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요약

인핸서 RNA(eRNA)는 활성 인핸서에서 생산되는 비암호화 RNA입니다. eRNA 기능을 연구하는 최적의 방법은 네이티브 염색질 영역에서 eRNA 수준을 조작하는 것입니다. 여기에서는 CRISPR-dCas9 융합 전사 활성제를 사용하여 관심 있는 eRNA의 발현을 유도하는 eRNA 연구를 위한 강력한 시스템을 소개합니다.

초록

인핸서(Enhancer)는 포유류 게놈에 흩어져 있는 중추적인 게놈 요소이며 조직 특이적 유전자 발현 프로그램을 지시합니다. 인핸서(enhancer)가 전사 인자(transcription factor, TF)에 대한 DNA 결합 모티프를 제공할 뿐만 아니라 eRNA라고 하는 비암호화 RNA를 생성한다는 증거가 증가하고 있습니다. 연구에 따르면 eRNA 전사체는 생리학과 질병 모두에서 유전자 조절에 중요한 역할을 할 수 있습니다. eRNA의 기능을 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 eRNA의 knockdown 또는 enhancer transcription의 화학적 억제에 의한 "기능 손실" 접근 방식으로 제한됩니다. eRNA가 종종 과발현되는 인간 암과 같은 특정 질병 상태를 모방하기 위해 eRNA의 "기능 획득" 연구를 수행하는 강력한 방법은 없었습니다. 여기에서는 dCas9 mediated Synergistic Activation Mediaators(SAM) 시스템을 적용하여 eRNA의 역할에 대한 기능적 질문을 위해 eRNA를 정확하고 강력하게 활성화하는 방법을 소개합니다. eRNA 선택, gRNA 설계, RT-qPCR에 의한 eRNA 활성화 검증에 이르기까지 eRNA 활성화의 전체 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 유전자 조절 및 질병 발달에서 특정 eRNA의 역할을 연구하는 독특한 접근 방식을 나타냅니다. 또한 이 시스템은 특정 질병의 맥락에서 표현형을 유발하는 eRNA 표적을 식별하기 위한 편향되지 않은 CRISPR 스크리닝에 사용할 수 있습니다.

서문

인간 게놈에는 조절 요소 1,2,3의 별자리가 포함되어 있습니다. 이 중 인핸서는 가장 중요한 범주 중 하나로 부상합니다 4,5,6. 인핸서(Enhancer)는 발달을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며, 세포 정체성을 결정하기 위한 공간-시간 유전자 발현 프로그램을 생성하는 역할을 합니다 5,6,7. 일반적으로 인핸서는 전사 인자(transcription factor, TF)에 대한 결합 모티프를 제공하는 DNA 요소로만 간주되며, 이는 표적 유전자 발현을 조절합니다 6,8. 그러나 일련의 연구에 따르면 많은 활성 인핸서가 비코딩 인핸서 RNA(즉, eRNA)도 전사하는 것으로 나타났습니다4,9,10.

eRNA 전사의 수준은 인핸서 4,10의 활성과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌습니다. 활성 인핸서는 더 많은 eRNA 전사체를 생성하고 H3K27ac 및 H3K4me1 9,11,12와 같은 활성 전사와 관련된 더 높은 수준의 후성유전체 마커를 보여줍니다. 일부 연구에서는 eRNA 전사체가 표적 유전자의 전사 활성화에 중요한 역할을 할 수 있음을 입증했습니다10,12. 많은 수의 eRNA가 인간 암13,14,15,16에서 탈조절되는 것으로 확인되었으며, 그 중 다수는 높은 암 유형 특이성과 임상적 관련성을 나타냈습니다. 이러한 발견은 종양 형성을 촉진/촉진할 수 있는 eRNA의 규명이 치료 개입을 위한 새로운 표적을 제공할 수 있는 기회를 제공합니다13,15.

eRNA 기능을 연구하는 현재 방법은 거의 독점적으로 소간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, 이 중 잠긴 핵산(LNA)는 연구에서 일반적으로 사용되는 유형)를 사용하는 녹다운 전략을 기반으로 합니다10,12,17. 그러나 암과 같은 인간 질병은 주로 인접한 정상 조직에 비해 eRNA의 과발현을 보여주기 때문에15 기능 연구를 위해 질병 관련 발현 패턴을 모방하기 위해 eRNA를 "과발현"할 수 있는 도구가 필요합니다. 이를 달성하기 위해 플라스미드 기반 이소성 과발현 시스템은 eRNA의 정확한 전사 시작 및 종결 부위가 대체로 불분명하기 때문에 최적이 아닙니다. 또한, 플라스미드 발현 시스템은 eRNA의 위치를 변경하여 eRNA의 기능에 대한 잠재적인 인공물을 유발할 수 있습니다18. 여기에서는 CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediaators System(SAM)을 기반으로 하는 eRNA 생산의 네이티브 게놈 자리(즉, in situ)에서 eRNA의 "과발현"을 적용하여 eRNA의 기능적 특성화를 촉진하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.

SAM 시스템은 처음에 흑색종 세포에서 BRAF 억제제 내성과 관련된 코딩 유전자 및 긴 유전자간 비암호화 RNA(lincRNA)를 활성화하기 위해 개발되었습니다19. 다른 CRISPR 활성화(CRISPRa) 기술과 달리 SAM 시스템은 표적 부위의 강력한 전사 활성화를 부여하기 위해 전사 활성화제의 조합으로 구성됩니다. 이러한 활성제는 다음을 포함합니다 : VP64 (즉, dCas9-VP64)와 융합 된 효소적으로 죽은 Cas9 (dCas9); 2개의 MS2 RNA 압타머를 포함하는 가이드 RNA와 MS2-p65-HSF1 융합 활성화 단백질. gRNA에 MS2 압타머가 존재하면 MS2-p65-HSF1 융합 단백질을 dCas9/gRNA 결합 부위 근처로 모집할 수 있습니다. 이 중 VP64는 단순 포진 VP16 전사 활성체 도메인의 조작된 사량체로, 일반 전사 인자 20,21,22를 모집하여 유전자 전사를 강력하게 활성화하는 것으로 나타났습니다. MS2-p65-HSF1 융합 단백질은 세 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분인 MS2-N55K는 더 강한 친화력을 갖는 MS2 결합 단백질의 돌연변이 형태입니다23; 이 융합 단백질의 다른 두 부분은 p65의 transactivation domain 및 heat shock factor 1 (HSF1)이며, 둘 다 강력한 transactivation domain을 소유하고 강력한 transcription program24,25를 유도할 수 있는 transcription factor입니다. 그러므로, SAM 시스템은 본질적으로 지정된 코딩 유전자와 lincRNAs의 전사를 활성화하기 위해 매우 강력한 활성제 복합체를 생성했습니다19.

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프로토콜

이 프로토콜의 전체 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다.

1. Enhancer RNA (eRNA) 선정

  1. ChIP-Seq(chromatin immunoprecipitation sequencing) 데이터의 결합 피크, 즉 히스톤 변형(예: H3K4me1 및 H3K27ac) 또는 전사 coactivator(예: p300)를 사용하여 관심 있는 추정 enhancer 영역을 식별합니다.
  2. ChIP-Seq 피크를 RNA-seq 신호와 교차시켜 관심 있는 eRNA를 식별합니다(예: 전체 RNA-seq 또는 GRO-Seq(Global Run-On Sequencing)과 같은 초기 RNA-seq에서).
    참고: gRNA를 설계하기 위해 선택한 영역은 일반적으로 TF 또는 coactivator(예: p300)가 명확한 ChIP-seq peak를 보이는 "enhancer core" 영역으로 제한되어야 합니다(그림 2A). dCas9 및 융합 coactivator는 gRNA에 의해 이 영역으로 동원되어 coactivator의 native binding을 모방합니다(그림 2A). CAGE(Cap Analysis of Gene Expression)4 또는 GRO-cap26과 같은 특정 데이터 세트를 사용할 수 있는 경우 반대 방향 4,10,26으로 전사된 eRNA의 두 전사 시작 부위 사이의 영역인 "인핸서 코어(enhancer core)"를 정확하게 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

2. gRNA 디자인

  1. CRISPOR27 과 같은 일반적인 CRISPR gRNA 디자인 도구를 사용하여 http://crispor.tefor.net/(off-targeting) 전위가 낮은 gRNA를 선택할 수 있습니다.
    참고: Benchling28 또는 CHOPCHOP29 와 같은 다른 도구도 gRNA 설계를 위한 추가 옵션으로 사용할 수 있습니다.
  2. 인핸서 코어 DNA 염기서열을 CRISPOR 웹사이트의 Step 1 열에 붙여넣은 다음 드롭다운 버튼을 클릭하여 Step 2 열에서 해당 게놈(예: human)을 선택합니다. 드롭다운 버튼을 클릭하여 3단계 열에서 PAM(Protospacer Adjacent Motif) 시퀀스를 "NGG"로 설정한 다음 "제출" 버튼을 클릭하여 20bp 길이의 가이드 시퀀스를 생성합니다.
  3. CRISPOR 도구에서 특이도 점수가 가장 높은 가이드, 즉 낮은 off-target 전위를 선택한 다음 각각 5' 말단에 "CACCG"를 추가하고 3' 말단에 "C"를 추가합니다.
    참고: 특이도 점수가 가장 높은 가이드를 선택합니다(CRPOR에서 >85 선호).
  4. 각 감각에 대한 올리고뉴클레오티드와 안티센스 염기서열을 상업적 출처에서 주문합니다.
    참고: CRISPR/Cas9 gRNA 설계에 대한 추가 지침은 다른 연구30,31에서 찾을 수 있습니다. 2.2단계의 돌출부는 gRNA가 BsmBI 제한 효소를 사용하는 SAM gRNA backbone (Addgene #61427)과 호환되도록 합니다.

3. gRNA를 렌티바이러스 구조체로 클론 생성

  1. 올리고를 어닐링하려면 100 μM에서 각 쌍 올리고 1 μL, 10x T4 ligation buffer 1 μL, T4 DNA 리가아제(400,000 units/mL) 0.5 μL 및 H2O 6.5 μL를 혼합하여 총 부피 10 μL에 도달합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양 한 다음 95 ° C에서 5 분 동안 배양합니다. 5°C/분에서 25°C까지 램프다운합니다. H2O를 사용하여 100 μL로 희석합니다.
  2. 1 μL에 2 μL의 10x restriction enzyme (RE) Buffer, 300 ng의 lenti_gRNA(MS2)_zeo backbone plasmid (Addgene #61427)를 1 μL, 1 μL의 BsmBI enzyme 및 16 μL의 H2O에 혼합하여 총 부피 20 μL에 도달하여 gRNA 골격을 분해합니다. 55 °C에서 15 분 동안 배양합니다.
  3. 25 μL 시스템에 2.5 μL의 10x T4 ligation buffer, 1 μL의 희석된 어닐링 산물 및 1.5 μL의 T4 DNA 리가제(400,000 units/mL)를 추가하여 ligation 성분을 20 μL digestion product와 혼합합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  4. 3.3단계의 ligation mix 2 μL를 Stbl3 수용성 E.coli 세포로 형질전환시킵니다. 암피실린 LB-한천 플레이트에 플레이트를 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  5. 단일 박테리아 군체를 선택하여 접종하고 플라스미드를 추출합니다. Sanger 염기서열분석을 위해 보내어 gRNA 염기서열분석이 올바르게 삽입되었는지 확인합니다.
    참고: primer 및 gRNAs에 대한 sequences는 Supplementary Table 1 에서 확인할 수 있습니다. Stbl3 chemically competent E.coli cell은 불안정성이 있는 렌티바이러스 플라스미드를 생성할 때 더 높은 플라스미드 DNA 수율과 더 높은 플라스미드 안정성을 갖기 때문에 여기에 사용하는 것이 좋습니다32.

4. gRNA 효율 테스트

참고: 모든 gRNA에 필요한 것은 아니지만, 연구자들은 양질의 gRNA에 의해서만 효율적으로 생성될 수 있는 indels 또는 mutation을 검출하기 위해 Surveyor assay(즉, mismatch cleavage assay)를 수행하여 gRNA의 품질을 검사하는 것이 좋습니다33,34. TIDE(Tracking of Indels by Decomposition)와 같은 다른 방법도 gRNA 효율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다30,35. Surveyor nuclease는 mismatch가 있는 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 mismatch-specific endonuclease 계열의 구성원입니다(그림 3A). gRNA의 품질은 더 작은 DNA 종을 생산하는 효능으로 드러날 수 있습니다. 실질적으로 서베이어 절단 효율은 gRNA 및 Cas9의 transfection 효율에 의해서도 영향을 받을 수 있습니다.

  1. 지질 기반 transfection 시약을 사용하여 Cas9 단백질을 293T 세포로 발현하는 pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) 플라스미드와 함께 gRNA를 transfection합니다. 6 웰 플레이트의 웰당 각 플라스미드에 대해 1.2 μg/mL를 사용합니다. 형질주입 후 3일 동안 세포를 계속 배양합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 수집하고 추출합니다36.
  2. 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 게놈 DNA의 표적 인핸서 영역을 증폭합니다. 보충 표 2에 나타난 PCR 조건을 사용한다. 보충 표 1 의 프라이머를 예시 인핸서 NET1e로 사용하십시오. 95°C에서 10분 동안 배양하여 PCR 산물을 변성시키고 -0.3°C/s의 속도로 95°C에서 25°C로 ramping down하여 gRNA 유도 indels 또는 돌연변이가 있거나 없는 단일 가닥 DNA(ssDNA)가 서로 어닐링할 수 있도록 합니다.
  3. 제조업체의 프로토콜37에 따라 Surveyor nuclease(그림 3A)에 의해 혼성화된 DNA를 분해합니다. 50 μL 시스템에서 4.2 단계의 혼성화된 DNA 400 ng, Surveyor nuclease 1 μL, Surveyor enhancer 1 μL 및 0.15 M MgCl2 5 μL를 혼합합니다. 42°C에서 60분 동안 배양합니다. 아가로스 겔의 DNA를 분석합니다. assay 및 gel 전기영동에서 gRNA를 표적으로 하지 않고 Cas9만 있는 세포와 같은 negative control을 사용합니다(그림 3B).

5. 렌티바이러스 발생

  1. psPAX2, pMD2.G 및 타겟 플라스미드(예: lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425 또는 lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426)를 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브에 3 μg : 1 μg : 4 μg의 비율로 첨가합니다. 500μL의 Opti-MEM과 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 별도의 튜브에 10μL의 지질 기반 transfection 시약을 500μL의 Opti-MEM에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  3. 5.1단계와 5.2단계의 제품을 결합하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  4. transfection 하루 전에 293T 세포를 플레이트화하고 transfection 시 10cm 접시에 ~30%의 합류점에 도달하도록 합니다. 4mL의 일반 배지(10% FBS가 있는 DMEM)를 추가한 다음 5.3단계의 복합체를 세포에 적가합니다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 추가하여 최종 부피를 최대 6mL까지 만듭니다. 37°C의 세포 배양기에서 5% CO2로 밤새 배양합니다.
  5. 다음 날, 배지를 10% FBS가 함유된 새 DMEM 10mL로 변경합니다. 배지 변경 후 24시간 후에 배지를 수확합니다. 주사기 필터(예: 0.45μm)를 사용하여 바이러스 함유 배지를 여과한 다음 6단계로 진행하거나 바이러스를 -80°C에 보관합니다.
    참고: 렌티바이러스 작업에는 BioSafety Level II 캐비닛이 필요합니다. 바이러스 관련 실험을 안전하게 처리하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 그리고 용기가 바이러스 매체와 직접 접촉하는 경우 생물학적 위험으로 폐기하기 전에 20분 이상 표백해야 합니다.

6. 세포 배양

  1. CO2 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO2로 37°C에서 세포를 유지합니다.
  2. 10% FBS를 사용하여 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 배지에서 MCF7 및 293T 세포를 배양합니다.
  3. 10cm 접시에서 세포를 성장시키고 합류하면 1:3에서 1:5 비율로 나뉩니다.

7. 세포 감염 및 선택

  1. 0.5mL의 lenti_dCas9-VP64_Blast(Addgene #61425) 및 0.5mL lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro(Addgene #61426)을 함유하는 바이러스 배지 혼합물에 타겟 세포(예: MCF7)를 직접 파종합니다. 8μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 첨가하여 감염 효율을 높입니다. 감염되지 않은 세포의 웰을 항생제 선택의 효능을 조사하기 위한 음성 대조군으로 사용합니다.
    참고: 바이러스 배지의 양은 다음과 같이 권장됩니다: 10cm 접시의 경우 6mL 바이러스 배지, 6웰 플레이트의 웰의 경우 1mL, 12웰 플레이트의 웰의 경우 0.5mL.
  2. 감염 후 24시간이 지나면 Blasticidin(MCF7 세포의 경우 5μg/mL) 및 Hygromycin(MCF7 세포의 경우 200μg/mL)이 포함된 새로운 배지를 세포에 추가합니다.
  3. 음성 대조 세포가 사멸할 때까지 세포를 항생제 선별 배지에 보관하십시오.
    참고: 세포주에 따라 안정되는 데 시간이 달라질 수 있습니다. MCF7의 경우 감염되지 않은 세포가 완전히 사멸하는 데 보통 5-7일이 걸립니다. 실험 전에 다양한 항생제 농도를 사용하여 새로운 세포주에 대해 사멸 곡선을 테스트해야 합니다. 다음 단계를 위해 세포 혼합물을 사용하는 것이 허용되지만, 대안은 두 effector 단백질의 발현 측면에서 균질한 단일 세포 콜로니를 선택하는 것입니다. 얻어진 안정된 라인은 본 논문에서 SAM-effector parent line(예: MCF7 SAM-effector line)이라고 합니다. 다른 표적 또는 비표적 gRNA에 의한 감염을 위해 공유된 SAM-effector parent 세포주를 사용하는 것이 좋으며, 특히 이들의 효과를 비교하는 경우 더욱 그렇습니다.
  4. 웨스턴 블로팅(western blotting)을 사용하여 세포가 두 개의 effector 단백질을 안정적으로 발현하는지 여부를 확인합니다( 예: 그림 4A에 나와 있음). 두 mRNA의 발현 수준을 검사하기 위한 대안 방법으로 총 RNA의 역전사 후 정량적 PCR(RT-qPCR)을 사용합니다(dCas9-VP64 및 MS2-p65-HSF1, 그림 4B).
    참고: 두 dCas9 effector의 mRNA 수준을 검사하기 위한 Primer는 보충 표 1에서 확인할 수 있습니다.
  5. Step 3.5에서 구축한 gRNA의 렌티바이러스를 생성하고, dCas9-VP64 및 MS2-p65-HSF1을 이중 발현하는 안정적인 SAM 세포주를 개별 gRNA 렌티바이러스로 감염시킵니다. Zeocin(MCF7 세포의 경우 100 μg/mL)을 gRNA 바이러스 transduction 후 24시간 배지에 추가합니다. parent SAM 세포주에서 non-targeting gRNA(NT-gRNA)를 발현하는 negative control을 생성합니다.
    참고: 선택 약물이 관심 구성에 특이적인지 확인하십시오.

8. eRNA 수치를 검사하기 위한 RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

  1. RNA 추출 키트38 또는 기타 페놀 클로로포름 기반 방법을 사용하여 NT-gRNA 또는 표적 gRNA를 발현하는 SAM 세포주에서 총 RNA를 추출합니다. RNA 추출을 위해 6웰 플레이트의 한 웰에 ~80% 농도의 세포를 사용합니다.
    참고: RNA가 상용 결합 컬럼 또는 페놀 클로로포름 시약으로 추출될 때 eRNA 검출에 대한 당사의 관행에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.
  2. 제조사의 프로토콜39에 따라 무작위 헥사머(hexamer)와의 역전사 반응으로 정제된 RNA로부터 상보적 DNA(complementary DNA)를 생성한다. 보충 표 2의 사용 조건.
    참고: 대부분의 eRNA는 non-polyadenylated 1,2,4,9,10이기 때문에 무작위 헥사머가 cDNA 생성에 일상적으로 사용됩니다.
  3. RT-qPCR 측정 타겟 eRNA를 위한 프라이머를 저명한 프라이머 설계 도구(예: Primer 3)를 사용하여 설계합니다. 프라이머가 연속 희석된 cDNA를 선형적으로 증폭하고 예상되는 qPCR cycle 차이를 보여주는지 검사하여 프라이머 쌍의 증폭 선형성을 테스트합니다.  보충 표 2의 사용 조건.
    참고: RT-qPCR용 프라이머는 초기 RNA-seq에서 고도로 전사된 영역을 표적으로 해야 하며, 프라이머의 선형성 테스트에는 발생할 수 있는 모든 eRNA 수준이 테스트되도록 광범위한 cDNA 희석이 포함되어야 합니다. 선형성 테스트의 예가 그림 5A에 나와 있습니다.
  4. RT-qPCR을 수행하고 대조 세포(NT-gRNA가 있는 SAM 세포주) 및 eRNA 표적 gRNA가 있는 SAM 세포주(예: NET1e gRNA#1)에서 eRNA 발현 수준을 분석합니다(예: 그림 6A). NET1e RNA에 대한 프라이머는 보충 표 1에 나와 있습니다. 보충 표 2의 사용 조건.  

9. dCas9 ChIP 및 qPCR

참고: 이 단계는 특정 gRNA에 의한 dCas9/SAM-gRNA complex의 target enhancer 결합을 검증하기 위한 선택적 실험입니다. 사용자가 이 단계를 수행하는 것이 좋지만 모든 단일 gRNA를 테스트할 필요는 없습니다. 그림 5B에 표시된 예를 참조하십시오. 보충 표 1에 나열된 프라이머를 참조하십시오.

  1. 세포 가교
    1. 세포에서 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 1% 포름알데히드를 첨가합니다. 10분 동안 그대로 둡니다.
    2. 1:20 부피로 2.5M 글리신을 첨가하여 가교를 소멸시키고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 700μL의 얼음처럼 차가운 PBS를 넣고 세포를 1.5mL 튜브에 긁어냅니다.
    3. 2,000 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 9.2단계로 진행하거나 스냅 동결하여 -80°C에서 보관하십시오.
  2. 소닉메이트
    1. 새로운 LB1, LB2 및 LB3 버퍼를 만듭니다. LB1: 50mM Hepes-KOH(pH 7.5), 140mM NaCl, 1mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 0.25% Triton-X 100 및 1x 프로테아제 억제제. LB2 : 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA 및 1x 프로테아제 억제제. LB3 : 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.1 % Na- 데 옥시 콜레이트, 0.5 % N- 라우로 일 사르코신 및 1x 프로테아제 억제제. 실험 전에 1x 프로테아제 억제제를 완충액에 신선하게 보충하십시오.
    2. 1mL의 버퍼 LB1을 세포 펠릿에 추가하고, 피펫을 잘 낳고, 4°C에서 10분 동안 회전하고, 4°C에서 5분 동안 2,000 x g 로 회전합니다. 상층액을 붓고 LB2 완충액 1mL를 첨가한 후 4°C에서 10분 동안 회전한 후 4°C에서 5분 동안 2,000 x g 로 회전합니다. 상등액을 붓고 LB2 완충액의 초과분을 제거합니다. 300μL의 버퍼 LB3를 추가합니다.
    3. 적절한 초음파 발생기 시스템을 사용하여 염색질 DNA를 평균 200~400bp 크기로 초음파 처리하고 단편화합니다. 초음파 처리 후 30 μL의 10 % Triton-X 100을 넣고 잘 섞는다. 새로운 세포주를 사용하는 경우 적절한 초음파 처리 시간을 테스트합니다.
    4. 펠릿을 제거하기 위해 14,000 x g 에서 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 630μL의 LB3와 70μL의 10% Triton X-100을 총 부피 1mL에 추가합니다. 상등액에 Cas9 항체 2μg을 추가하고 4°C에서 밤새 회전합니다.
  3. Immuno-complex capture 및 reverse cross-linking
    1. RIPA 완충액(50mM HEPES pH 7.6, 1mM EDTA, 0.7% Na-데옥시콜레이트, 1% NP-40, 0.5M LiCl) 및 용출 완충액(1% SDS 및 0.1M NaHCO3)을 준비합니다.
    2. 단백질 G 다이나비드를 1% BSA로 PBS에서 3회 세척하고 LB3 완충액을 한 번 세척합니다.
    3. 샘플에 30μL의 단백질 G 다이나비드를 추가하고 4°C에서 4시간 동안 배양합니다.
    4. 비드-면역 복합체를 500μL의 RIPA 완충액 6x로 세척합니다. 구슬이 마르지 않도록 하십시오.
    5. beads-immuno-complex를 TE buffer로 한 번 세척합니다. 버퍼를 제거합니다.
    6. 200 μL의 용리 완충액을 beads-immuno-complex 및 vortex에 추가합니다. 그런 다음 65°C로 설정된 온도 조절이 가능한 가열식 셰이커에 넣고 600rpm 쉐이킹을 6-16시간 동안 흔들어 가교를 역시킵니다.
  4. DNA 추출
    1. 셰이커에서 튜브를 제거하고 비드를 잠시 회전시킨 다음 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 200 μL의 상등액을 새 튜브로 옮기고 200 μL의 TE 완충액을 추가합니다.
    2. 튜브에 1 μL의 RNase A(1 mg/mL)를 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. 1시간 배양 후 샘플에 2μL의 Proteinase K(20mg/mL)를 추가하고 65°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    4. 간단히 원심분리기를 하고 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 혼합물 400μL를 추가합니다. 잘 섞은 다음 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    5. 상층의 400μL를 16μL의 5M NaCl과 1μL 글리코겐(20μg/μL)이 들어 있는 1.7mL 튜브로 이동하고 잘 혼합합니다.
    6. 800μL의 100% 에탄올을 넣고 -20°C에서 하룻밤 방치합니다.
    7. 다음날 아침, 4°C의 14,000 x g 에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다.
    8. 상등액을 제거하고 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 세척합니다. 14,000 x g 에서 10분 동안 스핀다운합니다.
    9. 에탄올을 제거하고 펠렛을 자연 건조하고 50 μL의 TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 재현탁합니다.
  5. ChIP-qPCR을 수행하여 한 쌍의 enhancer core-targeting primer에 의한 SAM 복합체의 표적 부위 동원을 검사합니다. 관련 없는 영역을 표적으로 하는 primer pair를 negative control로 사용합니다.

10. eRNA 과잉 활성화에 대한 세포 성장 분석 및 기타 기능 테스트

  1. 비표적 gRNA 또는 eRNA 표적 gRNA를 발현하는 SAM 세포주를 트립신화하고 96웰 플레이트에서 웰당 ~3,000개의 세포를 플레이트화합니다.
  2. 살아있는 세포 영상 장치 또는 다른 방법(예: 세포 계수 또는 수용성 테트라졸륨 염-1 분석)을 사용하여 세포 성장을 측정합니다.
  3. 절반 최대 억제 농도(IC50)를 사용하여 SAM15에 의한 NET1e 과발현이 있거나 없는 세포에서 특정 암 약물에 대한 세포 반응을 테스트합니다.
    참고: 유방암 세포의 세포 성장 분석 및 약물 감수성 검사의 결과는 NET1e15로 지칭된 NET1 유전자에 인접하여 전사된 eRNA의 과발현 후에 제시됩니다. 다른 분석은 각 특정 프로젝트의 필요에 따라 세포 또는 유기체 수준에서 수행할 수 있습니다.

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결과

그림 1 은 이 프로토콜의 전체 워크플로우를 보여줍니다. 우리의 초점은 유방암에서 과발현되는 대표적인 eRNA인 NET1e15에 초점을 맞추었으며, 이를 위해 SAM 시스템을 사용하여 유전자 발현, 세포 증식 및 암 약물 반응을 조절하는 생물학적 역할을 활성화하고 연구했습니다. 이 NET1 enhancer의 경우, 전사된 eRNA 전사체(

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토론

당사의 데이터를 바탕으로 SAM 시스템이 세포 성장 또는 약물 내성과 같은 세포 표현형을 조절하는 eRNA의 역할을 연구하는 데 적합하다는 결론을 내렸습니다. 그러나 다음과 같은 이유로 강력한 eRNA 활성화를 위해서는 신중한 gRNA 설계가 필요합니다. 우선, 각 특정 세포주/유형에서 eRNA의 transcription start site(TSS)에 명확하게 주석이 되어 있지 않습니다. 이로 인해 후성유전체...

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공개

이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 텍사스 암 예방 및 연구소의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다.

감사의 말

이 작업은 W.L(Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 및 RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; 텍사스 대학교 UT 스타 상; 및 Welch Foundation AU-2000-20190330) 및 J.L(UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015)에 대한 박사 후 연구원. 우리는 현재 수치 중 일부가 Creative Commons 라이선스(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)를 따르는 (수정 포함) 채택된 원본 publicataion15 를 인정합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

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