축삭 재생을 평가하기 위한 쥐의 시신경 절편 보존 및 망막 신경절 세포 축삭을 표적으로 하는 중재

요약

이 프로토콜은 쥐의 시신경초를 보존하는 시신경 절편을 설명합니다. 시신경으로의 미세주입으로 인한 정수압은 완전한 절편을 생성하여 전절된 시신경 말단의 봉합사 없이 재배치하고 절제 모델에서 축삭 구획을 직접 표적화할 수 있습니다.

초록

망막 신경절 세포(RGC) 축삭돌기는 시신경두에 모여 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달합니다. 녹내장, 외상 및 허혈성 시신경병증과 같은 병리학은 망막 신경절 세포를 손상시키고 시각적 자극의 전달을 방해하며 시력 상실을 유발합니다. 망막 신경절 축삭 손상을 시뮬레이션하는 동물 모델에는 시신경 파쇄 및 횡단 패러다임이 포함됩니다. 이러한 각 모델에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 시신경 파쇄는 일반적으로 절개보다 덜 심각하며 병변 부위를 가로지르는 축삭돌기 재생을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 파쇄력과 지속 시간의 차이는 조직 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 다양한 재현성과 병변 완전성이 발생할 수 있습니다. 시신경 절개의 경우 모든 축삭을 완전히 병변시키는 심각하고 재현 가능한 손상이 있습니다. 그러나 시신경을 횡단하면 시신경초를 침범하여 혈액 뇌 장벽을 극적으로 변화시켜 시신경을 말초 환경에 노출시킵니다. 더욱이, 절제 부위를 넘어선 재생은 절단된 신경 말단을 재배치하지 않고는 평가할 수 없습니다. 또한, 뚜렷한 퇴행성 변화와 세포 경로는 압착 또는 횡단 손상에 의해 활성화됩니다.

여기에 설명된 방법은 시신경 분쇄 및 절편 모델의 장점을 모두 통합하는 동시에 단점을 완화합니다. 미세주입에 의해 시신경에 전달되는 정수압은 시신경초의 무결성을 유지하면서 시신경을 완전히 횡단시킵니다. transection된 시신경 말단은 축삭 재생 분석을 허용하기 위해 재할당됩니다. 이 방법의 잠재적인 한계는 잠재적인 변동성의 원인인 완전한 횡단면을 시각화할 수 없다는 것입니다. 그러나 시신경의 가시적 부분이 절제되었다는 육안 확인은 90-95%의 성공률로 완전한 시신경 절개를 나타냅니다. 이 방법은 횡단 모델에서 축삭 재생 촉진 전략을 평가하거나 축삭 구획을 표적으로 하는 중재를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

서문

축삭 손상 및 변성은 외상 후 망막 신경절 세포(RGC) 또는 녹내장과 같은 신경퇴행성 질환에서 발생합니다 ^1,2. 망막 신경절 세포(RGC)의 소실과 망막푸갈 돌기의 붕괴는 영구적인 시력 상실을 초래합니다³. 퇴행성 과정을 담당하는 분자 경로를 이해하고 축삭 및 망막 신경절 세포를 완화하거나 망막 신경절 축삭을 재생하기 위한 전략을 개발하기 위해 시신경 파쇄 및 시신경 절편 모델을 포함한 시신경 손상을 시뮬레이션하는 데 실험적 동물 모델을 사용했습니다. 실험 모델을 선택할 때, 각 접근법의 장점과 단점, 그리고 부상에 의해 활성화된 분자 경로⁴를 고려해야 한다.

여기에 설명된 방법을 개발하는 이유는 시신경 크러시⁵ 및 단면⁶ 모델의 장점을 활용하면서 단점을 완화하는 것입니다. 이 방법의 목적은 모든 축삭이 의심할 여지 없이 완전히 전이되고, 말초 면역 체계에 대한 노출이 최소화되며, 시신경의 전이된 말단이 쉽게 재할당되어 망막 신경절 재생의 평가를 가능하게 하는 재현 가능한 시신경 손상을 생성하는 것이었습니다. 또한, 이 방법은 손상된 망막 신경절 세포의 축삭 부분에 구획화된 접근을 허용하고 축삭 특이적 중재(예: 신경 영양 인자, 세포 이식)를 후안와 시신경에 국소적으로 전달하기 위해 개발되었습니다.

이 기술은 대체 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 시신경 크러쉬와 비교했을 때, 이 방법은 시신경을 완전하고 안정적으로 횡단시킵니다. 이것은 바람직하지 않은 축삭돌기 보존의 잠재적인 문제를 해결합니다⁷. 또한, 설명된 방법은 압착 부상에서와 같이 작업자가 가하는 힘의 양과 지속 시간에 의존하지 않는 심각한 축삭 손상을 유발하여 변동성을 감소시킵니다⁽⁸). 시신경을 횡단하는 확립된 방법과는 대조적으로, 이 프로토콜에 자세히 설명된 접근 방식은 시신경초의 무결성을 유지합니다. 시신경초를 보존하는 것의 장점은 시신경이 말초 면역 체계에 노출되는 것을 방지한다는 것입니다. 또한, 시신경초가 transected 시신경에 가하는 기계적 힘은 미세수술적 조작에 도전할 필요 없이 절단된 신경 말단을 재흡수합니다 ^9,10,11. 마지막으로, 시신경초가 손상되지 않은 상태에서 이 방법은 줄기세포, 신경영양 인자 또는 고분자가 병변된 망막 신경절 축삭에 직접 도입될 수 있는 시신경 그루터기 사이에 물리적 공간을 생성합니다.

시신경 크러쉬(optic nerve crush)는 치료의 효과를 결정하기 위해 시신경 재생 전략을 평가하는 황금 표준 모델입니다. 설치류 시신경의 크기는 가능한 조작, 특히 신경의 절개 및 재적응을 제한합니다. 그러나 척수 손상 및 재생 분야에서는 완전한 절개가 축삭 재생과 보존된 축삭¹²를 구별하는 이상적인 모델이라는 합의가 있습니다. 여기에 설명된 방법은 시신경 절개 모델에서 재생 전략을 평가하기 위한 기술적 장벽을 줄입니다. 따라서 이 모델은 시신경 절편을 통한 시신경 파쇄 패러다임에서 확인된 유망한 전략을 검증하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 모델은 축삭 구획을 직접 표적으로 하기 때문에 손상된 성인 망막 신경절 축삭에 대한 개입과 축삭 퇴행성 및 재생 과정을 담당하는 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다.

이 연구에서 설명한 시신경 절개 모델은 시신경초를 보존하면서 시신경을 완전히 횡단합니다. 이 새로운 접근 방식은 시신경 말단을 재배치하는 기술적으로 어려운 과정 없이 절편 모델에서 축삭돌기 재생을 평가하는 것을 목표로 하는 실험에 적합합니다. 이 기술의 측면은 시신경 크러시를 수행하는 것과 유사합니다. 따라서 이 접근 방식은 시신경 파쇄에 경험이 있는 작업자가 수행할 수 있습니다. 수술 접근법은 특별히 설계된 기구가 필요하지 않으며 쉽게 구할 수 있는 수술 기구와 미세 주입 시스템으로 완성할 수 있어 접근하기 쉽고 경제적입니다.

프로토콜

동물과 관련된 절차는 재향 군인 업무 샌디에이고 의료 시스템의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 수술 기구와 용액은 수술 후 감염 및 합병증을 제한하기 위해 수술 전에 멸균되었습니다.

1. 외과 기술

1. 무균 기술을 사용하여 기관별 동물 사용 프로토콜에 따라 실험을 수행합니다.
2. 감염을 예방하고, 동물 복지에 부정적인 영향을 미치지 않도록 하며, 연구에 대한 잠재적인 부정적인 영향을 최소화하기 위해 생체 조직과 접촉하는 기구 및 물질을 살균합니다. 수술 기구는 물과 세제 또는 효소 제품으로 철저히 세척하여 이물질을 제거하고 스팀 또는 플래시 살균으로 살균합니다.
3. 조직 배양 후드의 멸균 용기에 액체를 분취합니다. 마이크로리터 주사기를 70% 에탄올로 세척하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹궈 살균합니다.

2. 마취

1. 이소플루란 기화기 시스템을 사용하여 쥐를 마취합니다. 의료용 산소를 사용하여 1L/분의 속도로 4.5% 농도의 이소플루란을 부착된 마취 상자에 기화시킵니다. 호흡이 느려지고 동물이 진정될 때까지 동물을 마취 상자에 넣습니다.
   참고: 가스 마취제와 함께 마취를 사용하는 이 초기 단계는 작업자가 진정되지 않은 동물에게 주사 마취제를 투여하는 데 편안하고 익숙한 경우 필요하지 않습니다.
2. 케타민(50mg/kg), 자일라진(2.6mg/kg), 아세프로마진(0.5mg/kg)으로 구성된 마취 칵테일을 투베르쿨린 주사기 30g에 충분히 넣습니다. 마취 상자에서 진정제를 투여한 동물을 꺼냅니다. 마취제를 복강내로 주사하여 시술 전반에 걸쳐 일관된 깊이의 진정제를 얻고 동물을 우리로 되돌립니다.
3. 발가락 꼬집음이 반응을 일으키지 못할 때 절차를 시작하십시오. 동물의 호흡 깊이와 속도를 평가하고 통증이 없는지 확인하기 위해 절차 내내 5분마다 발가락을 꼬집습니다.
4. 수술이 완료되면 정위 안경테에서 동물을 제거합니다. 진통제와 수액 지원을 제공하기 위해 식염수(3mL), 암피실린(0.15–0.2mg/kg) 및 바나민(2.5–5mg/kg)을 피하 주사합니다. 체온을 유지하기 위해 동물을 가열된 인큐베이터로 옮깁니다.

3. 외과적 접근법

1. 쥐(생후 7-8주, Fischer 344 균주)를 머리 입체 프레임에 넣고 가열된 패드 위에 놓습니다. 쥐 머리가 외과의의 왼쪽을 향하도록 입체택시 프레임을 배치하고 수술 시야에서 왼쪽 궤도를 중앙에 배치합니다.
2. 왼쪽 눈에는 프로파라카인 한 방울을 바르고 눈꺼풀과 눈에 포비돈 요오드 5%를 발라 눈을 깨끗이 합니다. 양쪽 눈의 각막에 안과 연고를 펴 각막의 수분을 유지하고 백내장 형성을 예방합니다.
3. 위 눈꺼풀의 표피를 통해 4-0 폴리글락틴 봉합사를 눈꺼풀 가장자리의 중앙으로 통과시키고, 이 봉합사를 사용하여 이후 단계에서 일시적인 족골 절제술을 사용합니다. 봉합사를 사용하여 눈꺼풀을 절개하고 우수한 fornix를 노출시킵니다.
4. 폴리글락틴 봉합사를 입체성 프레임에 테이프로 붙여서 지속적인 견인력과 노출을 가합니다. 과도한 견인은 후안와 내용물의 노출을 제한할 수 있으므로 피하십시오.
5. Colibri 겸자를 사용하여 상결막을 들어 올리고 Vannas 가위로 윤선을 따라 결막을 절개합니다. 상부 쉴림을 따라 4시 방향의 peritomy를 만듭니다.
6. 자유 끝이 지구본 아래에 있도록 상부 가장자리를 따라 고리가 있는 폴리프로필렌 봉합사를 배치하여 글로브에 약간 열등한 견인력을 가합니다. 절개술 후 상변연을 따라 남아 있는 조직은 공막 또는 윤부를 통해 봉합사를 통과할 필요 없이 봉합사 루프에 견인력을 제공하기에 충분합니다.
   1. 불독 cl로 루프의 끝을 고정하십시오.amp cl을 허용합니다.amp 공중에 자유롭게 매달려 있습니다. 클램프의 무게는 지구에 열등한 견인력을 가하고 후궤도 공간을 더 많이 노출시킵니다.
7. Blunt는 Vannas 가위로 공막을 따라 지구의 뒤쪽 측면을 따라 상직근 아래에서 해부합니다. 후안와 공간에 접근하기 위해 Vannas 가위로 근육 힘줄을 절단하여 지구에서 상직근을 제거합니다.

4. 시신경 접근

1. Dumont #5/45 겸자로 후구의 측두면을 따라 무딘 절개하고 상측 소용돌이 정맥을 식별합니다. 또한 코를 상측면 소용돌이 정맥으로 무딘 절개하여 시신경 주위의 안와 근육 원뿔을 노출시키고 시신경의 조기 손상을 방지합니다. 와류 정맥을 손상시키면 상당한 출혈이 발생할 수 있으므로 피하십시오. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지 화장솜 팁 어플리케이터를 사용할 수 있습니다.
2. Dumont #5/45 겸자를 사용하여 팁을 안와근 원뿔의 측두엽에 조심스럽게 삽입하고 근육 섬유의 경로와 평행하게 집게를 열어 시신경을 드러냅니다. 겸자를 사용하여 시신경 위에 있는 근섬유를 측면으로 변위시키고 신경을 완전히 노출시킵니다. 잔여 근육 섬유로 인해 당겨진 유리 모세관 피펫이 시신경을 쉽게 관통하는 것을 방지할 수 있으므로 시신경초만 시신경을 덮고 있는지 확인하십시오.
3. 신경의 양쪽 측면을 따라 두 개의 Dumont #5/45 겸자를 배치하고 겸자를 열어 신경의 노출을 유지합니다. 노출량은 시신경이 지구본에서 1.5-2.0mm 뒤쪽으로 분쇄되고 당겨진 유리 모세관 피펫이 등쪽 측면에서 시신경에 삽입될 수 있도록 해야 합니다.

5. 시초(optic sheath) 내부의 시신경(optic nerve) 절제

1. Dumont #5/45 겸자를 사용하여 시신경 양쪽의 팁을 지구본에서 최소 1.5-2.0mm 뒤쪽에 놓습니다. 겸자의 끝이 신경의 직경에 걸쳐 있는지 확인하십시오. 겸자를 5초 동안 완전히 닫아 시신경을 부수고 으깬 부위의 위치를 기록해 둡니다.
2. 마이크로리터 주사기를 사용하여 유리 흡입 모세관 피펫에 1–2 μL의 PBS를 채우고 피펫을 피펫 홀더에 부착합니다. 피펫 홀더를 micromanipulator에 장착하고 micromanipulator를 입체식 프레임에 부착합니다.
3. 버튼을 누를 때마다 20psi의 압력에서 4ms 지속 시간의 단일 펄스를 전달하도록 미세 주입 시스템을 조정합니다. 피펫을 수술 구역에 배치합니다.
4. 수술 범위에서 한 쌍의 #55 집게를 사용하여 피펫 팁을 작은 부피를 전달할 수 있지만 시신경초를 관통하기에 충분한 강성을 제공할 수 있을 만큼 충분히 큰 크기(~20–30μm 직경)로 절단하고 비스듬하게 만듭니다. 단일 펄스를 제공하고 피펫 팁에서 유체를 관찰하여 피펫 팁의 개통성을 확인합니다.
5. 피펫 팁의 위치를 시신경 중앙의 시신경 파쇄 부위 바로 위와 시신경 수초와 접촉하도록 미세 조정합니다. 나중에 200μm의 깊이를 결정하기 위해 micromanipulator에서 피펫의 수직 위치를 기록하십시오.
6. 피펫이 시신경에 들어갈 때까지 수술 내시경 아래의 팁을 관찰하면서 피펫을 내립니다. 피펫 팁이 구부러지고 시신경초를 관통할 수 있는 강성이 부족한 경우 피펫을 집어넣고 #55 집게를 사용하여 길이를 줄이고 피펫 팁의 직경을 늘립니다. 피펫 팁을 조정한 후 피펫으로 시신경초를 다시 침투해 보십시오.
7. 피펫 팁으로 시신경에 들어가면 필요한 경우 피펫을 집어넣습니다. 입체성 미세조작기(stereotaxic micromanipulator)에 의해 표시된 바와 같이 피펫 팁의 위치는 5.5단계에서 언급된 초기 위치에서 시신경 표면에서 200μm 아래에 있어야 합니다.
8. 수술 범위에서 시신경을 관찰하면서 미세 주입 시스템으로 정수압 펄스를 적용합니다. 펄스가 적용될 때, 시신경의 원위부와 근위부 사이의 선형 분리를 기록하여 시신경의 절단을 확인해야 합니다.
   참고: 250-500nL의 주입량은 일반적으로 시신경을 횡단하는 데 필요한 힘을 제공하기에 충분합니다. 1μL 이상이 필요한 주입은 주입 부위의 위치를 변경해야 함을 나타낼 수 있습니다. 온전한 실질에 더 많은 양을 주입하면 이 방법이 시신경을 완전히 횡단시키기 때문에 추가적인 망막 신경절 손상을 일으키지 않을 수 있지만 시신경의 근막을 따라 추적할 가능성이 더 높습니다. 충분한 양의 유체를 주입했음에도 불구하고 시신경의 선형 교차를 관찰하지 못하는 것은 파쇄 부위에서 피펫의 위치가 잘못되어 위치 변경이 필요함을 나타낼 수 있습니다. 사출 압력을 50% 증가시켜야 할 수도 있습니다.

6. 마감 및 복구

1. 피펫을 집어넣고 집어넣은 Dumont #5/45 집게를 제거합니다. 불독 cl을 제거하여 눈을 중립 위치로 되돌립니다.amp 지구본에서 고리가 있는 폴리프로필렌 봉합사.
2. 결막을 각막 가장자리로 재배치하여 조직의 적절한 부착과 치유를 위해 거꾸로 된 결막을 방출하도록 보장합니다. 안과 국소 항생제 연고를 눈에 바르십시오.
3. 눈꺼풀 4-0 폴리글락틴 봉합사에서 테이프를 제거하고 일시적인 족골 봉합사에 사용할 수 있도록 봉합사를 제자리에 유지합니다. 아래 눈꺼풀의 눈꺼풀 가장자리를 통해 봉합사를 통과시켜 아래쪽 피하 부위를 통과하고 표피를 통해 배출합니다. 눈을 감을 수 있을 만큼의 압력으로 봉합사를 묶습니다.
4. 기관 프로토콜 및 동물 관리 당국 지침에 따라 수술 후 진통제를 투여합니다. 수술 후 회복하기 위해 동물을 가열된 우리에 독립적으로 수용합니다. 우발적인 흡인을 방지하기 위해 회수 케이지에 침구를 놓지 마십시오.

결과

시신경의 절개는 일반적으로 손상 후 14일 이내에 손상된 망막 신경절의 80-90%의 세포사멸 소실을 초래합니다. 설명된 기술은 시신경초의 무결성을 유지하면서 시신경을 횡단합니다(그림 1). 망막 신경절 손실의 정도는 전통적인 시신경 절개 및 시신경 파쇄 모델과 비슷하며, 여기에 설명된 방법으로 절단 후 절단된 신경 말단을 쉽게 부착할 수 있다는 장점이 있습니다(그림 2). 이러한 방식으로 절단된 시신경 말단을 다시 연결하면 절단된 신경 말단을 다시 연결하기 위해 미세 수술을 할 필요 없이 축삭돌기가 자랄 수 있는 기질을 제공함으로써 절개 모델에서 망막 신경절 재생을 평가할 수 있습니다(그림 3). 콜레라 독소 B 소단위체(CTB)가 있는 망막 절막 축삭돌기의 선행성 추적은 CTB 양성 축삭돌기가 시신경 절개를 보존하는 초에 따라 완전히 전이됨을 보여줍니다(그림 4). 시신경을 횡단하면서 시신경초를 보존하면 신경영양 인자 또는 세포와 같은 조사 물질이 병변된 망막 신경절 축삭돌기로 전달되어 제자리에 유지될 수 있는 밀폐된 공간이 생성됩니다(그림 5). 교육의 초기 단계에서는 전체 절편의 성공률이 60-70%로 예상됩니다. 경험에 비추어 볼 때, 전체 절편의 성공률은 약 90-95%입니다.

그림 1: 시신경초를 보존하면서 시신경을 횡단하는 경우. (A) 절제 전 온전한 시신경의 노출을 보여주는 수술 부위의 사진. (B) 절개 후 시신경의 그림. 미세한 유리 피펫이 절편 부위의 시신경초를 뚫고 시신경 말단 사이의 공간으로 세포 현탁액(탁한 용액)을 전달했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 시신경 절개를 보존하는 시신경초 후 망막 신경절 세포 소실. (A) 온전한 시신경, (B) 시신경 절개를 보존하는 시신경초, (C) 전통적인 시신경 절제술 또는 (D) 14일 전의 시신경 파쇄를 가진 눈의 대표적인 전체 망막 편평한 마운트는 감마 시누클레인(SNCG)에 대한 면역 표지되었습니다. 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경에서 얻고, 음영을 보정하고, 스티칭하여 단일 이미지를 생성했습니다. 망막 전체에 걸쳐 망막 신경절 세포(RGC) 몸체의 소실은 병변이 있는 눈에서 명백했습니다. 삽입은 망막의 더 높은 배율 이미지를 보여주며 시신경 손상 후 망막 신경절 세포의 상당한 손실을 보여줍니다. (E) 망막 신경절 세포(RGC) 생존율의 정량화는 온전한 시신경을 대조군에 비해 시신경 손상 후 상당한 망막 신경절 손실이 있음을 보여줍니다. *p< 0.05 vs intact; 사후 Tukey 검정을 사용한 일원 분산 분석. n = 그룹당 3마리의 동물; 오차 막대는 SD. SP-ONT, 칼집 보존 시신경 절제술을 나타냅니다. ONT, 시신경 절제술; ONC, 시신경 크러쉬. 눈금 막대 = 1,000μm. 인셋의 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 시신경 손상 후 시신경 절편. (A-C) 시신경초, (D-F) 전통적인 시신경 절개 또는 (G-I) 시신경 크러시 후 14일 후 시신경을 통한 종방향 단면의 대표적인 이미지. (A,D,G) 신경교섬유산성 단백질(GFAP)에 대한 면역 표지는 병변의 범위를 묘사하는 반면, 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 사용한 (B,E,H) DNA 표지는 시신경의 길이와 병변 부위 내의 연속적인 세포성을 보여줍니다. (씨, 에프, 나) 병변 부위에서 GFAP 양성 신경 조직 및 세포성의 국소화를 보여주는 병합된 이미지. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 시신경 절개를 보존하는 시신경초에 따른 시신경 절편. 유리체강내 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB) 주사를 통한 전행성 축삭 추적으로 절편을 보존하는 시신경초 후 14일 후 시신경을 통한 종방향 단면의 대표 이미지. (A) 구체(왼쪽)에서 뇌(오른쪽)로 뻗어 있는 CTB 표지 망막 신경절 축삭의 완전한 병변을 관찰할 수 있습니다. (B) 신경교섬유산단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대한 면역표지는 시신경의 전체 직경을 포함하는 광범위한 병변을 나타냅니다. (C) 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 사용한 DNA 라벨링은 병변 부위 내 세포성을 보여줍니다. (D) 병변 부위에서 CTB 표지된 축삭돌기, GFAP 양성 신경 조직 및 세포성의 국소화를 보여주는 병합된 이미지. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 세포 이식을 받은 transected 시신경의 세로 단면. 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 신경줄기세포(NSC)의 절제 및 이식을 보존하는 시신경초 14일 후 시신경을 통한 종단면의 대표 이미지. (A) 신경교섬유산단백질(GFAP)에 대한 면역표지는 전이된 시신경 말단의 완전한 분리를 입증했습니다. (B) tdTomato를 발현하는 NSC는 기술된 기술에 의해 생성된 공간 내에 포함되어 있었고 이식 후에도 계속 생존했습니다. (C) 이식된 NSC는 transection된 시신경의 양쪽 절단된 말단에 직접 부착되었습니다. 스케일 바, 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

시신경 절개 모델을 설명하는 수술 절차는 이전에 발표된 바^{있다 6}. 그러나 이러한 프로토콜에 자세히 설명된 기술에는 시신경을 절제하기 위해 수막초를 절개하는 것이 포함됩니다. 또한, 이전 절제 모델에서 망막 절막 축삭 재생을 평가하기 위해 절단된 시신경 말단을 부착하거나 근위 시신경 그루터기에 말초 신경 이식편을 적용하기 위해 까다로운 미세수술적 조작이 필요했습니다^10,13. 여기에 설명된 프로토콜은 시신경을 횡단하는 동안 시신경초를 최소한으로 파괴하고 기술적으로 까다로운 미세수술적 조작 없이 절제 모델에서 망막 신경절 축삭 재생을 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 안과 동맥과 시신경두에 공급되는 혈관 조직이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 5.1 단계는 글로브에서 최소 1.5-2.0mm 후방에서 완료해야합니다. 안과 동맥에 손상이 발생하여 망막 혈액 공급을 방해하는 경우, 폐막염이 뒤따를 가능성이 있으므로 안구는 추가 실험에서 제외되어야 합니다. 5.4-5.6 단계에서는 시신경초의 무결성을 유지하고 유리 피펫이 시신경으로 들어가는 구멍의 크기를 최소화하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 피펫 팁 주위에 단단히 밀봉되어 유체 역류를 줄이고 시신경을 통과하기에 충분한 정수압을 생성할 수 있습니다. 유리 피펫의 끝을 경사지게 하면 부수적 손상을 일으키지 않고 피펫이 시신경에 쉽게 들어갈 수 있습니다.

이 메서드의 접근성을 개선하기 위해 운영자가 수정할 수 있는 잠재적인 사항이 있습니다. 설명된 절차는 안면 및 삼차 신경을 보존하면서 안와 조직의 최소 절개 및 제거를 포함합니다. 이렇게 하면 이환율과 출혈 위험이 감소하지만, 안와 지방 및 눈물샘과 같은 조직은 중요한 구조의 시각화를 제한할 수 있습니다. 수술 영역을 방해하는 조직을 조심스럽게 제거하는 것은 특히 나이가 많은 동물의 경우 시각화를 향상시키는 데 필요할 수 있습니다. 측면 접근법은 또한 시신경에 대한 접근을 개선하기 위해 사용될 수 있습니다. 그러나 측면 박리는 삼차 신경을 포함한 추가 구조에 손상을 줄 위험이 있고, 더 복잡하며, 주사를 위한 기구를 지시하는 데 자체적인 문제를 제시할 수 있습니다.

이 방법의 가능한 한계는 시신경을 직접 조작하고 전체 절편을 완전히 시각화할 수 없다는 것입니다. 따라서 불완전한 단면 절단의 가능성이 있습니다. 그러나 우리는 5.8단계에서 분리된 신경 말단을 육안으로 확인하는 것이 성공적이고 완전한 절제에 대한 신뢰할 수 있는 지표임을 관찰했습니다. 신경 말단이 분리되지 않는 경우, 주사 피펫의 위치를 변경하거나 주사 압력을 50% 높이면 신경을 완전히 절단할 수 있는 충분한 힘을 얻을 수 있습니다.

기존 방법과 관련하여 이 접근 방식은 시신경초의 무결성을 보존합니다. 시신경초의 무결성을 유지하기 위해 전이된 시신경의 말단은 안와 환경과 말초 면역 체계에 노출되지 않으므로 잠재적으로 망막 신경절 반응에 영향을 미칠 수 있는 면역 인자에 대한 노출을 제한합니다. 또한, 시신경을 횡단하는 동안 시신경초의 무결성을 보존하면 시신경 말단과 시신경초로 둘러싸인 밀폐된 물리적 공간이 생성됩니다. 손상된 망막 신경절 세포의 축삭 구획에 대한 신경 영양 인자, 세포 또는 고분자의 국소 전달은 새로 형성된 공간에 주입함으로써 달성될 수 있습니다. ¹⁴ 또는 망막 절막 축삭 재생은 까다로운 미세수술 기법 없이 전이된 시신경 말단이 문합할 수 있도록 하여 절편 모델에서 평가할 수 있습니다.

이 방법의 응용 분야에는 축삭 변성의 원인이 되는 경로를 식별하고 횡단 손상 후 축삭 손실을 방지하기 위한 축삭 특이적 개입을 통한 손상된 망막 절막 축삭 구획의 평가가 포함됩니다. 또한, 이 방법은 기술적으로 어려운 시신경 문합 절차의 필요성을 제거함으로써 횡단 모델에서 망막 신경절 축삭 재생에 대한 연구를 더 광범위한 연구 커뮤니티에서 액세스할 수 있도록 합니다. 망막 신경절 축삭 재생을 촉진하기 위한 중재는 이 심각한 손상 모델로 평가될 수 있으며 축삭돌림에 대한 걱정 없이 일관되고 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL