혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성

요약

우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.

초록

많은 인간 신경 장애는 두뇌에 있는 신경 세포 및 신경교 세포의 변성에 기인합니다. 약리학 및 기타 치료 전략의 한계로 인해 현재 부상또는 병에 걸린 뇌에 사용할 수있는 치료법이 없습니다. 세포 교체는 신경 퇴행성 조건에 대한 유망한 치료 전략으로 나타납니다. 현재까지, 신경 줄기 세포(NSC)는 태아 조직, 인간 배아 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 성공적으로 생성되었다. 변분화 과정은 다능성 줄기 세포의 생성으로 이어지는 새로운 인간 GPI 연결 당단백질의 활성화에 의해 시작되었다. 이러한 혈액 유래 만능 줄기 세포 (BD-PSC)는 밝은 필드와 면역 형광 현미경 검사법에 의해 나타난 바와 같이 신경 표현형을 가진 세포로 시험관내에서 분화한다. 전자 현미경 검사를 통해 이러한 세포의 초구조적 분석은 그들의 원시 구조뿐만 아니라 뉴런 형 형태와 세포 극성 특성을 확인합니다.

서문

기본 및 전임상 줄기 세포 연구 방법의 개발은 신경 질환에 대한 줄기 세포 기반 치료의 임상 적용을 장려합니다. 이러한 잠재적 치료는 기능적 회복^1로이어지는 인간 신경 세포의 생성 방법에 비판적으로 의존한다.

신경 줄기 세포 (NSC) 자체 갱신 하 고 성인 신경 발생 이라고 하는 프로세스에 평생 새로운 뉴런으로 분화. 만 매우 제한 된 뇌 영역 은 성인기에 신생아 뉴런을 생성 할 수있는 NsCs를 항구. 이러한 NSC는 학습과 메모리에 관여하는 성숙한 뉴런을 초래할 수 있으므로 분실되거나 손상된 뉴런을 대체할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 NSC는 제한된 양에 존재하고이 제한된 신경 발생은 청소년 발달 동안 급속하게^감소2. 따라서 신경 세포의 다른 소스는 세포 치료 목적으로 고려되어야합니다.

퇴행성 신경 질환은 표준 약리학적 접근법을 사용하여 치료하기가 어렵습니다. 많은 치료 신경 장애를 수용 하기위한 새로운 치료 전략은 질병과 부상 조직의 세포 대체 요법에 기초. NSC 이식은 손상된 세포를 대체하고 유익한 효력을 제공할 수 있었습니다. 신경세포 교체를 위한 그밖 근원은 포유류 분폭물^3의내세포 질량에서 파생되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 및 ESC 같이 광대한 자기 갱신 능력을 가지고 있고 각종 세포 혈통으로 분화할 수 있는 iPSCs^4를포함합니다. 또한 만능 상태^5를피하는 인간 섬유아세포로부터 직접 리프로그래밍하여 NSC를 생성할 수 있다.

세포 대체 요법은 여전히 어려운 문제입니다. ESC, 태아 또는 iPS는 많은 난치성 신경 질환을 치료하기위한 신경 세포의 세대에 대한 소스가 될 수 있지만 손상된 조직의 자가 성 성인 SCs 세포 교체는 면역학적, 윤리적 및 안전 문제를 우회하는 더 나은 대안입니다.

PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN의 인산화를 통해 항체-교차연결에 의한 인간 GPI 연계 단백질의 활성화는 혈액 전구 세포의 비차별화를 시작하고 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)^6. 이 세포는 밝은 필드, 면역 형광 및 전염 전자 현미경 검사 (TEM) 분석을 통해 확인 된 바와 같이 신경 세포를 향해 시험관 내 분화.

이 작품에서 우리는 BD-PSC의 GM 없는 생성 및 그들의 성공적인 재 분화 신경 표현형을 가진 세포로 기술합니다.

프로토콜

실험을 수행할 때 윤리 승인을 얻었다.

1. 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 (PBMC)

1. 모든 기부자가 기관 지침에 따라 혈액을 철회하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명하도록 하십시오.
2. 표준 프로토콜에 따라 숙련 된 의료 인력에 의해 건강한 기증자로부터 30 mL의 혈액을 가져 가라.
3. 밀도 그라데이션 미디어를 통해 PBMC를 분리합니다. 인산염 완충식염(PBS)으로 희석된 1:1 혈액의 25mL, 30분 동안 300 x g의 원심분리기를 사용하여 10mL의 미디어를 사용하십시오.
4. 파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 위상 간 층을 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기의 5mL로 10분 간 300 x g로 세척합니다.
5. 카운팅 챔버를 사용하여 표준 방법으로 셀 수를 계산합니다.

2. PBMC의 표면에 교차하는 항체에 의한 인간 GPI 고정 당단백질의 활성화

1. 6 x 10⁶ 단핵세포(MNC)를 15mL 튜브에 배치하고 37°C에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 가진 PBS에서 30분 동안 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체(30 μg/mL)를 가진 세포를 배양하여 항체 교차 연결을 수행한다.
2. 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 이스코브의 수정된 덜벡코의 배지로 인큐베이션 배지를 교체하십시오.
3. 15mL 폴리스티렌 튜브에서 세포를 성장시키고, 튜브를 37°C, 8-10일 동안 5%_CO2로 인큐베이터에 넣습니다(흔들림 없이). D5에, 각 15 mL 튜브에 10 % FBS로 보충 이스코브의 매체의 추가 1-2 mL을 추가합니다.

3. 새로 생성된 분화 세포의 정렬

1. 자동 세포 카운터(18 μL 셀 서스펜션 + 2 μL 형광 염료) 또는 카운팅 챔버를 가진 셀수를 계산합니다.
2. 원심분리기 배양 셀 서스펜션(5-7 x 10^6)은300 x g에서 10분 동안 멸균 파스퇴르 파이펫으로 생성된 슈퍼네티트를 흡인시합니다.
3. 미리 냉각된 PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2mM EDTA의 90 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단한다.
4. CD45 양성 나노 크기의 마그네틱 비즈(80 μL)를 세포 현탁액에 넣고 얼음에 15분 동안 배양합니다.
5. PBS 버퍼 와 원심분리기의 2mL를 300 x g에서 10 분 동안 추가하여 세포를 씻으하십시오.
6. PBS 버퍼의 500 μL에서 셀을 다시 일시 중단합니다.
7. 미리 냉각된 PBS 버퍼500μL로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.
8. 셀 서스펜션을 기둥에 놓고 500 μL의 PBS 버퍼(2회)와 CD45 네거티브 셀을 함유한 원심분리기 흐름으로 세척한다. 1% BSA로 보충된 이스코브의 매체에서 수집합니다.
9. 카운팅 챔버의 셀을 계산합니다.

4. 새로 생성된 줄기 세포의 신경 분화를 위한 세포 배양 접시 준비

1. 성장 하는 신경 세포를 위한 폴리 L-ornithine 및 라미닌배양 혈관을 코팅.
2. 유리 커버립을 4웰 플레이트에 넣고 ddH₂O.에서 1:5 희석 된 폴리 L-ornithine (0.1 mg / mL in ddH₂O)로 코팅하여 커버립을 37 °C 인큐베이터에 1 시간 동안 배치합니다. 그런 다음 ddH₂O로 씻으시다.
3. 천천히 라미닌 (0.5-2.0 mg /mL)을 해동하고 커버립의 상단에 추가합니다. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
4. D-MEM/F12의 49mL, N2 보충제의 500 μL, 비필수 아미노산(NEAA)의 400μL, 기본 FGF 용액 20 ng/mL 최종 농도(100μg/mL 스톡 용액에서 제조), 그리고 2ng/mL 농도로 구성된 신경 유도 매체 N2를 준비한다.
5. 파이펫팅으로 과도한 라미닌을 제거하고 배양 요리에 뉴런 배지 N2를 추가하십시오.

5. 신경 분화 혈액 세포의 배양

1. 배양 BD 유래 CD45 네거티브 셀은 라미닌/오르니틴 코팅 유리 커버립을 2일 동안 인큐베이터에서 37°C, N2 배지에서 5%_CO2로 분리하여 새로 BD 생성 된 세포의 뉴런 분화를 개시한다.
2. 배양 세포는 신경 물질 배지 48mL, L-글루타민 500 μL, B27 보충제 1mL, NEAA 500 μL, 재조합 인간 신경교에서 유래한 신경영양계수(GDNF) 5μg/250 μL로 구성된 뉴런 분화 배지에서 더 많은 BS%에서 1μg/250 μL, BS%에서 150 μL/250 μL로 구성된 세포 PBS/0.1% BSA및 아스코르브산 용액 의 50 μLPBS에서 5 μg/200 μL에서 재조합 인간 뇌 유래 신경 영양인자(BDNF)의 50 μL 및 PBS에서 아스코르브 산 용액 2.9 g/50 mL의 50 μL. 플레이트를 인큐베이터에 37°C 및 5% CO_2로놓습니다.

6. 혈액 유래 신경 세포의 면역 형광 현미경 분석

1. 위에서 설명한 바와 같이 세포를 16일 동안 배양하고 미디어를 제거한다.
   1. 멸균수 75mL, 파라포름알데히드 4g으로 구성된 사전 데운 고착처리된 인큐베이션을 증식합니다. 필요에 따라 10 N NaOH를 추가하고 용액이 지워날 때까지 저어줍니다. 그런 다음 10x PBS 10mL, MgCl_2mL 0.5mL, 0.5M EGTA 2mL, 자당 4 g를 추가합니다. 6 N HCl로 pH 7.4에 titrate, 15 분 동안 멸균 수의 100 mL에 가져, 마르첸코 등^{7. 7.}
   2. 고정을 버리고 매번 5 분 동안 세포를 3 번 씻으십시오. 즉시 새로 만든 0.3 % 트리톤 X 용액을 추가하고 5 분 동안 세포를 permeabilize. PBS로 3번 세척하고 PBS및 5% BSA로 만든 블로킹 솔루션을 추가합니다.
   3. 로커 플레이트의 실온에서 셀을 1시간 동안 차단합니다.
   4. 1% BSA/PBS에서 항체의 적절한 희석을 준비하고 실온에서 1.5 시간 동안 로커 플레이트에 항체 희석으로 세포를 배양한다. 각각 5 분 동안 PBS로 세포를 3 번 세척하고 DAPI로 세포를 배양하고 현미경에 시각화를위한 장착 매체로 커버립을 장착하십시오.
      참고: 본 실험에 사용된 직접 표지된 항체는 재료표에기재되어 있다.

7. 새로 생성된 세포의 전송 전자 현미경 분석

1. 8웰 챔버 슬라이드에서 TEM에 대한 세포를 시드합니다.
2. 37°C에서 1시간 동안 3.5% 글루타랄데히드로 세포를 고정하고, 실온에서 2% OsO_4에서 2% 후고리, 2시간 30분 동안 어둠 속에서 2%의 우란 아세테이트를 2% 소변을 드린 후 수정한다.
3. 마지막으로, 증류수에 세포를 헹구고 에탄올에 탈수하고 하룻밤 에폭시 수지에 담근다. 다음 날 수지 경화에 대해 72h의 시료를 70°C 오븐으로 옮기다.
4. 임베디드 세포 배양을 챔버 슬라이드및 접착제에서 아랄디테 블록으로 분리합니다.
5. 기계로 직렬 반박형 섹션(1.5 μm)을 자르고, 유리 슬라이드에 장착하고, 1% 토루이딘 블루로 가볍게 얼룩을 감습니다.
6. 접착제는 반박면을 선택하여 아를디테 블록을 차단하고 유리 슬라이드에서 분리하여 반복된 동결(액체 질소)과 해동을 반복합니다.
7. 기계로 초박형 섹션(0.06-0.08 μm)을 준비하고 납 구연산염과 더욱 대조를 이룹니다.
8. 디지털 카메라로 전자 스캐닝 현미경을 사용하여 현미경을 얻을 수 있습니다.

결과

결과는 이 새로운 GM 자유로운 방법이 인간 게놈에 직접 행동하지 않고 그들의 가장 원시적인 상태로 혈액 전구 세포를 되돌릴 수 있다는 증거를 제공합니다.

앞서 우리는 이전에 GPI 연결 단백질 특정 항체 교차 연결이 PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN 강화 조절을 통해 WNT, NOTCH 및 C-Kit와 같은 고도의 발달 관련 유전자의 개시를 보여주었으며, 따라서 HSC의 세대와^2세대,2세대, ...

토론

본 업무에서 기재된 인간 세포를 재프로그래밍하는 비GM 방법은 비조작된 인간 말초 혈액으로부터 얻은 전 생체 생성 및 자가 갱신 PSC의 확장으로 이어지는 비분화 과정을 개시하는 GPI 연계 인간 막 당단백질 의 뒤에 있는 신호(들) 기계류의 핵 활성화에 기초한다. 이러한 세포는 적절한 배지에서 배양될 때 상이한^{세균층(6)에}속하는 세포로 재분화할 수 있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400