Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

요약

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

초록

포스트인파르트 심부전을 예방하기 위한 현재 심장 줄기 세포 치료법에 직면한 주요 문제 중 하나는 부상당한 심근 내의 이식된 세포의 낮은 유지율과 생존율이 치료 효능을 제한하는 것입니다. 최근에는 스캐폴딩 생체 재료의 사용이 줄기 세포 치료제를 개선하고 극대화하는 데 주목받고 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 주사용 하이드록시페닐 프로피온산(GH) 하이드로겔을 사용하여 골수 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 이식하는 간단하고 간단한 기술을 도입하는 것입니다. 하이드로겔은 시투에서 교차 연결되는 능력과 높은 생체 적합성으로 인해 심장 조직 엔지니어링 응용 을 위한 세포 전달 플랫폼으로서 유리합니다. 우리는 MSC 로딩 GH 하이드로겔 (MSC/하이드로겔)을 제조하고 체외 배양에서 3차원 (3D)에서 생존과 증식을 평가하는 간단한 방법을 제시합니다. 또한, 마우스에서 MSC/하이드로겔의 자궁내 이식 기술을 시연하여 왼쪽 전방 내림차순(LAD) 관상 동맥 결찰 및 후속 MSC/하이드로겔 이식을 통해 심근 경색(MI)을 유도하는 수술 절차를 설명하고 있습니다.

서문

심장 줄기 세포 치료는 심근 수리 및 재생^1,2에대한 잠재적 인 접근법으로 부상하고있다. 최근 동물모델 및 임상시험에서 양성결과에도 불구하고 심근수리를 위한 줄기세포 기반 요법의 적용은 극각심장조직에서 주입된 세포의 생존율이 낮고 생존율이^{낮아서3,4.} 그 결과, 주사용 생체재료^5,심장 패치^6,세포시트^7을포함한 세포 기반 조직 공학의 사용은 숙주 심근 내의 세포 보존 및 통합을 개선하기 위해 집중적으로 연구되고 있다.

생체 공학 심장 조직 수리에 대한 다양한 잠재적 접근법 중, 관해 줄기 세포 (MSC), 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 적절한 세포 유형과 결합 된 주사용 하이드로겔은 심근 부위에 세포를 효과적으로 전달하는 매력적인^{옵션입니다 8,9.} 잘 알려진 천연 폴리머인 젤라틴은 생체 적합성, 상당한 생분해성 및 생체 의학 응용 분야에서 사용되는 광범위한 생체 재료와 비교할 때 면역원성을 감소시키기 때문에 주사용 매트릭스로 사용할 수 있습니다. 젤라틴 기반 주 사용 플랫폼은 큰 잠재력을 가지고 있지만, 생체 내의 적용성은 낮은 기계적 강성과 생리 환경에서 쉽게 저하성에 따라 제한된 남아있다.

이러한 한계를 극복하기 위해 하이드록시페닐 프로피온산으로 구성된 젤라틴 기반 하이드로겔의 참신하고 간단한 디자인이 생체 내 적용을 위해 제안되었습니다. 젤라틴-하이드록시페닐 프로피오닉산(GH) 컨쥬게이트는 효소, 고추냉이 과산화효소(HRP)의 존재 시정에서 교차연결될 수 있으며, 그 후 하이드로겔 내의 다양한 약물, 생체분자또는 세포를 캡슐화하여 조직 공학 응용 분야에서 큰 잠재력을^{시사한다.} 또한, 최근 캡슐화된 MSC를 함유한 GH 하이드로겔의 치료 효과를 조사하고, 뮤린^{모델(15)에서}MI 후 성공적인 심장 수리 및 재생에 대한 사용을 입증하였다. 이 프로토콜에서, 우리는 GH 하이드로겔 내의 캡슐화 및 체외 3차원 (3D) 증식을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 또한 관상 동맥 결찰및 MSC 로딩 GH 하이드로겔의 자궁 내 이식을 통해 뮤린 MI 모델을 생성하도록 설계된 외과 적 수술을 원각 심장으로 소개합니다.

프로토콜

모든 동물 연구 절차는 실험실 동물 복지법, 실험실 동물의 치료 및 사용 안내서 및 가톨릭 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 제공하는 설치류 실험지침 및 정책에 따라 제공되었습니다.

1. MSC 및 주사용 젤라틴 하이드로겔 의 준비

1. 37°C및 5% CO_2에서100mm 배양 접시에 있는 MsC 배양. MSC 의 성장이 80 %에 도달하면 DPBS로 접시를 두 번 씻고 3 7 °C에서 트립신 대체 1 mL을 3 분 동안 추가하십시오.
   참고: MSP는 기존의 절차에 따라 뮤린 골수로부터 격리되었다^16,덜벡코의 수정 독수리의 매체 (DMEM)에서 배양 10% 태아 소 혈청을 포함 (FBS) 및 1% 항생제-항 mycotic 솔루션, 이 연구를 위해 통과 사이 사용 7\u20129.
2. 배양 배지 와 원심분리기 9mL를 500 x g에서 3분 간 추가합니다. 다음으로, 결과 상체를 버리고, PBS의 1 mL에서 세포를 재일시 중지하고, 얼음에 세포 현탁액을 유지한다.
3. 트라이판 블루의 10 μL로 셀 서스펜션 10 μL을 희석하고 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 얻습니다.
4. 1 x 10⁷ 셀/mL의 밀도로 MSC를 1mL 튜브로 다시 일시 중단하고 전송합니다.
5. PBS에서 GH 컨쥬게이트 용액의 6.25 wt%를 준비하고 2개의 바이알로 분리합니다. 다음으로 GH 솔루션을 HRP(GH 솔루션 A)의 6μg/mL 또는 H₂O_2(GH 솔루션 B)의 0.07 wt%와 혼합합니다.
   참고: 공지된^{프로토콜(12,15)에}따라 젤라틴-하이드록시페닐 프로피오닉산(GH) 컨쥬게이트를 준비한다.
   1. HRP(GH 솔루션 A) 및 GH 컨쥬게이트 용액에 대한 GH 컨쥬게이트 용액의 9:1 체적 비율을 각각_H2O_2(GH 솔루션 B)에 보관하십시오.
6. MSC를 GH 솔루션 A와 혼합하기 전에 셀 서스펜션을 1,000 x g로 잠시 원심 분리하고 결과 슈퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 이어서, MSC를 함유하는 펠릿을 GH 솔루션 A와 혼합한다.

2. 시투 MSC 로딩 및 체외 문화에서 입체적 입체

1. 듀얼 주사기의 양쪽에 GH 솔루션 A(MSC 포함) 및 GH 솔루션 B를 로드합니다. 8웰 챔버 슬라이드에 5 x 10⁶ 셀/mL의 최종 밀도에서 MSC와 결합된 GH 솔루션의 플레이트 300 μL.
2. 시투 하이드로겔 형성 및 효소 교차 연결을 통한 후속 MSC 캡슐화 후, 10% FBS 및 1% 항생제-항진용액을 함유한 700 μL의 DMEM을 추가합니다.
3. 슬라이드를 37°C 및 5% CO_2에서 배양하고 2\u20123일마다 배양 배지를 교체한다.

3. GH 하이드로겔 내의 체외 증식 및 생존 확인

1. GH 하이드로겔 내에서 3D 배양 된 MSC의 생존가능성을 확인하려면 미리 정해진 인큐베이션 시간 후에 라이브/죽은 세포 염색 분석체를 사용하십시오.
2. 3, 5, 7 또는 14 일 동안 GH 하이드로겔에서 캡슐화된 MSC의 배양에 따라 매체를 흡면하고 PBS로 두 번 잘 씻는다.
3. DPBS의 10mL에서 칼세인 AM 5 μL 및 에디듐 호모디머-1(EthD-1)의 20 μL을 포함하는 염색 용액을 준비한다.
4. 스테인링 용액 200μL을 우물에 넣고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
5. 염색 용액을 흡인하고 PBS로 우물을 두 번 씻으세요.
6. 조심스럽게 슬라이드에서 챔버를 분리하고 GH 하이드로 겔 위에 전체 커버 슬립을 배치합니다. 캡슐화된 MSC의 증식 및 형태학적 변화의 정도를 시각화하기 위해 공초점 현미경 검사를 사용합니다.
   참고: 형광 화상은 200배율 하에서 획득되었고, 칼세인의 경우 470/540 nm의 여기/방출 파장에서, EthD-1의 경우 516/607 nm로 이미지되었습니다.

4. 마우스에서 심근 경색의 유도

1. 7주 된 남성 C57BL/6 마우스(20\u20122g)를 식염수의 졸레틸(30 mg/kg)과 롬펀(10 mg/kg)의 혼합물을 인트라보네주사로 마취한다.
2. 수술 전에는 제모 크림을 사용하여 마우스 가슴을 뒤풀이고 요오드로 피부를 살균하십시오.
3. 수술대에 마우스를 놓고 카테터를 기관체에 삽입하여 기계 환기를 통해 산소를 보충합니다.
4. 외과 가위를 사용하여 피부를 부드럽게 잘라낸 다음 마이크로 가위로 늑간 근육을 관통합니다. 2차 및 3번째 왼쪽 갈비뼈를 5-0 실크 봉합사를 사용하여 분리하여 가슴 구멍을 유지합니다.
5. 8-0바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 전방 내림차순(LAD) 관상 동맥을 조심스럽게 리게이트합니다. 폴리 프로필렌 봉합사 및 전기 카우테리를 사용하여 봉합사를 잘라.
6. 전방 좌심실 벽의 즉각적인 색상 변화를 관찰하십시오.

5. MSC 로딩 GH 하이드로겔의 인트라미카르탈 이식

1. LAD 결찰에 의한 심근 경색을 유도한 후, 26G 바늘을 장착한 이중 주사기를 사용하여 경색 국경 영역(총 2 x 10⁵ MSC/20 μL)의 두 가지 지점에 MSC 로딩 GH 용액 10μL을 주입합니다.
   1. 1단계에서 설명된 동일한 절차에 따라 MSC 로딩 GH 솔루션을 듀얼 주사기로 준비하고 전송합니다.
      참고: 경질 지역 내에서 MSC 로딩 GH 하이드로겔의 이식을 평가하기 위해 MSC와 GH 컨쥬게이트는 각각 PHK26 및 형광제 이소티오카네이트(FITC)로 사전 표지되었다.
2. 열린 가슴 구멍을 복원하고 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 닫습니다.
   참고: 가슴 이닫기 전에 카테터 주사기를 사용하여 공기를 제거합니다.
3. 기관관을 제거하고 복구 하는 동안 적외선 램프 아래 케이지에 마우스를 배치 합니다.
4. 수술 후 진통의 경우 피하 케토프로펜 주사(하루 5 mg/kg)를 최소 72시간 동안 투여하십시오. 모든 마우스는 수술 후 적절한 회복뿐만 아니라 적절한 통증 치료를 보장하기 위해 적절한 시간 동안 면밀히 모니터링해야합니다.

6. 에코카르디그래피

1. 이식 후 4주 후, 처음에는 5%의 이소플루란으로 마우스를 마취한 다음 이소플루란 농도를 1%로 조절한다.
2. 제모 크림을 사용하여 가슴을 뒤처질시키고 마우스를 가열 패드에 놓습니다. 가슴에 초음파 트랜스듀서 젤을 바치면 됩니다.
3. 2차원 파라스테랄 짧은 축 뷰를 획득하고 유두 근육 수준에서 M 모드 추적을 기록합니다.
   참고: 왼쪽 파라스테럴 라인에 선형 어레이 변환기(7\u201215 MHz)를 배치하고 해부학 구조를 봅니다.
4. LVAW, LVID 및 LVPW에 대한 해당 라인을 측정하여 심장 벽 두께, 챔버 치수 및 분수 단축을 얻습니다.
   참고: 동일한 해부학 적 위치에서 적절한 평가를 보장하기 위해 유두 근육의 수준에서 배출 분수 (EF), 분수 단축 (FS), 및 최종 수축부(ESV)를 포함한 심장 기능을 비교합니다.

7. 조직학적 평가

1. MSC-로딩 GH 하이드로겔을 경각심에 이식한 후 소정의 시간에,_CO2 챔버에서 마우스를 안락사시키고 조직학적 분석을 위해 심장을 수집한다^15.
2. 헤마톡시린과 에오신(H&E) 및 마슨의 트리크롬(MT) 염색의 경우, 해부된 심장 조직을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 수정하고 파라핀에 포함시한다. 다음으로, 표준^{프로토콜(17)에}따라 MT 얼룩으로 미세토메를 사용하여 파라핀 임베디드 심장 블록을 4 μm 직렬 섹션으로 잘라냅니다.
3. 20배 배율로 슬라이드 스캐너에서 이미지를 획득하고 치료 그룹의 경색 크기를 계산합니다.
   광원 크기 (%) = 총 경색 주위 / 총 LV 둘레 × 100
4. 중간 선 길이 측정하여 둘 다 둘다 계산합니다. LV 미드라인 둘레의 경우 내막과 상골 표면 사이의 중심선 길이를 측정합니다. 미드라인 경외도의 경우, 심근^18의전체 두께의 50% 이상을 포함하는 경색의 길이를 측정한다.
   참고: ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지 분석을 수행했습니다.
5. 유두 근육 수준에서 흉터의 벽 두께를 측정합니다.
6. 콜라겐 영역의 일부를 계산합니다.
   콜라겐 영역 (%) = 간질 섬유증 /심근 세포 영역 x 100의 총 면적

결과

광원심근에 효과적으로 MSC를 전달하기 위해 도 1에 설명된 시투 교차 연결 하이드로겔에서 MSC 로딩이 이 프로토콜에 사용되었다. 생체 내 이식 이전에, GH 하이드로겔에서 MSC의 증식 및 생존은 체외 라이브/죽은 세포 염색 분석서에서 3D에 의해 확인되었다(라이브: 녹색; 죽은: 빨강). 그림 2에도시된 바와 같이, 대표적인 이미지는 충분한 MSC 확산을 나타?...

토론

주사용 GH 하이드로겔은 상균하게 시상에 다양한 치료제를 통합하는 능력 때문에 생체 내 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 그들의 물리적 및 생화확적인 속성은 질병 의존적 요구 사항에 따라 쉽게 조작될 수 있습니다. 이러한 점에서, 주사용 하이드로겔은 현재 심장 줄기 세포 치료의 주요 한계를 해결하기 위해 제안된 생존 및 세포 보존(즉, 24시간 이식 후 10% 이내)에서

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430