오스트레일리아 싱크로트론의 직렬 결정학 측정을 위한 지질 주입 프로토콜

요약

이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.

초록

호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 시설이 개발되었습니다. 이 시설은 실온에서 많은 수의 작은 결정을 측정하기 위해 대용량 분자 결정학 (MX2) 빔 라인의 일환으로 고점성 인젝터 인Lipidico를 통합합니다. 이 기술의 목표는 크리스탈을 유리 주사기로 재배/전송하여 직렬 결정학 데이터 수집을 위한 인젝터에 직접 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 인젝터의 장점은 스트림의 중단없이 유량의 변화에 신속하게 대응하는 기능을 포함한다. 이 높은 점도 인젝터 (HVI)에 대한 몇 가지 제한은 허용 된 샘플 점도에 대한 제한을 포함하는 존재 >10 Pa.s. 스트림 안정성은 샘플의 특정 특성에 따라 문제가 될 수도 있습니다. 샘플을 설정하고 호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 인젝터를 작동하는 방법에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법은 리소지메 결정의 높은 점성 매체(실리콘 그리스)로의 전송을 포함한 시료의 제조를 시연하고, MX2에서 데이터 수집을 위한 인젝터의 작동을 보여 준다.

서문

직렬 결정학(SX)은 X선 자유 전자 레이저(XFELs)^1,2,3,4의맥락에서 처음에 개발된 기술이다. 고정 대상 접근법은 SX^5,6,7,전형적으로 사용될 수 있지만 인젝터 시스템은 연속 스트림에서 X선 빔에 크리스탈을 전달하기 위해 사용됩니다. 많은 수의 결정으로부터의 데이터를 결합하기 때문에 SX는 실험 중에 모든 결정 정렬의 필요성을 피하고 실온^8,9에서데이터를 수집할 수 있게 한다. 적합한 인젝터의 도움으로, 결정은 X선 상호작용 영역으로 하나씩 스트리밍되고 그 결과 회절 데이터는 영역 검출기^9,10에서수집된다. 현재까지 SX는 종래의 결정학을 사용하여 측정하기에는 너무 작은 결정을 포함하여^{1,11,12,13의} 다수의 단백질 구조를 해결하는 데 성공했습니다. 또한 XFEL의 펨토초 펄스 지속 시간을 활용하여 시간 해결 된 분자 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 광학 레이저 소스와 펌프 프로브 반응을 시공함으로써, 광시스템 II^14,15,광활성 황색 단백질^16,17,사이토크롬 C 산화제 18, 박테리오호도프신(19,^20,21)에서심층적인 연구가 수행되었다. 이러한 연구는 시간 해결된 생물학적 과정을 이해하기 위한 직렬 결정촬영의 중요한 잠재력을 보여주는 빛 활성화 에 따라 발생하는 전자 전달 역학을 조사했습니다.

직렬 결정학의 개발은 또한 싱크로트론 소스^{9,12,20,22,23,24에서}점점 더 널리 퍼지고^있다. Synchrotron 기반 SX를 사용하면 적절한 인젝터 시스템을 사용하여 실온에서 많은 수의 개별 결정을 효율적으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 더 작은 결정에 적합하므로 데이터를 수집하기 위해 빠른 프레임 속도 검출기를 요구하는 것 외에도 마이크로 집중 빔도 필요합니다. 기존의 결정예촬영과 비교하여, SX는 X선 빔에 개별 결정의 장착 및 정렬을 포함하지 않습니다. 다수의 개별 결정으로부터의 데이터가 병합되기 때문에, 각 결정에 의해 수신된 방사선 량은 종래의 결정예예촬영에 비해 실질적으로 감소될 수 있다. 싱크로트론 SX는 또한 밀리초 정권에 이르기까지 시간 해결 된 반응의 연구에 적용 될 수 있으며, 충분히 높은 프레임 속도를 가진 검출기가 사용할 수 있는 경우 (예를 들어, 100 Hz 이상). 몇몇 직렬 결정학 실험은 XFEL 근원에서 처음 개발된 인젝터를 사용하여 싱크로트론에서 수행되었습니다^20,22,23. 인젝터의 두 가지 가장 일반적인 유형은 가스 동적 가상 노즐 (GDVN)²⁵ 및 고점성 인젝터 (HVI)^{9,24,26,27,28이다.} GDVN은 낮은 점도, 액체 샘플을 주입하는 데 이상적이지만 안정적인 스트림을 달성하기 위해 높은 유량이 필요하며, 이는 높은 시료 소비율로 이어집니다. 대조적으로, HVI는 훨씬 낮은 유량에서 안정적인 스트림의 생성을 허용하는 높은 점도 샘플에 적합하여 훨씬 낮은 샘플 소비로 이어집니다. 따라서 HVI 인젝터는 점성 담체가 바람직하다는 샘플(예: 막 단백질용 지질 계주) 및/또는 다량의 시료를 사용할 수 없는 시료의 전달을 선호합니다. SX 인젝터는 일반적으로 사용하기 가 어렵고 운영에 광범위한 교육이 필요합니다. 그들은 또한 샘플이 전문 저수지에 로드되어야하기 때문에 긴 샘플 전송 프로토콜을 포함하며, 일반적으로 샘플이 '죽은 부피'에서 또는 연결의 누출을 통해 손실되는 것과 관련된 고위험이 있습니다. 따라서, X선 빔에 도달하는 샘플이전에 손실을 완화하기 위해 인젝터 설계를 최적화하는 것이 바람직하다.

최근에는 아이거 16M 검출기를 사용하여 리소지메 표적을 가진 Lipidico^23을 사용하여 첫 번째 SX 결과가 발표되었습니다. 이 인젝터 설계는 초기 결정화에서 인젝터로 의결정 전달에 관련된 단계수를 최소화한 다음 X선 빔에 시료를 전달하는 데 관련된 단계 수를 최소화하여 샘플 낭비를 제한합니다. 이 원고는 샘플 준비부터 동일한 결정화 용기를 사용하여 주사 공정으로 이동하고 마지막으로 데이터 수집을 통해 샘플 전송 절차를 설명하고 시연합니다. 인젝터의 작동도 설명되어 있다.

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프로토콜

1. 유리 주사기를 사용하여 높은 점성 매체에서 결정의 준비

1. 결정 용액을 부드럽게 원심분리(~1,000xg, 22°C에서 ~10분)하여 부드러운 크리스탈 펠릿을 형성하고 과잉 버퍼를 제거합니다. 이것은 데이터 수집에 사용될 수 있는 펠릿에 있는 결정의 고농도 귀착될 것입니다.
   참고: 점성 매체의 희석을 방지하기 위해 이 단계에서 결정 농도를 증가시다. 각 시료에 대한 점성 매체의 비율을 최적화하여 고농도의 결정을 획득하는 동시에 미디어에 대한 높은 점도를 유지합니다. 결정용액을 원심분리하여 펠릿을 형성하고 과도한 버퍼를 제거하여 다마닌 에 설명된 바와 같이 용액의 결정 농도를 증가시다. al.²⁹.
2. 커플러로 100 μL 주사기 두 개를 설정합니다.
3. 첫 번째 주사기 의 끝에 커플러를 고정하고 주사기의 상단에 결정 용액의 28 μL을 추가합니다. 천천히 플런저를 주사기 의 상단에 삽입하고 부드럽게 결합기 팁의 끝으로 용액을 밀어 형성되는 기포를 제거합니다. 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 따라 이 작업을 수행합니다.
   참고: 고점성 매체에 첨가되는 결정의 부피는 전체 시료의 점도를 크게 변화시키지 않으면 다양할 수 있다.
   1. 첫 번째 방법: 급속한 압력 변경을 사용하여 기포를 파열시세요.
      1. 장갑을 낀 손가락 한 개를 무딘 커플러 바늘 점 위에 조심스럽게 놓고 (매우 부드럽게) 압력을 가하여 씰을 만듭니다. 이 바늘 스틱 부상이 발생할 수 있기 때문에 너무 많은 압력을 적용하지 마십시오.
      2. 이제 플런저를 다시 당겨 바늘 지점에서 용액을 끌어내어 주사기에 압력이 축적됩니다.
      3. 무딘 바늘 끝에서 장갑을 낀 손가락을 제거하여 주사기 상단의 압력을 신속하게 해제합니다. 손가락이 제거될 때 샘플이 팁에 너무 가까워지면 시료손실이 발생할 수 있습니다. 주사기 내의 압력의 급격한 변화는 기포를 파열합니다. 모든 거품이 제거될 때까지 반복합니다.
   2. 두 번째 방법: '인간 원심분리기'를 사용하여 기포를 제거합니다.
      1. 주사기를 한 손에 놓고 바늘이 위쪽으로 향하고 플런저가 두 손가락 사이에 끼어 움직이면 움직일 수 없습니다.
      2. 주사기를 한 방향으로 2-3번 빠르게 회전하면 시료의 원심력은 주사기에서 기포를 강제로 꺼낼 수 있습니다. 너무 느리게 샘플을 잃어 버릴 수 있습니다.
      3. 기포가 남아 있는 경우 기포에 대한 주사기를 검사하여 모든 기포가 제거될 때까지 1.3.2.1 - 1.3.2.2 단계를 반복합니다.
4. 미세주걱을 사용하여 두 번째 주사기의 상단에 직접 높은 진공 실리콘 그리스의 ~ 42 μL을 추가합니다. 플런저를 끝까지 밀어 모든 기포를 제거하고 주사기 의 끝에 공기 간격이 없도록합니다.
   참고: 실리콘 그리스의 정확한 조성은 불활성 담체역할을 하기 때문에 중요하지 않습니다. 점도 값 >10 Pa.s 또는 약 60:40 실리콘 그리스의 결정 용액에 대한 비율은 주입에 최적이지만, 이는 시료의 정확한 특성에 따라 달라질 수 있다. 실리콘 그리스에 첨가된 결정 용액의 부피를 조정하여 논의에 설명된 바와 같이 혼합물의 결정 농도를 최적화합니다. 실리콘 그리스 이외의 고점성 매체는 시료(30,^31,32,33)와호환되는 한 사용할 수 있다.
5. 두 주사기 중 하나에 기포가 없는지 확인하고 커플러를 사용하여 주사기를 함께 부착하십시오. 손가락에서 생성 된 열로 인해 주사기를 따뜻하게하면 주사기의 끝만 그립하여 주사기를 수직으로 유지하면 샘플에 영향을 줄 수 있습니다.
6. 크리스탈 용액 측의 플런저를 부드럽게 우울시켜 실리콘 그리스에 섞은 다음 실리콘 그리스 측의 플런저를 밀어 서 샘플을 크리스탈 용액 쪽으로 밀어 넣습니다. 부드럽게, 샘플이 철저하게 혼합하고 균일 한 보이도록이 과정을 50 ~ 100 번반복합니다.
   참고: 결정이 점성이 높은 매체(예: 립디딕 입방상, LCP)에서 직접 재배되는 경우 1.1-1.6단계는 필요하지 않습니다. 주사기 내에서 커지는 결정을 위한 프로토콜은 리우 et.al 찾을 수 있습니다. ^34,35. 이 프로토콜을 따라 샘플 통합, 10단계, 모든 샘플이 하나의 주사기에 포함되고 결정화 버퍼가 제거됩니다. 이 프로토콜에 7.9MAG를 추가할 필요는 없습니다. 대신, 더 이상 액체가 주사기에 남아 있지 때까지 시료의 플런저를 부드럽게 밀어 주사기에서 모든 여분의 액체를 제거합니다.
7. 광학 현미경으로 결정을 시각화하거나 최상의 결과를 얻으려면 소량(~1 μL)을 유리 슬라이드에 추출하여 상단에 덮개 슬립을 놓습니다.
8. 결정 농도를 확인합니다.
   1. 광학 현미경 이미지를 사용하여 특정 영역에서 결정수를 계산하여 실리콘 그리스의 결정 농도를 결정한다. 최상의 결과를 위해, 높은 결정 적중률을 얻기 위해 미디어 전체에 균일하게 분배된 고밀도의 결정(>10⁶ 결정/mL)이 이상적입니다.
   2. 1.3 및 1.4 단계에서 점성 매체로 결정의 비율을 변경하여 주사기의 결정 농도를 조정합니다.
      1. 결정 농도를 감소시키기 위해, 1.4단계에서 실리콘 그리스/HV 매체의 양을 증가시키거나 결정화 버퍼로 용액을 희석하여 주사기의 주사기를 1.1단계에서 설정하여 주사기내의 결정을 희석시켰다.
      2. 결정 농도를 증가시키기 위해, 1.4 단계에서 실리콘 그리스의 양을 감소시키지만 10 Pa.s 이하의 점도를 감소시키지 않도록 주의하십시오.
         참고: 여기에서 보고된 결정 농도는 이 특정 시료 및 결정 크기에 최적화되었습니다. 그러나 이상적인 결정 농도는 결정 크기, 빔 크기, 바늘 내부 직경(I.D.) 및 사고 X선 플럭스에 따라 달라집니다. 이는 '좋기'로 간주되는 ~30%의 적중률로 적중률에서 확인할 수 있다. 실제로, 결정 농도는 원하는 적중률을 얻기 위해 빔 시간 동안 다른 샘플에 최적화되어야 한다. 고농도 크리스탈, 10⁹ 크리스탈/mL로 시작합니다. 결정 농도조정 절차는 리우 et.al 주어진다. ³⁵.
   3. 인젝터가 데이터 수집에 준비가 될 때까지 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
      1. 결정이 LCP에서 재배되면 밀봉하여 실온에서 최대 며칠 동안 주사기에 보관하십시오.
      2. 결정이 다른 고점성 매체(예: 실리콘 그리스)로 옮겨진 경우, 시간이 지남에 따라 결정의 안정성 테스트를 측정하기 전에 수행해야 합니다. 이렇게 하면 불활성 미디어(이상적으로 > 8h)에서 결정이 얼마나 안정되어 있는지, 데이터 수집시 시간 제한이 결정됩니다. 여기서 리소지메 결정은 실리콘 그리스에서 며칠 동안 안정적이었으며 광학 현미경을 사용하여 검사할 때 용해의 징후를 보이지 않았다.
9. 커플러를 분리하기 전에 모든 샘플을 하나의 주사기로 이동합니다. 주사기에서 커플러를 분리하고 주사 바늘을 부착합니다. 바늘을 주사기 의 바닥에 단단히 나사로 고정하고 누출을 방지하기 위해 단단히 고정되었는지 확인합니다. 이 실험에는 108 μm I.D. 바늘(바늘 길이 13mm, 포인트 스타일 3)이 사용하였다. 결정 크기와 빔 크기에 따라 51 μm 또는 108 μm I.D. 바늘을 부착합니다.
   참고: 빔 시간 이전에 샘플 스트림의 사전 테스트는 올바른 인젝터 바늘 크기를 선택할 수 있어야 합니다. 시료 특성(즉, 점도, 충전, 완충 조성)과 바늘 I.D.에 따라 샘플이 다르게 흐릅니다. 따라서, 데이터 수집 시 신호 대 잡음 비율을 최대화하기 위해 가능한 가장 작은 I.D. 바늘로 가장 안정적인 스트림을 생성하기 위해 다양한 바늘 크기를 테스트하는 것이 좋습니다.
10. 인젝터가 이미 장착되고 빔 라인에 정렬되면 섹션 3로 이동하고 샘플 주사기를 인젝터에 직접 장착합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

2. 인젝터 장착 및 제어

1. 인젝터를 빔라인에 장착합니다. MX2 빔라인의 극저온 노즐을 제거하고 인젝터로 대체합니다. 극저온 노즐을 고정하는 클램핑 나사를 풀고 전동 단계 옆에 있는 브래킷에 부착합니다.
2. 검은 손잡이를 잡고 트롤리에서 인젝터를 들어 올려 전동 무대에 놓습니다.
   1. 전동 단계에 인젝터를 고정하려면; 손은 검은 색 클램핑 나사 손잡이를 조입니다.
3. 인젝터에 빈 주사기를 장착
   1. 인젝터 컴퓨터 제어 인터페이스(예: EPOS 위치 제어 소프트웨어)에서 소프트웨어 메뉴에서 도구 에서 호밍 모드를 선택합니다. 그런 다음 음극 한계 스위치를 선택하고 호밍을 시작하여나사가 나사 아래에 맞게 주사기에 충분히 맞을 때까지 소프트웨어를 실행하도록 합니다. 감독없이 실행하려면 제한 스위치가 나사를 자동으로 중지합니다.
   2. 주사기 홀더의 슬릿을 통해 바늘을 삽입하여 빈 ('더미') 주사기를 인젝터에 장착합니다. 브래킷에 주사기를 정렬합니다.
   3. 두 개의 O 링으로 주사기를 고정합니다.
      1. 주사기의 중간 부분에 첫 번째 O 링을 감아 주사기의 양쪽에 있는 후크에 부착합니다.
      2. 주사기의 상부 부분에 있는 후크 주위에 두 번째 O 링을 반복한 다음 데모 및 도 1B에표시된 것처럼 유리 주사기 의 상단에 O 링의 한 부분을 놓습니다.
4. 인젝터를 X선 빔에 정렬
   1. 빔라인 제어 소프트웨어를 통해 인젝터를 X선 상호작용 지점으로 이동합니다. 이는 인라인 카메라를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 빔의 크기와 위치는 화면상의 적십자에 의해 표시되고 전동 단계는 바늘을 X선 상호 작용 영역과 정렬하도록 이동할 수 있다.
   2. 바늘을 붉은 십자가와 정렬하기 위해 스테이지의 x 및 y 위치를 조정합니다.
   3. 바늘 끝이 초점에 올 때까지 z 위치를 조정합니다.
   4. 주사기 팁이 빔라인 카메라에 의해 생성된 광학 현미경 이미지에서 보이는 십자선과 만나는지 확인하여 바늘 끝과 X선 빔의 정렬을 시각적으로 확인합니다.
   5. 바늘 끝이 정렬되면 십자선 ~ 100 μm 위의 팁을 이동합니다. 이것은 바늘 끝에서 엑스레이 산란을 제거합니다.
      참고: 싱크로트론의 MX2 빔라인에 인젝터를 장착하고 정렬하는 것은 빔라인 과학자들에 의해 수행되어야 하며 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

3. 샘플 주사기 장착

1. 다음 단계 2.3에 의해 샘플 주사기로 빈 주사기를 교체합니다.
2. 샘플 주사기 플런저 헤드에 인젝터 캡을 놓습니다.
3. 드라이브 나사를 캡 의 맨 위로 이동합니다.
4. 인젝터 제어 소프트웨어에서 속도 모드를 선택합니다.
5. 설정 값으로 입력 3000 rpm (~115 nL/s)을 설정 값으로 입력하고 설정 값 적용을누릅니다.
6. 드라이브 나사가 주사기 플런저 헤드의 캡에 닿으면 모터를 중지합니다.
   1. 나사가 캡에 접근할 때 설정 값을 '0'으로 변경하여 인젝터 제어 소프트웨어에서 rpm 값을 0으로 설정합니다.
   2. 접촉이 이루어지면 설정 값 적용을 눌러 나사를 즉시 중지하여 사전 설정 값을 활성화합니다.
7. 캡을 부드럽게 흔들어 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
   참고: 컨트롤 소프트웨어의 설정 값 상자에 새 설정 값을 입력할 때마다 설정 적용 값을누른 후에만 활성화됩니다.

4. 인젝터 실행

1. 캡 드라이브 나사가 플런저 상단과 단단히 접촉한 후 rpm 설정 값을 100으로 변경합니다. 이는 ~ 4nL/s와 동일합니다.
2. 샘플이 처음 나올 때 바늘 끝을 육안으로 검사하거나 바늘의 빔 라인 카메라 이미지를 보고 샘플이 바늘 끝에서 돌출되기 시작할 때 관찰합니다.
3. 오두막을 수색하고, 오두막 문을 닫고, 엑스레이 빔을 켭니다. 이 시점에서 인젝터는 오두막 외부에서 원격으로 작동해야합니다.
4. 안정적인 스트림이 생성될 때까지 rpm을 조정합니다.
   1. rpm 설정 값을 90으로 줄입니다.
   2. 반복 단계 4.4.1, 10의 단위로 rpm 설정 값을 감소, 스트림을 느리게하지만 여전히 안정적인 스트림을 유지합니다. 실리콘 그리스의 경우 30 rpm의 값을 사용했습니다.
      참고: 일반적인 rpm 범위는 샘플 특성 및 X선 노출 시간에 따라 30~ 100rpm(1 ~ 4nL/s) 사이입니다. 일반적으로 rpm은 안정적인 스트림을 유지하면서 가장 느린 유량(샘플 소비를 최소화)하도록 조정해야 합니다.
5. 잘 흐르지 않는 샘플 스트림을 관리합니다.
   1. 스트림이 더 똑바르게 될 때까지 rpm 설정 값을 10의 단위로 계속 늘린다. 스트림이 안정화되지 않으면 rpm 설정 값을 최대 값으로 100rpm으로 늘린 후에도 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 구현하여 안정성을 개선하려고 노력한다.
      1. 첫 번째 방법: 샘플 스트림 아래에 폴리스티렌 샘플 포수를 삽입하여 샘플을 안내합니다. 이 방법은 고충전 된 샘플 스트림에 적합합니다.
      2. 두 번째 방법: 샘플 포수에 벤츄리 흡입 깔때기를 삽입합니다. 깔때기에 공기를 공급하려면 허치에 있는 공기 콘센트 튜브에 연결합니다. 이 방법은 스트림의 전하에 샘플 흐름을 지시하고 안정화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 일정하고 안정적인 스트림이 달성되면 일반 X선 결정학 실험에 따라 데이터 수집을 시작하고 검출기 거리를 최적화합니다.
   참고: rpm은 보충 정보인 '지질 장치 계산기'에서 제공된 변환 테이블을 사용하여 유량으로 변환됩니다. rpm 값, 바늘 직경 및 주사기 볼륨을 입력하여 이 계산기를 사용하여 유량을 계산합니다.

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결과

Lipidico는 MX2(그림 1)에사용하기위한 대체 배달 시스템으로 구축 된 HVI입니다. 크리스탈이 립디큐피너 단계에서 재배되거나 고점성 불활성 매체로 옮겨지는 SX에 이상적입니다.

리조지메 결정과 혼합된 인젝터 애플리케이션 실리콘 그리스를 시연하기 위해 호주 싱크론의 MX2 빔라인에서 SX 데이터를 수집하는 데 사용되었다. MX2 빔라인에 인젝터를 탑재하?...

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토론

대체 HVI가 개발되어 싱크로트론 소스에서 SX 실험을 수행하는 데 이상적입니다. 기존 HV에 비해 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 기존의 결정학과 SX 를 빠르게 전환할 수 있도록 빔라인에 설치하기 쉽고, MX2의 설치 및 정렬에 불과 ~30분이 소요된다. 둘째, 결정을 성장시키는 데 사용되는 샘플 주사기는 직접 주입을 위한 저수지로서 사용될 수 있으며, 시료 전달 시 낭비를 제한할 수 있다. 샘플 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hen eggwhite lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon grease	Dow Corning	Z273554-1EA	Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector needle (108 µm ID)	Hamilton	part No: 7803-05	www.hamiltoncompany.com
Glass gas-tight syringes, 100 µl	Hamilton	part no: 7656-01	Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com
LCP syringe coupler	Formulatrix	209526	Syringe coupler to mix the samples
Lipidico injector	La Trobe Univerity/ANSTO		This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility