Method Article
이 프로토콜은 쥐의 시신경초를 보존하는 시신경 절편을 설명합니다. 시신경으로의 미세주입으로 인한 정수압은 완전한 절편을 생성하여 전절된 시신경 말단의 봉합사 없이 재배치하고 절제 모델에서 축삭 구획을 직접 표적화할 수 있습니다.
망막 신경절 세포(RGC) 축삭돌기는 시신경두에 모여 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달합니다. 녹내장, 외상 및 허혈성 시신경병증과 같은 병리학은 망막 신경절 세포를 손상시키고 시각적 자극의 전달을 방해하며 시력 상실을 유발합니다. 망막 신경절 축삭 손상을 시뮬레이션하는 동물 모델에는 시신경 파쇄 및 횡단 패러다임이 포함됩니다. 이러한 각 모델에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 시신경 파쇄는 일반적으로 절개보다 덜 심각하며 병변 부위를 가로지르는 축삭돌기 재생을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 파쇄력과 지속 시간의 차이는 조직 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 다양한 재현성과 병변 완전성이 발생할 수 있습니다. 시신경 절개의 경우 모든 축삭을 완전히 병변시키는 심각하고 재현 가능한 손상이 있습니다. 그러나 시신경을 횡단하면 시신경초를 침범하여 혈액 뇌 장벽을 극적으로 변화시켜 시신경을 말초 환경에 노출시킵니다. 더욱이, 절제 부위를 넘어선 재생은 절단된 신경 말단을 재배치하지 않고는 평가할 수 없습니다. 또한, 뚜렷한 퇴행성 변화와 세포 경로는 압착 또는 횡단 손상에 의해 활성화됩니다.
여기에 설명된 방법은 시신경 분쇄 및 절편 모델의 장점을 모두 통합하는 동시에 단점을 완화합니다. 미세주입에 의해 시신경에 전달되는 정수압은 시신경초의 무결성을 유지하면서 시신경을 완전히 횡단시킵니다. transection된 시신경 말단은 축삭 재생 분석을 허용하기 위해 재할당됩니다. 이 방법의 잠재적인 한계는 잠재적인 변동성의 원인인 완전한 횡단면을 시각화할 수 없다는 것입니다. 그러나 시신경의 가시적 부분이 절제되었다는 육안 확인은 90-95%의 성공률로 완전한 시신경 절개를 나타냅니다. 이 방법은 횡단 모델에서 축삭 재생 촉진 전략을 평가하거나 축삭 구획을 표적으로 하는 중재를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
축삭 손상 및 변성은 외상 후 망막 신경절 세포(RGC) 또는 녹내장과 같은 신경퇴행성 질환에서 발생합니다 1,2. 망막 신경절 세포(RGC)의 소실과 망막푸갈 돌기의 붕괴는 영구적인 시력 상실을 초래합니다3. 퇴행성 과정을 담당하는 분자 경로를 이해하고 축삭 및 망막 신경절 세포를 완화하거나 망막 신경절 축삭을 재생하기 위한 전략을 개발하기 위해 시신경 파쇄 및 시신경 절편 모델을 포함한 시신경 손상을 시뮬레이션하는 데 실험적 동물 모델을 사용했습니다. 실험 모델을 선택할 때, 각 접근법의 장점과 단점, 그리고 부상에 의해 활성화된 분자 경로4를 고려해야 한다.
여기에 설명된 방법을 개발하는 이유는 시신경 크러시5 및 단면6 모델의 장점을 활용하면서 단점을 완화하는 것입니다. 이 방법의 목적은 모든 축삭이 의심할 여지 없이 완전히 전이되고, 말초 면역 체계에 대한 노출이 최소화되며, 시신경의 전이된 말단이 쉽게 재할당되어 망막 신경절 재생의 평가를 가능하게 하는 재현 가능한 시신경 손상을 생성하는 것이었습니다. 또한, 이 방법은 손상된 망막 신경절 세포의 축삭 부분에 구획화된 접근을 허용하고 축삭 특이적 중재(예: 신경 영양 인자, 세포 이식)를 후안와 시신경에 국소적으로 전달하기 위해 개발되었습니다.
이 기술은 대체 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 시신경 크러쉬와 비교했을 때, 이 방법은 시신경을 완전하고 안정적으로 횡단시킵니다. 이것은 바람직하지 않은 축삭돌기 보존의 잠재적인 문제를 해결합니다7. 또한, 설명된 방법은 압착 부상에서와 같이 작업자가 가하는 힘의 양과 지속 시간에 의존하지 않는 심각한 축삭 손상을 유발하여 변동성을 감소시킵니다(8). 시신경을 횡단하는 확립된 방법과는 대조적으로, 이 프로토콜에 자세히 설명된 접근 방식은 시신경초의 무결성을 유지합니다. 시신경초를 보존하는 것의 장점은 시신경이 말초 면역 체계에 노출되는 것을 방지한다는 것입니다. 또한, 시신경초가 transected 시신경에 가하는 기계적 힘은 미세수술적 조작에 도전할 필요 없이 절단된 신경 말단을 재흡수합니다 9,10,11. 마지막으로, 시신경초가 손상되지 않은 상태에서 이 방법은 줄기세포, 신경영양 인자 또는 고분자가 병변된 망막 신경절 축삭에 직접 도입될 수 있는 시신경 그루터기 사이에 물리적 공간을 생성합니다.
시신경 크러쉬(optic nerve crush)는 치료의 효과를 결정하기 위해 시신경 재생 전략을 평가하는 황금 표준 모델입니다. 설치류 시신경의 크기는 가능한 조작, 특히 신경의 절개 및 재적응을 제한합니다. 그러나 척수 손상 및 재생 분야에서는 완전한 절개가 축삭 재생과 보존된 축삭12를 구별하는 이상적인 모델이라는 합의가 있습니다. 여기에 설명된 방법은 시신경 절개 모델에서 재생 전략을 평가하기 위한 기술적 장벽을 줄입니다. 따라서 이 모델은 시신경 절편을 통한 시신경 파쇄 패러다임에서 확인된 유망한 전략을 검증하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 모델은 축삭 구획을 직접 표적으로 하기 때문에 손상된 성인 망막 신경절 축삭에 대한 개입과 축삭 퇴행성 및 재생 과정을 담당하는 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다.
이 연구에서 설명한 시신경 절개 모델은 시신경초를 보존하면서 시신경을 완전히 횡단합니다. 이 새로운 접근 방식은 시신경 말단을 재배치하는 기술적으로 어려운 과정 없이 절편 모델에서 축삭돌기 재생을 평가하는 것을 목표로 하는 실험에 적합합니다. 이 기술의 측면은 시신경 크러시를 수행하는 것과 유사합니다. 따라서 이 접근 방식은 시신경 파쇄에 경험이 있는 작업자가 수행할 수 있습니다. 수술 접근법은 특별히 설계된 기구가 필요하지 않으며 쉽게 구할 수 있는 수술 기구와 미세 주입 시스템으로 완성할 수 있어 접근하기 쉽고 경제적입니다.
동물과 관련된 절차는 재향 군인 업무 샌디에이고 의료 시스템의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 수술 기구와 용액은 수술 후 감염 및 합병증을 제한하기 위해 수술 전에 멸균되었습니다.
1. 외과 기술
2. 마취
3. 외과적 접근법
4. 시신경 접근
5. 시초(optic sheath) 내부의 시신경(optic nerve) 절제
6. 마감 및 복구
시신경의 절개는 일반적으로 손상 후 14일 이내에 손상된 망막 신경절의 80-90%의 세포사멸 소실을 초래합니다. 설명된 기술은 시신경초의 무결성을 유지하면서 시신경을 횡단합니다(그림 1). 망막 신경절 손실의 정도는 전통적인 시신경 절개 및 시신경 파쇄 모델과 비슷하며, 여기에 설명된 방법으로 절단 후 절단된 신경 말단을 쉽게 부착할 수 있다는 장점이 있습니다(그림 2). 이러한 방식으로 절단된 시신경 말단을 다시 연결하면 절단된 신경 말단을 다시 연결하기 위해 미세 수술을 할 필요 없이 축삭돌기가 자랄 수 있는 기질을 제공함으로써 절개 모델에서 망막 신경절 재생을 평가할 수 있습니다(그림 3). 콜레라 독소 B 소단위체(CTB)가 있는 망막 절막 축삭돌기의 선행성 추적은 CTB 양성 축삭돌기가 시신경 절개를 보존하는 초에 따라 완전히 전이됨을 보여줍니다(그림 4). 시신경을 횡단하면서 시신경초를 보존하면 신경영양 인자 또는 세포와 같은 조사 물질이 병변된 망막 신경절 축삭돌기로 전달되어 제자리에 유지될 수 있는 밀폐된 공간이 생성됩니다(그림 5). 교육의 초기 단계에서는 전체 절편의 성공률이 60-70%로 예상됩니다. 경험에 비추어 볼 때, 전체 절편의 성공률은 약 90-95%입니다.
그림 1: 시신경초를 보존하면서 시신경을 횡단하는 경우. (A) 절제 전 온전한 시신경의 노출을 보여주는 수술 부위의 사진. (B) 절개 후 시신경의 그림. 미세한 유리 피펫이 절편 부위의 시신경초를 뚫고 시신경 말단 사이의 공간으로 세포 현탁액(탁한 용액)을 전달했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시신경 절개를 보존하는 시신경초 후 망막 신경절 세포 소실. (A) 온전한 시신경, (B) 시신경 절개를 보존하는 시신경초, (C) 전통적인 시신경 절제술 또는 (D) 14일 전의 시신경 파쇄를 가진 눈의 대표적인 전체 망막 편평한 마운트는 감마 시누클레인(SNCG)에 대한 면역 표지되었습니다. 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경에서 얻고, 음영을 보정하고, 스티칭하여 단일 이미지를 생성했습니다. 망막 전체에 걸쳐 망막 신경절 세포(RGC) 몸체의 소실은 병변이 있는 눈에서 명백했습니다. 삽입은 망막의 더 높은 배율 이미지를 보여주며 시신경 손상 후 망막 신경절 세포의 상당한 손실을 보여줍니다. (E) 망막 신경절 세포(RGC) 생존율의 정량화는 온전한 시신경을 대조군에 비해 시신경 손상 후 상당한 망막 신경절 손실이 있음을 보여줍니다. *p< 0.05 vs intact; 사후 Tukey 검정을 사용한 일원 분산 분석. n = 그룹당 3마리의 동물; 오차 막대는 SD. SP-ONT, 칼집 보존 시신경 절제술을 나타냅니다. ONT, 시신경 절제술; ONC, 시신경 크러쉬. 눈금 막대 = 1,000μm. 인셋의 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시신경 손상 후 시신경 절편. (A-C) 시신경초, (D-F) 전통적인 시신경 절개 또는 (G-I) 시신경 크러시 후 14일 후 시신경을 통한 종방향 단면의 대표적인 이미지. (A,D,G) 신경교섬유산성 단백질(GFAP)에 대한 면역 표지는 병변의 범위를 묘사하는 반면, 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 사용한 (B,E,H) DNA 표지는 시신경의 길이와 병변 부위 내의 연속적인 세포성을 보여줍니다. (씨, 에프, 나) 병변 부위에서 GFAP 양성 신경 조직 및 세포성의 국소화를 보여주는 병합된 이미지. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시신경 절개를 보존하는 시신경초에 따른 시신경 절편. 유리체강내 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB) 주사를 통한 전행성 축삭 추적으로 절편을 보존하는 시신경초 후 14일 후 시신경을 통한 종방향 단면의 대표 이미지. (A) 구체(왼쪽)에서 뇌(오른쪽)로 뻗어 있는 CTB 표지 망막 신경절 축삭의 완전한 병변을 관찰할 수 있습니다. (B) 신경교섬유산단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대한 면역표지는 시신경의 전체 직경을 포함하는 광범위한 병변을 나타냅니다. (C) 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 사용한 DNA 라벨링은 병변 부위 내 세포성을 보여줍니다. (D) 병변 부위에서 CTB 표지된 축삭돌기, GFAP 양성 신경 조직 및 세포성의 국소화를 보여주는 병합된 이미지. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 이식을 받은 transected 시신경의 세로 단면. 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 신경줄기세포(NSC)의 절제 및 이식을 보존하는 시신경초 14일 후 시신경을 통한 종단면의 대표 이미지. (A) 신경교섬유산단백질(GFAP)에 대한 면역표지는 전이된 시신경 말단의 완전한 분리를 입증했습니다. (B) tdTomato를 발현하는 NSC는 기술된 기술에 의해 생성된 공간 내에 포함되어 있었고 이식 후에도 계속 생존했습니다. (C) 이식된 NSC는 transection된 시신경의 양쪽 절단된 말단에 직접 부착되었습니다. 스케일 바, 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시신경 절개 모델을 설명하는 수술 절차는 이전에 발표된 바있다 6. 그러나 이러한 프로토콜에 자세히 설명된 기술에는 시신경을 절제하기 위해 수막초를 절개하는 것이 포함됩니다. 또한, 이전 절제 모델에서 망막 절막 축삭 재생을 평가하기 위해 절단된 시신경 말단을 부착하거나 근위 시신경 그루터기에 말초 신경 이식편을 적용하기 위해 까다로운 미세수술적 조작이 필요했습니다10,13. 여기에 설명된 프로토콜은 시신경을 횡단하는 동안 시신경초를 최소한으로 파괴하고 기술적으로 까다로운 미세수술적 조작 없이 절제 모델에서 망막 신경절 축삭 재생을 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 안과 동맥과 시신경두에 공급되는 혈관 조직이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 5.1 단계는 글로브에서 최소 1.5-2.0mm 후방에서 완료해야합니다. 안과 동맥에 손상이 발생하여 망막 혈액 공급을 방해하는 경우, 폐막염이 뒤따를 가능성이 있으므로 안구는 추가 실험에서 제외되어야 합니다. 5.4-5.6 단계에서는 시신경초의 무결성을 유지하고 유리 피펫이 시신경으로 들어가는 구멍의 크기를 최소화하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 피펫 팁 주위에 단단히 밀봉되어 유체 역류를 줄이고 시신경을 통과하기에 충분한 정수압을 생성할 수 있습니다. 유리 피펫의 끝을 경사지게 하면 부수적 손상을 일으키지 않고 피펫이 시신경에 쉽게 들어갈 수 있습니다.
이 메서드의 접근성을 개선하기 위해 운영자가 수정할 수 있는 잠재적인 사항이 있습니다. 설명된 절차는 안면 및 삼차 신경을 보존하면서 안와 조직의 최소 절개 및 제거를 포함합니다. 이렇게 하면 이환율과 출혈 위험이 감소하지만, 안와 지방 및 눈물샘과 같은 조직은 중요한 구조의 시각화를 제한할 수 있습니다. 수술 영역을 방해하는 조직을 조심스럽게 제거하는 것은 특히 나이가 많은 동물의 경우 시각화를 향상시키는 데 필요할 수 있습니다. 측면 접근법은 또한 시신경에 대한 접근을 개선하기 위해 사용될 수 있습니다. 그러나 측면 박리는 삼차 신경을 포함한 추가 구조에 손상을 줄 위험이 있고, 더 복잡하며, 주사를 위한 기구를 지시하는 데 자체적인 문제를 제시할 수 있습니다.
이 방법의 가능한 한계는 시신경을 직접 조작하고 전체 절편을 완전히 시각화할 수 없다는 것입니다. 따라서 불완전한 단면 절단의 가능성이 있습니다. 그러나 우리는 5.8단계에서 분리된 신경 말단을 육안으로 확인하는 것이 성공적이고 완전한 절제에 대한 신뢰할 수 있는 지표임을 관찰했습니다. 신경 말단이 분리되지 않는 경우, 주사 피펫의 위치를 변경하거나 주사 압력을 50% 높이면 신경을 완전히 절단할 수 있는 충분한 힘을 얻을 수 있습니다.
기존 방법과 관련하여 이 접근 방식은 시신경초의 무결성을 보존합니다. 시신경초의 무결성을 유지하기 위해 전이된 시신경의 말단은 안와 환경과 말초 면역 체계에 노출되지 않으므로 잠재적으로 망막 신경절 반응에 영향을 미칠 수 있는 면역 인자에 대한 노출을 제한합니다. 또한, 시신경을 횡단하는 동안 시신경초의 무결성을 보존하면 시신경 말단과 시신경초로 둘러싸인 밀폐된 물리적 공간이 생성됩니다. 손상된 망막 신경절 세포의 축삭 구획에 대한 신경 영양 인자, 세포 또는 고분자의 국소 전달은 새로 형성된 공간에 주입함으로써 달성될 수 있습니다. 14 또는 망막 절막 축삭 재생은 까다로운 미세수술 기법 없이 전이된 시신경 말단이 문합할 수 있도록 하여 절편 모델에서 평가할 수 있습니다.
이 방법의 응용 분야에는 축삭 변성의 원인이 되는 경로를 식별하고 횡단 손상 후 축삭 손실을 방지하기 위한 축삭 특이적 개입을 통한 손상된 망막 절막 축삭 구획의 평가가 포함됩니다. 또한, 이 방법은 기술적으로 어려운 시신경 문합 절차의 필요성을 제거함으로써 횡단 모델에서 망막 신경절 축삭 재생에 대한 연구를 더 광범위한 연구 커뮤니티에서 액세스할 수 있도록 합니다. 망막 신경절 축삭 재생을 촉진하기 위한 중재는 이 심각한 손상 모델로 평가될 수 있으며 축삭돌림에 대한 걱정 없이 일관되고 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다.
저자는 공개할 경쟁 또는 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 K12 경력 개발 보조금(5K12EY024225-04, National Eye Institute), P30 핵심 보조금(P30EY022589, National Eye Institute), 의사 과학자 발전을 위한 멘토링 상(미국 녹내장 학회) 및 Research to Prevent Blindness(뉴욕, 뉴욕)의 무제한 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-0 Polyglactin suture | Ethicon | J315H | |
9-0 Polypropylene suture | Ethicon | 1754G | |
Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL |
Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL |
Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
Animal incubator | Precision Incubators | Chick Chalet II | |
Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Colibri forceps | Katena | K5-1500 | |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Heat therapy pump | Kent Scientific | HTP-1500 | |
Isoflurane | Covetrus | 29404 | |
Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7440 | |
Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL |
Microinjection system (Picospritzer II) | General Valve, Inc | ||
Microliter syringe 5 µL | Hamilton | 88000 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-77 Brown-Flaming | |
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | Bausch + Lomb | ||
PBS | Millipore | BSS-1005-B | |
Povidone-iodine | Healthpets | BET16OZ | |
Proparacaine hydrochloride 0.5% | Bausch + Lomb | ||
Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 mL/injection |
Stereotaxic Frame | Kopf | ||
Surgical Microscope | Zeiss | ||
Vannas scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Xylazine | Lloyd | 0410 | 2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL |
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