챔버에서 흡입하여 임신한 마우스(E16)를 마취한다. 마우스가 유도되면 마스크 흡입으로 이동하여 1-1.5 %(v /v)에서 이소플루란을 유지하고 수술 내내 호흡을 모니터링하십시오. 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인하면 호흡 속도는 분당 ~ 55-65 호흡이어야합니다.
3. 수술 전 진통제 관리: 부프레노르핀 (3.25 mg/kg; SC) 및 멜록시캠 (1-5 mg/kg; SC) 최대 부피 10-30 ml/kg.
4. 제모 크림을 사용하거나 면도기를 조심스럽게 사용하여 복부에서 털을 제거하십시오. 포비도오드와 70% 에탄올로 면봉하여 복부를 살균하고 적어도 3번 반복합니다. 멸균 거즈를 사용하여 복부 주위에 멸균 필드를 만들고 멸균 드레이핑도 사용할 수 있습니다.
5. 복부 피부에 중간 절개 (3-4cm)를 만들고 근육을 절단하지 않도록 집게로 피부를 들어 올립니다. 그런 다음 근육을 잘라, 다시 중요한 장기를 절단하지 않도록 근육을 들어 올리기 위해주의를 복용.
6. 조심스럽게 링 포셉을 사용하여 댐에서 자궁 뿔을 당기고 멸균 필드에 부드럽게 배치하여 자궁 뿔이 패딩으로 지원되고 댐에서 너무 멀리 당기지 않도록합니다. 이 시점부터, 자궁 뿔을 사전 따뜻하게 멸균 1x PBS로 수술의 나머지 기간 동안 촉촉하게 유지합니다.
7. 포셉이나 손가락을 사용하여 배아를 배치합니다. 머리의 수평 평면에 대하여 45도 각도로 당겨진 유리 파이펫을 조심스럽게 삽입하고 뇌와 눈의 중간선 사이에서 시각적으로 식별 될 수있는 측면 심실에 삽입합니다. 파이펫을 하나에 삽입한 다음 다른 심실(권장)에 삽입하거나 DNA 용액을 하나의 심실로 주입하여 두 측면 심실로 전달하여 각 측면 심실에 약 2-3 μL을 주입합니다. 주사 후 초승달 모양이 존재하는 경우 심실은 성공적으로 표적으로 삼았습니다.
   참고 : 유리 파이펫의 끝은 수술 중에 중단 될 수 있습니다. 이 경우, 새로운 파이펫을 준비하고 DNA 용액으로 채우는 동안 자궁 뿔이 촉촉하게 유지되도록 유리 파이펫을 교체하십시오.
8. 전두엽 피질에서 양측으로 세포를 이식하기 위해, 배아의 측면에 두 개의 음극을 측면 및 약간 caudal을 측면 심실에 배치하고 개발 주물 바로 앞에 눈 사이에 긍정적 인 전극을 배치합니다.
9. 배아가 아낌없이 촉촉하게 변하는지 확인하십시오. 4개의 정사각형 펄스(펄스 지속시간 = 50ms 지속 시간, 펄스 진폭 = 36 V, 대박 간격 = 500ms)를 적용합니다.
10. 모든 배아를 주입하고 전기화하여 각 배아가 DNA 용액 주입 직후에 전포되도록 하나씩 진행합니다. 일단 모든 배아가 전포되면 자궁 뿔을 복강으로 다시 삽입하십시오. 이 단계에서, 자궁 경적 배치를 돕기 위해 멸균 PBS (1x)에서 복강을 코팅.
11. 복합이 완료 된 후 공기 주머니가 남아 있지 않도록 멸균 1x PBS로 복강을 채웁니다. 흡수가능한 봉합사와 피부를 비흡수성 봉합사로 봉합합니다.
12. 댐이 가열된 챔버에서 최소 1시간 이상 완전히 회복되도록 허용합니다. 다음 48h에서 정기적으로 댐을 확인하십시오. 댐이 마취에서 회복되어 의식을 되찾으면서 움직이고 휘젓기 시작합니다.
13. 댐이 통증을 나타내는 경우 수술 후 진통제를 관리, 예를 들어 자신의 몸을 볼링과 빠르게 호흡등. SC 주사가 댐을 강조 할 수 있기 때문에 통증의 징후가있는 경우에만 관리, 하지만 실험 그룹에 투여하는 경우 또한 대조군에 투여, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지.

6. 모성 상호 작용 과제에서 초기 사회적 행동을 속이는 행위

참고: 이 프로토콜은 이전 간행물^5,25에서조정됩니다. 생쥐가 산후일(P) 18-21에서 태어난 후 이 작업을 수행한다.

1. 모성 상호 작용 I (MI1) 작업에서 모성 호밍 동작.
   1. 작업이 수행되기 전에 케이지 침구가 일주일 동안 변경되지 않았는지 확인합니다.
   2. 50 x 50 x 30cm(길이 높이)로 쉽게 청소할 수 있는 개방형 필드(OF) 필드를 구하거나 빌드합니다( 아크릴권장). 행동 성능 중 조명 조건은 실험적인 질문에 따라 달라질 수 있으며 흥분과 불안과 같은 행동의 수준에 영향을 미칠 수 있습니다. 경기장 중앙에 위치한 희미한 빛(약 20럭스)에서 행동 실험을 기록합니다.
   3. 행동 테스트 2일 전에 는 경기장 구석에 메쉬 와이어 컵(예: 연필 컵)을 하루에 5분 동안 배치하여 댐을 경기장에 배치합니다.
   4. P18-21에서 수 있는 시험 당일, 마우스가 짜기 전에, 살균 물티슈와 70% 에탄올로 경기장을 철저히 청소한다.
   5. 깨끗한 침구와 강아지의 홈 케이지에서 더러운 둥지 침구가 들어있는 한 모서리가 있는 두 개의 반대 모서리로 경기장을 설정합니다.
   6. 각 새끼가 경기장을 3분 동안 탐험할 수 있도록 하고, 각 새끼를 시작 시 중립의 빈 구석에 놓습니다.
      참고: 비디오 카메라로 동작을 30fps로 기록합니다. 모든 강아지 사이의 경기장을 철저히 청소하고 신선한 침구를 교체하십시오. 다른 이유(즉, 주변 소음 또는 빛)로 인해 코너 환경 설정을 피하기 위해 컨트롤로 새는 코너와 둥지 침구를 대체합니다. P18-21 개발 창에서 여러 쓰레기를 실행하는 경우 며칠 사이에 동시에 행동 실험을 실행합니다. 또한 지정된 하루 동안 제어 및 실험 그룹이 병렬로 실행되도록 합니다.
2. 모성 상호 작용 II (MI2) 작업에서 모성 사회적 상호 작용
   1. MI1 작업 직후이 작업을 수행합니다.
   2. 경기장을 설정하여 한 모서리에 빈 와이어 메쉬 컵이 포함되어 있고 반대 모서리에 메쉬 와이어 컵 아래에 댐이 들어 있도록 합니다. 마우스가 컵을 움직일 수 있다면, 컵을 아래로 무게로 컵을 컵 의 상단에 테이프로 눌러 움직임을 방지합니다. 다른 구석에 홈 케이지에서 더러운 둥지 침구를 넣어.
   3. MI2 작업을 실행합니다. 새끼를 빈 구석에 놓고 30fps에서 5분 동안 동작을 기록하여 새끼가 탐색할 수 있도록 합니다. 각 새끼를 따로 실행하고 모든 강아지 사이에 전체 경기장과 와이어 메쉬 컵을 철저하게 청소합니다.

7. 성인 사회 행동 과제 에 대한 속담

1. 성인(P60-P70 이상)이되면 MI1 및 MI2 작업에서 실행되었던 동일한 마우스에서 성인의 사회적 행동을 실행합니다. 여기에 수집 된 데이터는 별도의 코호트에서 수행되었다.
2. 실험자가 습관화할 수 있도록 성인 마우스를 3일 연속 처리합니다. 마우스 실행에 익숙한 실험자만 동작 실험을 실행, 이상적으로 같은 사람이 모든 작업을 실행해야합니다.
3. 매일 5 분 동안 3 일 동안 OF 경기장에 마우스를 습관화하십시오.
4. 새로운 개체 인식 작업의 분석 동작은 일반적인 운동과 새로운 개체에 대한 관심을 측정합니다. 이것은 마우스가 사회적인 상호 작용에 있는 특정 적자가 있는 경우에 사회적인 행동의 더 의미 있는 해석을 허용할 것입니다.
   1. 경기장 한쪽 구석에 생쥐를 5분 동안 새로운 물체(부드럽고 청소 가능한 표면이 있는 작은 플라스틱 장난감)로 배치합니다. 70%의 에탄올로 쥐 들 사이를 철저히 청소하십시오.
   2. 소설 객체 인식의 경우, 한 쪽 구석에 익숙한 이전에 노출된 '참신한 물체'를 한 쪽 구석에 놓고 반대쪽 모서리에 새 소설 객체를 놓습니다. 모든 작업의 경우 평가판 간 모서리를 컨트롤로 전환합니다.
   3. 새로운 사회적 상호 작용을 위해, 새로운 마우스가 나이, 변형 및 성냥이 일치하고 매일 5 분 동안 2 일 연속 메쉬 와이어 컵에 적응되는지 확인하십시오. 각 시험의 경우, 메시 와이어 컵 아래에 새겨진 마우스를 놓고 반대 쪽 모서리에 빈 메쉬 와이어 컵을 놓습니다. 마우스가 동작을 기록하는 동안 5 분 동안 경기장을 탐험하게하십시오. 각 시험 사이에 경기장과 메쉬 와이어 컵을 철저히 청소하십시오.

8. 행동 데이터 분석

1. DeepLabCut(https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut)을 사용하여 기본 신체 부위 추적을 수행합니다. DeepLabCut을 설치하고 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 GitHub 페이지에서 찾을 수 있습니다. 또한 기본 신체 부품 추적이 완료된 후 데이터를 추가로 분석하기 위한 맞춤형 파이썬 기반 라이브러리 'dlc_utils'(https://github.com/balajisriram/dlc_utils)도 사용할 수 있습니다. 이 라이브러리 사용 방법에 대한 자세한 내용은 GitHub 페이지에서 확인할 수 있습니다.
   1. 아나콘다 설치 프로세스를 사용하여 DeepLabCut을 설치합니다. GUI 가능한 CPU 전용 버전의 DeepLabCut과 네트워크 학습을 위한 GPU 지원 버전을 설치합니다.
   2. 아래 링크에서 사용 가능한 지침을 따라 신체 부위 추적 프로젝트를 만듭니다. 데이터 집합에서 프레임 샘플을 선택하고 이러한 샘플링된 프레임의 관련 신체 부위를 수동으로 표시합니다. DeepLabCut 네트워크를 학습하여 신체 부위를 예측하고 학습된 네트워크가 적절하게 작동하는지 확인합니다.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. 신체 위치를 추적하고 개방 된 필드에서 간단한 상호 작용을 식별하기 위해 동물의 중심, 머리 (귀 사이의 중간점으로 작동적으로 정의), 왼쪽 및 오른쪽 귀뿐만 아니라 주부와 꼬리의 베이스를 식별합니다. 여러 개의 신체 부위를 추적하면 일부 신체 부위가 파종으로 인해 프레임에 누락된 경우 적절한 대체가 가능합니다.
   4. 동물 신체 부위 외에도 동작 상자의 가장자리와 같은 환경과 관련된 다양한 지점을 추적합니다. 이를 통해 동작 설정의 위치가 세션 간에 카메라에 비해 약간 변경되더라도 여러 세션에서 이러한 점을 반복할 수 있습니다.
   5. 동작 데이터에서 신체 부위를 추적한 후 비디오의 각 프레임에 대한 예측과 관련된 신뢰도에 따라 예측된 신체 부위 위치를 필터링합니다. 낮은 신뢰도 예측은 일반적으로 폐색된 신체 부위와 관련이 있습니다. 이러한 예측의 경우 지정된 신체 부위를 다른 신체 부위로 대체하거나(이러한 대체가 적절한 경우) 또는 다른 신체 부위의 위치를 사용하여 관련 신체 부위가 어디에 있는지 예측합니다. 대부분의 개방형 필드 애플리케이션의 경우 설치류 본체의 중심은 거의 가려져 있지 않으며 높은 정확도와 정밀도로 예측할 수 있습니다.
   6. 원점의 예측된 위치와 환경의 추적된 지점의 위치를 사용하여 동물의 행동의 여러 특징을 추정합니다. 예를 들어, 개방 필드 데이터에서 위치의 시간 유도체를 사용하여 동물의 속도를 계산할 수 있습니다.
2. 편견을 피하기 위해, 가능한 경우 실험 그룹에 대해 모든 실험 "블라인드"를 수행, 특히 결과를 평가하는 데 주관적인 요소가있을 때. 남성과 여성 그룹으로 데이터를 풀링하여 주요 실험 결과에 대한 성 차이의 효과에 대한 테스트. 모든 통계 테스트는 그룹 간의 동일한 수의 동물을 테스트하도록 설계되었습니다.

9. 세포 경질의 정도를 특성화하기 위해 포스트 호크 셀 카운트

1. 모든 마우스가 성공적인 형질전환이 없고 전감염된 세포의 수에 변화가 있을 것이기 때문에 마우스 당 전형된 세포의 수를 결정합니다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 관상 섹션을 번갈아 가며 감염된 뉴런의 수를 계산하는 데 수있으며, 그 다음에 는 보간이 이어서 총 수의 트랜스 감염된 세포를 추정합니다. 이를 위해, 이미지와 다른 모든 관상 섹션 (50 μm)을 계산합니다.
   1. 4% PFA로 경외 관류를 사용하여 조직을 수정한 다음 뇌를 해부하십시오. 저온 보호 후, 50 μm에서 관상 섹션에서 뇌를 섹션.
   2. 전두엽 피질의 경우 Bregma에서 +2.75 및 + 1.35 mm 내의 셀을 계산합니다. 이러한 좌표는 전두엽 피질 영역을 포함하고 somatosensory 피질 (S1)의 일부를 포함한다.  이 방법을 사용하여, 더 많은 caudal 피질 영역 또는 피질 영역에서 관찰된 전세포가 없었습니다.
   3. 단면 동안 바늘 구멍으로 하나의 반구를 표시하는 것과 같이 오른쪽 반구에서 왼쪽을 나타내고, 양측으로 세포를 계산하십시오. 자동화된 셀 카운팅 소프트웨어를 사용하거나 셀을 수동으로 계산하여 DAPI를 사용하여 셀 본체의 존재를 확인합니다.
2. 세포 수가 얻어지면 포함에 대한 임계값을 설정합니다. 예를 들어, 분석에서 양자간 전극되는 마우스만 포함합니다. 추가 분석을 위해 행동 반응에 감염된 세포 수를 상호 연관하여 연관성이 있는지 확인합니다. 이 기술은 여러 뇌 영역을 대상으로, 그래서 뇌 영역이 유전적으로 조작 된에 대한 정보를 제공 할 필요가있다.
   참고: 특정 유전자를 조작하면 신경 이동, 사양 및/또는 사망이 발생할 수 있습니다. 뇌 해부학을 검사 하고 각 전염된 뉴런이 아마도 전염된 층 내에 있다는 것을 세포 계산 하는 동안 확인 (즉, L2/3). 피질 두께와 같은 총 해부학적 측정도 피아에서 피질 L6까지의 거리를 측정하여 정량화될 수 있다.

결과

맞춤형 전기포레이터와 3개의 갈래 전극의 성공적인 개발 및 구현.
IUEs의 경우, 이전에 설명된^{설계(27)를} 기반으로 저렴한 맞춤형 내장 전기포레이터를 제작하였다(도1A 및 도 2). 3개의 갈래 전극이^23,24개의 플라스틱 집게를 사용하여 갈래의 끝에 부착된 2개의 음극을 사용했고...

토론

본명, 파이프라인은 전두엽 피질 뉴런의 큰 집단에 대한 관심의 새로운 유전자의 조작을 마우스의 행동 분석과 결합하는 것으로 기술된다. 더욱이, 이 파이프라인은 초기 산후 발달 과 성인기에 둘 다 동일 마우스에 있는 행동의 종방향 연구 결과를 허용합니다. 이 기술은 시간과 비용의 관점에서 비용이 많이 들 수 있는 유전 동물 모델에 의지할 필요성을 우회합니다. 이 프로토콜의 강도는 최근 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
13mm Silk Black Braided Suture	Havel's	SB77D	Suture skin
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	IUE
C270 Webcam	Logitech	N/A	Record behavior
Electroporator	Custom-built	N/A	See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Pladmid preparation
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G	Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Gauze Sponges	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Heating/Cooling	Braintree	TP-700	Heating Pad
Glass pipette puller	Sutter Instrument,	P-97	IUE
Glass pipettes	Sutter Instrument,	BF150-117-10	IUE
Hair Removal Lotion	Nair	N/A	Hair removal
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Open field maze- homemade acrylic arena	Custom-built	N/A	50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP	Addgene	11150	Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt	F.S.T.	17023-13	IUE
Ring forceps	F.S.T.	11103-09	IUE
Sterilizer, dry bead	Sigma	Z378569	sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY	Havel's	HJ398	Suture muscle
Water bath	Cole-Parmer	EW-12105-84	warming sterile saline