후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

요약

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

초록

세포 표현형은 다른 방법으로 역전되거나 변형될 수 있으며, 각 기술에 특정한 장점과 한계가 있다. 여기서 우리는 화학적 후성 유전 적 지우기와 메카노 센싱 관련 단서의 사용을 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 새로운 전략을 설명합니다. 두 가지 주요 단계가 필요합니다. 첫 번째 단계에서, 성숙한(말단 분화된) 세포는 후성유전학적 지우개 5-아자-시티딘에 노출되어 다능성 상태로 그들을 구동시킨다. 프로토콜의 이 부분은 세포 운명 및 분화를 조절하는 후성유전학적 메커니즘에 대한 이해의 증가에 기초하여 개발되었으며, 후성유전학적 개질제를 사용하여 세포 분화 상태를 지운 다음 일시적인 높은 가소성 창으로 구동하는 것을 포함한다.

두 번째 단계에서, 지워진 세포는 액체 대리석으로도 알려진 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 마이크로 생물반응기에 캡슐화되어 획득한 높은 소성을 연장하고 안정적으로 유지하기 위해 3D 세포 재배열을 촉진합니다. PTFE는 비 반응성 소수성 합성 화합물이며 그 사용은 전통적인 2D 배양 시스템에서 달성 될 수없는 세포 미세 환경의 생성을 허용합니다. 이 시스템은 바이오 메카노센싱 관련 단서에도 불구하고 다능성의 유지를 장려하고 강화합니다.

여기에 설명 된 기술 절차는 성인 체세포에서 높은 가소성 상태의 유도 및 유지를 허용하는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 시험된 모든 포유동물 종에서 높은 가소성 세포의 유도를 허용하였다. 유전자 형질감염의 사용을 수반하지 않으며 바이러스 벡터가 없기 때문에, 번역 의학 응용을 위한 주목할 만한 기술적 진보를 나타낼 수 있다. 더욱이, 마이크로바이오리액터 시스템은 높은 가소성 세포, 즉 ESC, iPSCs, 후성유전학적으로 소거된 세포 및 MSCs의 장기 배양을 허용하는 특정 마이크로환경을 시험관내 재생성함으로써 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 제공한다.

서문

지난 수십 년 동안, 세포 투입 및 분화를 향한 단방향 진행에 대한 널리 받아 들여지는 개념이 완전히 개정되었습니다. 세포 사양을 되돌릴 수 있고, 말단으로 분화된 세포는 다른 방법을 사용하여 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 밀릴 수 있다는 것이 입증되었다.

제안 된 몇 가지 방법 중 가장 유망한 방법 중 하나는 세포를 소위 화학적으로 유도 된 다능성으로 유도하기 위해 화학 화합물을 사용하는 것입니다. 이 접근법에 사용 된 소분자는 성인 성숙 세포의 후성 유전 학적 서명과 상호 작용하고 수정할 수있어 트랜스제닉 및 / 또는 바이러스 벡터^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}의 필요성을 피할 수 있습니다. . 최근 수많은 연구에 따르면 하이퍼메틸화 유전자 11,12,13,14,15의 재활성화를 유도하는 특정 생화학적 및 생물학적 자극을 제공함으로써 세포를 한 표현형에서 다른 표현형으로 전환시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 탈메틸화 사건은 말단으로 분화된 세포를 원시적 선조, 다능성 또는 높은 가소성/다능성 세포 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10으로 전환시키는 것을 허용한다.

동시에, 많은 연구들이 최근 메카노센싱 관련 단서에 대한 이해, 더 구체적으로는 기계적 힘을 사용하여 세포 가소성 및/또는 분화에 직접적으로 영향을 미칠 가능성에 초점을 맞추고 있다^16,17,18,19. 실제로, 세포외 기질 (ECM)이 세포 운명의 조절에 중요한 역할을한다는 것이 명확하게 입증되었습니다. 특히, ECM에 의해 생성된 생체역학적 및 생물물리학적 신호는 분자 메커니즘 및 신호전달 경로를 직접 조절하여 세포 거동 및 기능^(20,21)에 영향을 미친다. 이러한 최근의 데이터는 생체 내 세포 미세 환경을보다 밀접하게 모방하고 세포 행동을 유도하는 기계적 및 물리적 자극을 복제하는 새로운 3D 배양 시스템의 개발로 향하는 길을 열었습니다.

여기서는 화학적 후성유전학적 지우기와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 단계에서, 세포는 탈메틸화 분자 5-아자-시티딘 (5-aza-CR)과 함께 인큐베이션된다. 이 작용제는 직접 10-열한 전좌 2 (TET2)-매개 작용^8,10 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT)^22,23의 간접적 억제의 조합 효과를 통해 상당한 글로벌 DNA 탈메틸화를 유도할 수 있다. 이 단계는 다능성 관련 유전자 발현의 후속 재활성화와 함께 후성유전학적 블록의 제거를 유도하고, 따라서, 높은 가소성 세포 1,2,3,8,10^, 이하 "후성유전학적으로 소거된 세포"로 지칭된다. 두 번째 단계에서, 세포는 3D 배양 시스템에 캡슐화된다. 이를 위해, 비반응성 소수성 합성 화합물 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 입자 크기가 1 μm)을 마이크로생물반응기로 사용하며, 이는 전통적인 2D 배양 시스템(¹⁰)의 사용을 통해 달성할 수 없는 세포 미세환경의 생성을 허용한다. PTFE 분말 입자는 세포가 다시 현탁되는 액체 방울의 표면에 부착되고, 내부 액체와 주변 환경(²⁴) 사이의 가스 교환을 허용하면서 지지 표면으로부터 액체 코어를 분리한다. 이렇게 얻어진 "PTFE 마이크로바이오리액터"는, "리퀴드 마블"로도 알려져 있으며, 세포들이 서로 자유롭게 상호작용하도록 장려하여, 3D 세포 재배열^(25,26,27)을 촉진하고^, 바이오메카노센싱-관련 단서들⁽¹⁰)에도 불구하고 획득된 높은 가소성 상태를 연장하고 안정적으로 유지한다.

프로토콜

모든 연구는 밀라노 대학의 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 동물 실험은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 출판 된 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드에 따라 수행되었습니다. 건강한 성인 개인으로부터의 인간 세포 분리는 밀라노의 Ospedale Maggiore Policlinico의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 우리 연구의 모든 방법은 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 피부 섬유아세포 분리

참고: 아래에 설명된 모든 절차는 마우스, 돼지 및 인간을 포함한 다른 포유동물 종으로부터 분리된 섬유아세포에 적용될 수 있다. 뮤린 세포를 7주령의 수컷 마우스로부터 분리하고, 돼지 피부 조직을 지역 도살장에서 수집하였다. 인간 세포는 서면 정보에 입각한 동의 후에 성인 환자로부터 분리되었다.

1. 0.1 % 돼지 젤라틴 용액을 준비하십시오.
   1. 돼지 젤라틴 0.1g을 무게로 100mL의 물에 녹인다. 사용하기 전에 오토클레이빙을 통해 젤라틴 용액을 살균하십시오.
   2. 35 mm 페트리 접시를 0.1% 돼지 젤라틴과 함께 코팅하여 준비된 용액 1.5 mL를 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
2. 약 2-5cm 길이의 포유류(마우스, 돼지 및 인간) 피부 생검을 절단하고 2% 항생제 항균 용액을 함유하는 둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣는다. 사용 전까지 + 4°C에서 보관하십시오.
   참고 : 생검 수집은 합의하에 그리고 윤리위원회의 승인 후에 확립 된 지침에 따라 수행되어야합니다.
3. 수집된 생검을 2% 항생제 항균 용액을 함유하는 신선한 멸균 PBS에서 세 번 광범위하게 세척한다.
4. 마지막 세척에서 생검을 수집하여 멸균 된 100mm 페트리 접시에 넣으십시오. 멸균 메스를 사용하여 약 2mm³ 크기의 조각으로 자릅니다.
5. 2시간 인큐베이션이 끝날 때, 35 mm 페트리 디쉬(단계 1.1.2에 기재됨)로부터 과량의 젤라틴 용액을 제거하고, 멸균 수술용 트위저를 사용하여, 즉시 5-6개의 피부 단편을 각각의 예비코팅된 배양 접시에 넣는다.
6. 단편을 100 μL 액적의 섬유아세포 분리 배지 (표 1)를 그들 각각에 첨가하여 적시다. 5%_CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다.
   참고: 배지가 증발하지 않도록 하려면 멸균수가 들어있는 100mm 이상의 페트리 접시 내에 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 페트리 요리를 모두 뚜껑을 닫으십시오.
7. 24시간 배양 후, 35 mm 배양 페트리 디쉬에서 배지의 양을 확인하였다. 필요한 경우, 500 μL의 섬유아세포 분리 배지를 첨가하여 단편을 습윤 상태로 유지한다.
8. 배지를 조심스럽게 제거하고 피펫을 사용하여 배양 후 적어도 2일마다 새로 고칩니다.
9. 섬유아세포가 피부 단편으로부터 성장하기 시작하면, 35 mm 페트리 디쉬(단계 1.5에 기재됨)에 넣고 세포 단일층을 형성하기 시작한다(보통 6일). 멸균 수술용 핀셋을 이용하여 피부 조각을 제거하고 2 mL의 섬유아세포 분리 배지에서 배양하였다.
10. 세포 단일층을 80% 합류될 때까지 5%_CO2 배양기에서 37°C에서 계속 배양하고 격일로 배지를 리프레시한다.

2. 섬유아세포 1차 세포주 배양

1. 섬유아세포가 80% 합류에 도달하면, 섬유아세포 분리 배지를 조심스럽게 제거하고 1% 항생제 항균 용액을 함유하는 PBS 3 mL로 세포를 3회 세척한다.
2. 세포 분리를 위해, 배양 접시에 0.25% 트립신-EDTA 용액 600 μL를 첨가하고, 3-5분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
3. 섬유아세포 배양 배지 5.4 mL를 첨가하여 세포가 배양 접시에서 분리되기 시작할 때 트립신을 중화시킨다(표 1).
4. 반복적이고 부드러운 피펫팅으로 세포를 제거합니다. 새로운 배양 접시 (젤라틴 제외)에서 플레이트 세포를 1 : 2와 1 : 4 사이의 통과 비율을 유지합니다 (성장 속도에 따라 다름).
   참고: 원심분리는 필요하지 않습니다.
5. 배양물에 세포를 유지하고 80 % confluency에 도달 할 때까지 2 일마다 배지를 변경하고 통과시킵니다.
   참고 : 활발한 성장을 유지하기 위해 일주일에 두 번 섬유 아세포를 전파하십시오.

3. 5-aza-CR에 섬유아세포 노출

1. 신선한 1 mM 5-aza-CR 원액을 준비하십시오.
   1. 2.44 mg의 5-aza-CR을 재가량 10 mL의 DMEM 고포도당에 용해시킨다. 볼텍싱하여 분말을 재현탁하십시오. 0.22 μm 필터로 용액을 멸균하십시오.
      참고: 5-aza-CR 원액은 사용 직전에 준비해야 합니다.
   2. 섬유아세포 배양액 1 mL에 5-aza-CR 원액(3.1.1.) 1 μL를 희석하여 5-aza-CR 작업액을 제조하였다.
      참고: 5-aza-CR 작동 용액의 농도는 1 μM 1,2,3,8,9입니다.
2. 앞서 기술한 바와 같이 세포를 트립신화하고(2.1.-2.3.) 반복적이고 부드럽게 피펫팅함으로써 세포를 제거한다.
3. 세포 현탁액을 수집하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
4. 실온에서 광학 현미경 하에서 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수한다. 1 μM 5-aza-CR로 보충된 섬유아세포 배양 배지 30 μL에 4 x 10⁴ 세포를 수득하기 위해 세포를 재현탁하는데 필요한 배지의 부피를 계산한다(단계 3.1.2 참조).
   참고: 사용할 수식은 챔버의 특정 유형에 따라 다릅니다.
   
5. 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 150 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 1 μM 5-aza-CR로 보충된 섬유아세포 배양 배지로 펠렛을 재현탁시켰다(단계 3.1.2 참조). 사용되는 섬유아세포 배양 배지의 부피에 대해서는 단계 3.4를 참조한다.
   주: 음성 대조군으로서, 세포를 5-aza-CR 없이 섬유아세포 배양 배지에 동일한 농도로 재현탁시키고 PTFE 분말로 세포 캡슐화를 진행한다(단계 4.1.-4.13.).

4. PTFE 마이크로 생물 반응기에서 섬유 아세포 캡슐화

1. 35mm 페트리 접시에 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 분말을 채워 침대를 만듭니다(그림 1A).
   참고: 액체 대리석 접착을 피하기 위해 35mm 세균학 페트리 접시를 사용하십시오. 얇은 소수성 및 다공성 쉘을 얻기 위해, 평균 입자 크기가 1 μm인 PTFE 분말을 사용하고 최대 분쇄 2.0 NPIRI로 제작하였다. 이것은 가스 투과성 액체 대리석의 생성을 허용합니다. 더욱이, 반투명 코팅은 실시간으로 세포 응집 과정의 관찰을 용이하게 하고, 입자 크기가 커질수록 높은 증발, 구형 형상의 기형 및 손실, 및 마이크로생물반응기의 조기 용해를 야기할 수 있는 높은 다분산성을 유도한다.
2. 4 x 10^{4 세포가} 들어있는 30 μL 단일 액적(단계 3.4.- 3.5 참조)을 파우더 베드 상에 분주한다(그림 1B).
3. 35mm 페트리 접시를 원형 운동으로 부드럽게 회전시켜 PFTE 분말이 액체 방울의 표면을 완전히 덮도록 하여 액체 대리석 마이크로 생물반응기를 형성합니다(그림 1C).
4. 대리석의 직경을 수용하기 위해 가장자리에서 자른 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 마이크로 생물 반응기를 집어 들으십시오 (그림 1D, E). 액체 대리석 마이크로 생물반응기를 깨끗한 박테리아학 페트리 접시 상에 플레이트화하여 안정화시킨다(도 1F).
   참고: 팁 내부의 대리석을 잡기 위해 마찰을 일으키려면 피펫 끝을 액체 대리석 직경보다 약간 작은 직경으로 자릅니다.
5. 액체 대리석 마이크로 생물반응기를 페트리 접시에서 96웰 플레이트(하나의 대리석/웰)로 옮깁니다(그림 1G).
6. 웰의 여백에서 100μL의 배지를 천천히 첨가한다. 마이크로 생물반응기는 배지 위에 떠 다니기 시작합니다(그림 1H).
   참고 : 마이크로 생물 반응기는 PTFE 소수성의 붕괴로 인해 직접 액체 접촉에서 중단됩니다. 대안적인 접근법으로서, 액체 대리석 마이크로바이오리액터는 35 mm 세균학 배양 접시에 개별적으로 배치될 수 있다. 이 경우, 액체 대리석 증발을 방지하기 위해, 마이크로 생물반응기가 들어있는 35mm 페트리 접시를 100mm 페트리 접시에 삽입해야 하며, 이전에는 멸균수로 분취되어야 합니다.
7. 액체 대리석 마이크로바이오리액터를 5% CO2 인큐베이터 1,2,3,8,9에서 ³⁷°C에서 ¹⁸시간 동안 인큐베이션한다.
   참고: 1μm의 PTFE 입자 크기는 내부 액체와 주변 환경 간의 최적의 가스 교환을 보장할 수 있습니다.
8. 18시간 동안 5-aza-CR 인큐베이션한 후, 가장자리에서 절단된 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 마이크로생물반응기를 수집하였다(단계 4.5 참조).
9. 마이크로 생물반응기를 새로운 35mm 박테리아 페트리 접시에 넣습니다(그림 1D-F).
10. 바늘을 사용하여 액체 대리석에 구멍을 뚫고 부러 뜨립니다.
11. 입체 현미경으로 가장자리에서 절단한 200μL 피펫 팁으로 형성된 구상체를 회수합니다(그림 1I,J).
    참고: PTFE로 캡슐화된 후성유전학적으로 소거된 세포는 3D 구형 구조(각 액체 대리석에 하나의 응집체)를 형성합니다.
12. 5-aza-CR에 대한 반응에서 다능성 상태의 획득을 평가하기 위해, 정성적 PCR에 의해 다능성-관련 유전자 발현, OCT4, NANOG, REX1 및 SOX2의 발병을 확인하였다(표 2).
13. 아래에 설명된 대로 프로토콜의 두 번째 단계를 진행합니다.

5. 후성유전학적으로 지워진 세포의 PTFE 마이크로바이오리액터에서의 배양

1. 신선한 ESC 배지를 준비한다(표 1).
2. 오가노이드를 5-aza-CR 잔차를 세척하기 위한 ESC 배지를 함유하는 페트리 접시에 옮긴다(단계 5.1.-5.2 참조).
3. PTFE 파우더 베드를 함유하는 새로운 35mm 세균학 페트리 접시를 준비한다(또한 단계 4.1 참조).
4. 단일 오가노이드를 30 μL ESC 배지의 액적에 분주하여 200 μL 피펫 팁을 이용하여 분말 베드 상에 분주하고, 가장자리에서 절단한다(단계 4.9 참조; 5.3.).
5. 원형 운동으로 35mm 페트리 접시를 부드럽게 회전시켜 새로운 액체 대리석 마이크로 바이오 리액터를 형성하고, 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 픽업하고, 가장자리에서 자르고, 새로 형성된 마이크로 생물 반응기를 96 웰 플레이트 (하나의 대리석 / 웰)의 웰에 놓습니다 (단계 4.3.-4.6 참조).
6. 마이크로 생물반응기를 부유시키려면, 우물의 여백에서 100μL의 배지를 첨가하여 대리석을 천천히 목욕시킨다(참고 4.7 참조).
7. 액체 대리석 마이크로바이오리액터를 필요한 기간 동안 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 5.3.-5.7에 설명된 절차에 따라 격일로 배지를 변경한다.
   참고 : 본 원고에서는 28 일 동안 오가노이드 배양으로 얻은 결과가 제공됩니다. 그러나, 필요하다면 더 긴 배양 기간이 수행될 수 있다.

결과

본 프로토콜은 성체 체세포로부터 포유동물 다능성 세포를 생성하고 안정적으로 유지하기 위해 수행되는 모든 단계를 기술한다. 이 방법은 상이한 포유동물 종, 즉 마우스, 돼지 및 인간으로부터 분리된 섬유아세포로 성공적이었다. 여기에 보고된 대표적인 결과는 기원의 종에 관계없이 모든 세포주로부터 얻어진다.

형태학적 분석은, 탈메틸화제 5-aza-CR과 함께 18시간 인큐베...

토론

지난 수십 년 동안 여러 연구는 말기 분화 된 세포를 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 되돌리기위한 전략 개발에 중점을 두었습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 성숙한 성숙 말단 분화된 세포로부터 출발하는 다능성 세포의 생성 및 장기 유지를 허용한다. 이 방법은 화학적 후성 유전 적 소거를 통해 달성되는 높은 허용 상태의 유도와 3D 배양 시스템을 사용하여 보장 된 후속 유지 보수를 포함?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Component of ESC medium
5-Azacytidine	Sigma-Aldrich	A2385	5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCR	Bio-Rad Laboratories	NA	Thermal cycler for quantitative PCR
Cytidine	Sigma-Aldrich	C4654	Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966052	For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	31885023	For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Sigma-Aldrich	ESG1106	Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	10500064	Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Component of ESC medium
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	For dish coating
GeneAmp PCR System 2700	Applied Biosystems	NA	Thermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA Kit	CELL BIOLABS	STA-380	Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7801	Qualitative PCR
Guanosine	Sigma-Aldrich	G6264	Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31550031	For ESC medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with grids	Hycor Biomedical	87144	For cell counting
Leica MZ APO Stereo Microscope	Leica	NA	For organoid observation
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035	Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filters	Millipore	SLGS033SB	For solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant	Promega	M3681	mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate Photometer	Thermo Fisher Scientific	51119000	For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope	Nikon	NA	For cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480	Perkin Elmer	NA	Thermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size	Sigma-Aldrich	430935	For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1728	Quantitative PCR
Thymidine	Sigma-Aldrich	T1895	Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard	Sarstedt	833902	For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard	Sarstedt	833900	For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension	Sarstedt	833900500	Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F	Sarstedt	833924005	For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924	For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PS	Sarstedt	62553041	For cell suspension centrifugation
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003	Component of nucleoside mix for ESC medium