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요약

본 프로토콜에서는 RNA-Seq를 기반으로 한 퓨린 뉴클레오시다아제(PN, EC:3.2.2.1)의 유전자 채굴 및 염기서열 분석 방법을 설명하였다. PN의 독특한 2차 및 3차 구조를 보여주기 위해 ProtProm 분석이 적용되었습니다. 또한, RNA-Seq 결과의 신뢰성을 검증하기 위해 전사체에서 PN 유전자를 복제했습니다.

초록

애벌레 곰팡이(Ophiocordyceps sinensis)는 가장 가치 있는 곰팡이 중국 전통 의학(TCM) 중 하나이며 아데노신과 같은 활성 성분을 많이 함유하고 있습니다. 아데노신은 다양한 항종양 및 면역 조절 활성을 가진 생물학적으로 효과적인 성분으로 간주됩니다. 아데노신 생합성에서 퓨린 뉴클레오시다아제(PN)의 기전을 더욱 규명하기 위해 PN을 암호화하는 유전자를 성공적으로 채굴하고 애벌레 곰팡이의 RNA-Seq 데이터베이스를 기반으로 추가 분석했습니다. PN 의 전장 cDNA는 855bp였으며, 이는 284개의 아미노산을 암호화했습니다. BLAST 분석은 NCBI에서 뉴클레오시드 가수분해효소와 85.06%의 가장 높은 상동성을 보여주었습니다. ProtProm 분석은 상대 분자량이 30.69kDa이고 등전점이 11.55임을 보여주었습니다. PN의 2차 구조는 Predict Protein에 의해 예측되었습니다. 그 결과, 알파나선 구조가 28.17%, 스트랜드 구조가 11.97%, 루프 구조가 59.86%를 차지하는 것으로 나타났다. 또한, PN 유전자는 전사체로부터 추가로 복제되고 검증을 위해 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출되었습니다. 이 연구는 진균 TCM에서 아데노신 생합성의 유전적 조절에 대한 보다 충분한 과학적 근거와 새로운 아이디어를 제공합니다.

서문

곰팡이 중국 전통 의학(TCM)은 풍부한 종 자원을 가지고 있습니다 1,2. 애벌레 곰팡이(Ophiocordyceps sinensis)는 잘 알려진 곰팡이 TCM이며 혁신적인 약물의 공급원으로 간주됩니다 3,4. 애벌레 곰팡이는 중국 남서부의 티베트 고원에서 발견되는 벌레와 곰팡이가 결합된 혼합물로, Hirsutella sinensis는 애벌레 몸에 기생합니다5. 현재 H. sinensis는 분자 및 형태 생물학 증거 6,7에 따라 애벌레 곰팡이의 유일한 아나모프로 보고되었으며, 야생 애벌레 곰팡이8에 비해 관련 독성이 적고 유사한 임상 효능이 있습니다. H. sinensis는 뉴클레오시드, 다당류 및 에르고스테롤과 같은 다양한 생물학적으로 효과적인 성분을 보유하고 있으며 간 손상 복구와 같은 광범위한 약리학적 효과가 있는 것으로 밝혀졌습니다 9,10,11. 아데노신은 애벌레 곰팡이에서 분리된 전형적인 활성 성분이며 일종의 퓨린 알칼로이드12입니다. 아데노신은 항종양, 항균 및 면역 조절 활성과 같은 다양한 생물학적 활성을 가지고 있습니다13,14. 불행히도, 아데노신의 생합성 메커니즘과 관련된 주요 유전자는 여전히 불분명합니다15,16.

아데노신은 주로 종양 미세환경에서 면역억제작용을 통해 항종양 효과를 나타낸다17. 아데노신은 부상 후 조직 복구를 시작하고 과도한 염증으로부터 조직을 보호하는 데 중요한 면역 억제 기능을 보였다고 보고되었다18,19. 또한, 아데노신에 의한 면역 억제는 암 면역감시를 심각하게 손상시킬 뿐만 아니라 종양 성장을 촉진할 수 있음이 입증되었다20. 따라서 항종양에 광범위하게 적용하기 위해 아데노신 생합성의 메커니즘을 연구하는 것이 시급합니다.

발현된 유전자와 그 발현 수준에 대한 완전한 관점은 전사체21의 차세대 염기서열분석에 의해 체계적으로 수행될 수 있다고 보고되었습니다. 또한, 전사체 염기서열분석 및 분석을 적용하여 활성 성분의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 예측하고 다양한 생합성 경로의 상호 작용을 추가로 조사했습니다22. 퓨린 뉴클레오시다아제(Purine nucleosidase, PN, EC 3.2.2.1)는 퓨린 뉴클레오시드에 대한 기질 특이성을 가진 뉴클레오시다아제(nucleosidase)의 한 종류로, 퓨린 뉴클레오시드의 배당체 결합을 당과 염기로 가수분해할 수 있습니다23. 일반적으로 아데노신 생합성에서 중요한 역할을 합니다. 진균 TCM에서 아데노신의 생합성 경로가 예측되었다고 보고되었습니다. qPCR과 유전자 발현은 증가된 아데노신 축적이 PN 유전자의 하향 조절의 결과임을 보여주었으며, 이는 PN 유전자가 아데노신 생합성에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타냅니다15. 따라서 아데노신 생합성에서 PN 의 기전을 시급히 규명해야 합니다. 그러나 PN의 염기서열 정보와 단백질 구조뿐만 아니라 진균 TCM의 아데노신 생합성에 관여하는 다른 주요 유전자에 대해서는 더 이상 연구되지 않았습니다.

본 연구에서는 애벌레 곰팡이의 RNA-Seq 데이터에서 PN 유전자의 새로운 염기서열을 채굴하고 유전자 클로닝을 통해 검증했습니다. 또한 PN의 분자 특성과 단백질 구조를 종합적으로 분석하여 아데노신 생합성의 유전자 조절에 대한 새로운 방향과 아이디어를 제공할 수 있었습니다.

프로토콜

참고: 애벌레 곰팡이(H. sinensis)의 아나모프 균주가 우리 실험실에 기탁되었습니다. 대장균 DH5는 베이징 중의과대학 선전시(Shenzhen Hospital)에 의해 보존되었습니다.

1. RNA-Seq 준비

  1. 균사체의 수확
    1. H. sinensis의 발효를 위한 발효 배지를 준비합니다: 분말 옥수수 가루(1%), 누에 번데기(1.5%), 효모 추출물(0.5%), 트립톤(1%), 포도당(1.5%), 밀기울(1.5%), 덱스트린(0.5%), KH2PO4 (0.02%) 및 MgSO4 (0.01%).
    2. 스케일업 배양을 위해 10% 발효 배지로 접종을 준비합니다(100mL 배지당 10mL 배지 추가). 16 °C의 조건으로 150 rpm의 회전 쉐이커에서 10 일 동안 침수 발효를 실시합니다.
    3. 무성 생식은 10 일 동안 애벌레 곰팡이의 anamorph의 균사체를 수확합니다. 발효된 배지를 원심분리하고 원심분리 후 상등액을 버립니다. 초순수 100mL를 3회 첨가하여 균사체를 현탁시키고 원심분리로 상층액을 제거합니다. 청소한 균사체를 액체 질소를 사용하여 분말로 분쇄합니다.
  2. RNA-염기서열분석
    1. 제조업체의 프로토콜(Table of Materials)에 따라 애벌레 곰팡이의 anamorph의 총 RNA를 추출하고 RNase-free DNase I(Table of Materials)로 샘플을 추가로 처리합니다.
    2. total RNA PolyATtract mRNA Isolation Systems에서 mRNA를 분리하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 oligo(dT)가 있는 beads를 사용하여 poly(A) mRNA를 분리합니다(Table of Materials).
    3. 짧은 단편을 주형으로 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 무작위 hexamer-primer에 의해 첫 번째 가닥 cDNA를 합성합니다(Table of Materials). 제조업체의 프로토콜에 따라 두 번째 가닥 cDNA의 합성을 수행합니다.
    4. 그런 다음 제조업체의 프로토콜(Table of Materials)에 따라 Ultra RNA Library Prep Kit를 사용하여 염기서열분석 라이브러리를 생성합니다.
    5. 제조사의 프로토콜(Table of Materials)에 따라 PCR 추출 키트로 short fragment를 정제하고 EB buffer로 각각 분리합니다.
    6. 짧은 단편(임계값 300bp)을 agarose gel 전기영동 결과에 따라 염기서열분석 어댑터와 연결합니다.
    7. 그 후, 적절한 단편에서 선택된 템플릿을 사용하여 PCR로 증폭을 수행합니다.
    8. 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina HiSeq 4000으로 paired-end 염기서열분석을 사용하여 라이브러리를 염기서열분석합니다. 원시 시퀀스 데이터에서 더티 원시 읽기를 필터링하여 깨끗한 데이터를 얻습니다. denovo 어셈블리를 채택하여 양쪽 끝에서 확장할 수 없는 최소 Ns를 가진 Unigenes를 얻습니다.
    9. blastx에 의한 Unigene 염기서열을 nr, Swiss-Prot, KEGG 및 COG(e-value < 0.00001)와 같은 단백질 데이터베이스에 정렬합니다. 단백질 기능 주석과 함께 주어진 Unigenes와 가장 높은 염기서열 유사성을 가진 단백질을 검색합니다. RNA-Seq 결과를 요약합니다(Table of Materials).
      참고: 위의 단계에서는 상용 키트가 사용되었으며 모든 작업은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

2. 퓨린 뉴클레오시다아제의 유전자 채굴

  1. RNA-Seq 결과 파일을 컴퓨터에 다운로드합니다. RNA-Seq 결과에서 조립된 Unigenes의 주석 결과 파일을 찾습니다.
    참고: 쌍단 읽기는 어느 쪽 끝에서 확장할 수 없는 최소 Ns를 가진 시퀀스를 얻기 위해 스캐폴드의 갭 채우기에 다시 사용되었습니다. 이러한 서열은 Unigenes로 정의되었습니다. Unigene annotation은 Unigene의 발현 및 기능 주석에 대한 정보를 제공합니다.
  2. 주석 파일 경로를 열고 검색 창에 map 00230을 입력합니다. 그런 다음 주석 파일의 KEGG 분류에서 퓨린 대사(map00230)를 검색합니다.
  3. 주석이 달린 map00230에서 EC:3.2.2.1 (PN)을 빨간색으로 표시하고 PN에 주석이 달린 조립된 Unigenes가 있음을 나타냅니다.
    참고: EC 번호 3.2.2.1을 클릭하고 주석이 달린 map00230에 표시된 후 PN에 주석이 추가된 세 개의 Unigenes(Unigene10777, Unigene14697 및 Unigene17827)가 있습니다.
  4. EC 번호 3.2.2.1을 클릭하고 주석이 달린 Unigenes 정보를 표시합니다.
  5. LTFViewer 소프트웨어를 열고 Ctrl-O 바로 가기를 사용하여 Unigene.fa 파일을 가져오고 어셈블된 Unigenes의 시퀀스 정보를 표시합니다.
  6. Ctrl-F 단축키로 Unigene10777, Unigene14697, Unigene17827의 염기서열 정보를 검색합니다.
  7. Ctrl-C와 Ctrl-V 단축키를 사용하여 Unigene10777, Unigene14697, Unigene17827의 염기서열 정보를 다운로드합니다.
  8. ORF(Open Reading Frame)의 시퀀스가 지나치게 짧은 Unigene10777 및 Unigene17827을 제거합니다.
    참고: 기본 시퀀스 정보는 LTFViewer 소프트웨어에 표시되었습니다.
  9. 추가 연구를 위해 적절한 길이의 ORF를 가진 Unigene14697(크기 1,705bp, 갭 0 0%)을 선택합니다.

3. 생물정보학 분석

  1. ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)로 PN 유전자의 ORF를 분석합니다.
    1. 시퀀스를 상자에 붙여넣습니다. 다음과 같이 매개 변수를 선택하십시오, 최소 ORF 길이 (nt) : 75, 유전 코드 : 1. 표준, 사용할 ORF 시작 코돈 : ATG 만. 제출 버튼을 클릭하여 ORF 정보를 얻습니다.
  2. ProtParam 도구(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)를 사용하여 이론적 분자량과 등전점을 계산합니다.
    1. 아미노산 서열(한 글자 코드)을 상자에 붙여넣고 Compute Parameters 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  3. SignalP5.0 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 적용하여 신호 펩타이드를 예측합니다.
    1. 단백질 염기서열을 FASTA 형식으로 입력합니다. 다음과 같이 매개변수를 선택합니다(유기체 그룹: Eukarya, 출력 형식: 긴 출력). 제출 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  4. BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 적용하여 단백질 염기서열의 상동성을 분석합니다.
    1. Protein Blast 버튼을 클릭하고 상자에 염기서열을 입력합니다. 매개변수를 데이터베이스: Non-redundant protein sequences (nr), algorithm: blastp (protein-protein BLAST)와 같이 선택합니다. 폭발 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  5. Clustal X 프로그램(http://www.clustal.org/)을 적용하여 다른 곰팡이에서 PN의 산 서열을 정렬합니다.
    1. 파일을 업로드하거나 시퀀스를 상자에 붙여넣습니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정하고 출력 형식: ClustalW with character counts를 사용합니다. 제출 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다. Clustal X는 FASTA 형식의 파일만 인식할 수 있으며 파일 경로에는 영어 이름만 포함될 수 있습니다.
  6. MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/)을 사용하여 계통수를 수행합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 파일 버튼을 클릭하여 시퀀스를 업로드하십시오. 데이터 유형을 Protein Sequences로 선택하고 OK 버튼을 클릭하여 다음 단계로 진행합니다. 그런 다음 Phylogeny 버튼을 클릭하고 Bootstrap Test Phylogeny를 선택한 다음 Neighbor Joining Tree를 클릭합니다. 기본 매개 변수를 선택하고 Compute 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  7. InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)을 적용하여 PN의 촉매 영역을 식별합니다.
    1. 상자에 순서를 입력합니다. 기본 매개변수를 선택하고 검색 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  8. Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)을 온라인으로 적용하여 단백질 2차 구조를 예측합니다.
    1. 상자에 아미노산 서열(한 글자 코드)을 입력한 다음 predictProtein 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.
  9. 온라인 도구 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)을 적용하여 PN24의 3차원 구조를 평가합니다.
    1. Start Modeling 버튼을 클릭하고 대상 시퀀스를 상자에 붙여넣습니다. 프로젝트 제목과 이메일 정보를 입력하고 템플릿 검색 버튼을 클릭하여 결과를 얻습니다.

4. 유전자 클로닝과 재조합 플라스미드의 구축

  1. 리버스 프라이머에는 NotI 사이트가 포함되어 있고 포워드 프라이머에는 EcoRI 사이트가 포함된 설계 프라이머.
  2. 정방향 프라이머는 AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3')로, 리버스 프라이머는 Primer Express의 ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3')로 표시합니다.
  3. PN 유전자 클로닝을 위해 애벌레 곰팡이의 cDNA와 프라이머를 준비합니다. PCR을 다음과 같이 수행하십시오 : 95 °C에서 5 분 동안 변성, 94 °C에서 45 초 동안 변성, 55 ° C에서 60 초 동안 재생, 72 °C에서 90 초 동안 연장, 35 사이클 동안 반복, 72 °C에서 10 분 동안 연장.
  4. PCR 단편을 획득하고 검증을 위해 아가로스 겔 전기영동으로 검출합니다. PCR 단편을 pMD18-T로 접합합니다. PMD18-T의 결찰 시스템은 1 μL PMD18-T, 4 μL Solution1 및 5 μL Target gene과 같이 수행됩니다. 다음과 같이 조건을 설정합니다: 16°C에서 16시간 동안 유지, 65°C에서 15분 동안 비활성화.
  5. 재조합 플라스미드를 사용 설명서25에 따라 적격 E. coli JM109 세포로 이식합니다.
  6. 재조합 pMD18-T/PN 플라스미드 및 벡터 ppic9K를 EcoRI 및 NotI으로 분해합니다. T4 DNA 리가아제로 분해한 후 단편을 접합합니다.
  7. 추가적인 이종 발현을 위해 재조합 플라스미드 ppic9K/PN 을 구성합니다.

결과

PN 유전자의 ORF 염기서열은 길이가 855bp였으며, 이는 30.69kDa의 계산된 분자량과 11.55의 예측 등전점을 가진 284개의 아미노산을 암호화하여 PN이 알칼리성 단백질임을 나타냅니다. 신호 펩타이드를 식별하기 위해 SignalP4.0 서버를 적용했으며, 그 결과 PN에는 신호 펩타이드가 없는 것으로 나타났습니다. 또한, BLASTP 검색 결과에 따르면 애벌레 곰팡이에서 유래한 PN은 ...

토론

인간의 건강은 종양, 심혈관 및 뇌혈관 질환과 같은 일련의 주요 의학적 문제에 직면해 있습니다26,27. TCM은 풍부한 종 자원과 활성 성분의 다양한 구조 및 기능으로 인해 혁신적인 의학의 연구 및 개발의 원천으로 간주되어 왔습니다28,29. 애벌레 곰팡이는 나비목의 유충에 있는 곰팡?...

공개

저자는 이해 상충을 보고하지 않습니다.

감사의 말

본 연구는 중국국가자연과학재단(31871244, 81973733, 81803652), 광둥성 자연과학재단(2019A1515011555, 2018A0303100007), 선전시 건강가족계획위원회재단(SZBC2018016), 선전시 룽강구 경제기술발전특별기금(LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361)의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

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