절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

요약

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

초록

실험실에서 배양한 조직이나 의료 기기를 개인에게 이식하는 성공 여부는 이식 숙주의 면역 반응에 달려 있습니다. 임플란트를 이물질로 간주하면 적대적이고 조절되지 않는 면역 반응은 임플란트의 거부 반응을 초래할 수 있는 반면, 조절된 반응과 항상성의 회복은 임플란트의 수용으로 이어질 수 있습니다. in vivo 또는 ex vivo 환경에서 해부된 임플란트의 미세환경을 분석하면 면역 반응 패턴을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 궁극적으로 차세대 생체 재료 개발에 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 세포 표면 마커를 기반으로 면역 세포와 그 하위 집합을 특성화하는 데 잘 알려진 기법입니다. 본 연구에서는 절개된 임플란트 조직에서 균일한 세포 현탁액을 분리하기 위해 세포 스트레이너를 통한 수동 다이싱, 효소 분해 및 여과를 기반으로 하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 유세포 분석을 통해 이러한 분리된 세포를 특성화하고 정량화하기 위한 초기 유세포 분석기 설정 단계와 함께 multicolor 유세포 분석 염색 프로토콜이 설명되었습니다.

서문

의학 분야의 발전으로 인해 손상된 조직의 기능 또는 재성장을 지원하기 위해 이식된 재료가 자주 사용되었다 ^1,2. 여기에는 심박 조율기, 재건 미용 임플란트 및 골절 고정에 사용되는 정형외과 플레이트와 같은 장치가 포함됩니다 ^3,4. 그러나 이러한 임플란트를 만드는 데 사용되는 재료와 임플란트가 이식되는 위치는 이러한 임플란트의 성공을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다 ^5,6,7. 이러한 임플란트는 이물질로서 숙주로부터 면역 반응을 일으켜 거부 반응 또는 내성을 유발할 수 있다⁸. 이 요인은 착상 후 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 생성하기 위한 생체 재료 연구를 주도했습니다 9,10,11,12.

면역 반응은 손상된 조직 또는 장기를 교체하기 위해 실험실에서 생체 재료 골격(스캐폴드) 주위에 조직 또는 장기를 성장시키는 재생 의학 분야에서 필수적인 요구 사항입니다^13,14,15,16. 재생 의학의 목표는 세포, 신호 및 지지체를 사용하여 누락되거나 손상된 조직을 대체하는 것이며, 각각은 면역 반응에 의해 크게 조절될 수 있습니다¹⁷. 더욱이, 면역 반응의 결핍이 원하는 경우에도, 면역 활성의 결핍은 매우 드물게 바람직한 조절 프로파일의 존재가 아니라 면역 활성의 부재이다¹⁸. 유세포 분석과 같은 기술은 임플란트 장치를 코팅하거나 조직 공학을 위한 스캐폴드를 개발하는 데 사용되는 다양한 생체 재료에 대한 면역 반응 패턴을 특성화하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다¹⁹.

이 정보는 궁극적으로 면역 체계가 잘 견딜 수 있는 임플란트용 생체 재료를 개발하거나 조직 공학에서 건설적인 역할을 할 수 있는 지지체를 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 유세포 분석에 의한 분석을 위한 시료의 적절한 준비는 형광 활성화 세포 분류를 통한 면역 특성 분석에서 부정확한 결과를 피하기 위한 중요한 단계입니다^20,21. 따라서 본 연구는 스캐폴드 조직에서 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하는 데 활용할 수 있는 상세한 방법론을 제시한다.

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프로토콜

참고: 그림 1 은 유세포 분석 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다.

1) 시약 준비

1. 효소 희석 및 조직 배양을 위한 배지를 준비합니다.
   1. 5mL의 RPMI 배지에 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충 용액을 넣고 잘 흔듭니다. 더 사용할 때까지 배지를 4°C에서 보관하십시오.
2. 효소 용액의 부피를 계산합니다.
   참고: 효소 용액의 부피는 6웰 플레이트에서 깍둑썰기한 조직을 소화하는 데 필요한 효소(콜라겐분해효소 및 DNase I)를 포함하는 배지의 부피입니다. 샘플 수에 따라 다릅니다.
   1. 다음 방정식을 사용하여 필요한 부피를 계산하십시오.
      (분해할 시료 수) × 5mL의 무혈청 RPMI와 10mM HEPES 완충액
      참고: 예를 들어, 0.1-0.3g의 절개된 비장에 대해 5mL의 배지를 사용하여 효소 용액을 준비합니다. 이 원고에 기술된 효소 소화 프로토콜은 주로 뇌, 신장, 피부, 간, 폐, 비장, 근육을 포함하는 마우스에서 해부된 연조직(0.1 내지 1 g)과 합성 물질 또는 세포외 기질 단백질로 만들어진 피하 임플란트 주위의 캡슐을 위한 것이다. 단단한 연골 조직을 소화하려면 다양한 조건과 소화 효소의 양이 필요할 수 있으며, 이는 최적화를 통해서만 확인할 수 있습니다.
   2. 효소 용액에 필요한 콜라겐 분해 효소와 DNase의 양을 계산하십시오.
      참고: 이 프로토콜에서는 0.25mg/mL의 콜라겐분해효소와 0.2mg/mL의 DNase I이 사용되었습니다. 콜라겐분해효소와 DNase에 필요한 작업 농도는 조직의 종류에 따라 다를 수 있다¹⁹.
3. 1μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 1μL의 생존도 염료( 재료 표 참조)를 첨가하고 용액을 와류시켜 1:1000 생존도 염료 용액을 준비합니다. 더 이상 사용할 때까지 용액을 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
4. PBS 100mL에 소 혈청 알부민(BSA) 1g을 첨가하여 염색 완충액을 준비하고 BSA가 완전히 용해될 때까지 용액을 소용돌이칩니다. 더 이상 사용할 때까지 용액을 4°C에서 보관하십시오.

2) 효소 분해판 설정

1. 각 웰에 70μm 셀 스트레이너가 있는 6웰 플레이트를 설정합니다. 1.1.1단계에서 준비한 배지 3mL를 각 웰에 넣고 얼음 위에서 배양합니다.
2. 나머지 배지(2mL/웰)를 37°C의 인큐베이터 또는 수조에 보관하여 계산된 양의 콜라겐분해효소 및 DNase I을 현탁시킵니다(단계 1.2.2).

3) 세포 분리

1. 절개한 임플란트/조직을 접시에 넣고 가위를 사용하여 곱게 깍둑썰기합니다. 또는 조직 해리기 또는 휴대용 균질화기를 사용하여 기계적 파괴 방법을 활용하십시오. 백혈구의 수가 많기 때문에 비장을 절개하여 각 실행에서 염색 대조군으로 활용하십시오.
   알림: 일부 재료는 더 높은 수준의 섬유증을 유발하므로 이 프로토콜은 섬유화가 높은 재료와 최소 섬유화 재료 모두에 적용할 수 있습니다. 그러나 각 처리 방법은 염색 전에 분해 후 세포 수율과 생존력 모두에 대해 평가해야 합니다. 해부 중 말초 혈액 오염을 피하십시오.
2. 콜라겐분해효소 및 DNase I(1.2.2단계에서 계산된 부피)을 37°C로 데온한 나머지 RPMI(2mL)에 추가합니다. 각 웰에 완전한 효소 용액 2mL를 추가합니다.
3. 플레이트를 배양된 셰이커에 넣고 37°C 및 100rpm에서 45분 동안 보관합니다.
   알림: 플레이트를 쌓을 때 적절한 열 전달을 방해할 수 있으므로 주의하십시오.
4. 한편, 가위로 3μL 팁 끝에서 4-1000mm를 잘라 현탁액 디스펜싱 팁을 준비합니다. 배양 후 웰의 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 잘게 썬 팁을 사용하여 완전히 혼합합니다. 세포 여과기를 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 소화된 용액을 세포 여과기에 통과시킵니다.
   참고: 70μm 세포 여과기는 알긴산과 같은 이식된 생체 재료에서 세포를 분리하기에 충분합니다. 더 높은 순도가 필요한 경우 밀도 구배 분리와 같은 공정을 사용하여 농축된 백혈구 집단을 얻을 수 있습니다.
5. 1x PBS 용액으로 웰을 헹구고 스트레이너를 통해 헹굼량을 옮긴 다음 튜브의 부피가 50mL에 도달할 때까지 1x PBS 용액으로 스트레이너 세척액을 추가합니다.
   참고: 1x PBS는 분해물의 점도 증가를 방지하고 원심분리 중에 세포 펠릿을 허용하기 위해 실온에 있어야 합니다.
6. 실온에서 300× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 펠릿을 1x PBS의 1000μL에 다시 현탁시키고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
7. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 혼합하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하기 위한 계수 챔버 슬라이드 또는 현미경으로 기존 방법을 통해 계수하기 위해 혈구계에 현탁액을 로드합니다. 또는 유세포 분석 세포 계수 비드를 사용할 수 있습니다.

4) 유세포 분석을 위한 염색

1. 그림 2는 45개의 샘플, 형광 마이너스 1(FMO) 대조군, 보정 대조군 및 완전히 염색된 비장 시료 대조군이 있는 14색 실험의 플레이트 레이아웃 예를 참조하십시오. 총 세포 수를 추정한 후 각 샘플에 대해 1 × 10 6 세포를 염색하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하고 각 보정 및 FMO 제어에 대해 0.5 × 10⁶ 세포를 계산합니다. 필요한 부피의 셀 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트의 웰에 분주하고 1x PBS로 부피를 100μL로 구성합니다.
   참고: 예를 들어, 단계 3.6에서 얻은 1000μL의 셀 현탁액이 40 × 10 6 셀을 포함하는 경우 1 × 10 6 셀에 대해 1000/40 × 10⁶ = 25μL의 셀 현탁액이 필요합니다.
2. 플레이트를 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인한 다음 100μL의 1:1000 생존도 염료 용액을 사용하여 시료 웰 및 보상 제어 웰에 세포를 재현탁시켜 생존율을 결정합니다( 재료 표 참조).
3. FMO 및 염색되지 않은 웰뿐만 아니라 다른 보정 웰에 있는 세포의 경우 100μL의 1x PBS로 재현탁합니다.
4. 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
5. 그 동안 샘플 및 FMO 대조군을 염색하기 위한 표면 항체 칵테일을 준비합니다(샘플당 50μL 또는 FMO). 항체 칵테일의 예에 대해서는 표 1 을 참조한다.
6. 배양 후 각 웰에 1x PBS 100μl를 추가하고 4°C에서 300× g 에서 5분 동안 스핀다운합니다.
7. 상층액을 흡인하고 200μL의 염색 완충액(1x PBS + 1% BSA)에 재현탁시킵니다. 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
8. 상층액을 흡인하고 50μL의 1x PBS로 보상, FMO 및 염색되지 않은 웰에 세포를 재현탁시킵니다. 항체 칵테일 50μL를 각 샘플 웰 및 FMO 웰에 추가합니다. 각각의 항체를 서로 다른 보상 웰에 추가합니다.
9. 4°C의 어두운 곳에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 각 웰에 150μL의 염색 완충액을 추가하고 세포 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
10. 상층액을 흡인하고, 200μL의 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 고정하지 않고 검체를 분석하는 경우 200μL의 염색 완충액에 재현탁하고 유세포분석기 설정 및 검체 분석에 대한 섹션 6으로 진행합니다. 세포를 고정하는 경우 세척 후 상청액을 흡인하고 4 % 파라 포름 알데히드와 같은 고정제 100μL를 첨가합니다. 세포 내 마커를 염색하는 경우 세포 내 염색에 대한 섹션 5로 진행하여 세포를 고정하고 투과시킵니다( 재료 표 참조). 4°C의 어두운 곳에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
    NOTE: 고정은 일부 형광단의 형광 강도에 영향을 줄 수 있으므로 고정 여부와 관계없이 각 패널을 평가하십시오.
12. 배양 후 1x PBS 100μL를 첨가한 후 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1x PBS에 재현탁한 다음 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
13. 200μL의 염색 완충액에 세포를 다시 현탁시키고 유세포 분석 전에 4°C에서 보관합니다.

5) 세포내 염색

1. 세포 내 마커에 대한 고정 및 투과화를 위해 4.11단계에서 계속하여 적절한 완충액 100μL를 추가합니다. 세포를 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠릿을 200 μL의 고정제-투과성 용액에 다시 현탁시키고; 세포를 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 적절한 완충액에 희석된 세포내 항체로 펠릿을 재현탁시킵니다.
   참고: 항체 유형 및 희석액은 표적 세포에 따라 다릅니다. 예를 들어, 일반적인 세포 내 마커 중 하나는 조절 T 세포를 위한 포크헤드 박스 P3이며, 이는 1:100 희석으로 자주 사용됩니다.
2. 세포 현탁액을 어두운 곳에서 4°C에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후 적절한 완충액 150μL를 추가하고 현탁액을 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 200μL의 염색 완충액에 세포를 다시 현탁시킨 후 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 유세포 분석을 위해 200μL의 염색 완충액에 세포를 흡입하고 다시 현탁시킵니다.

6) 세포분석기 및 보상 설정

1. 샘플을 실행하기 직전에 세포 기반 보상과 달리 비드 기반 보정을 사용하는 경우 보정 비드( 재료 표 참조)를 준비합니다.
   1. 각 형광 크롬 접합 항체에 대해 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 1x PBS 100μL를 추가한 다음 각 튜브에 항마우스 음성 대조군 보상 비드 1방울과 양성 대조군 보상 비드 1방울을 추가합니다. 각 개별 튜브에 적절한 항체 1μL를 추가합니다. 획득하기 전에 5분 동안 와류하고 배양합니다.
      알림: BUV737과 같은 일부 염료는 비드에 결합할 수 없으므로 셀 기반 컨트롤을 사용하십시오.
2. 추적 비드로 유세포분석기 설정을 실행하여 각 실험 전에 유세포분석기를 보정하고 각 실험에 대한 유세포분석기 설정을 유지합니다.
3. 시료를 분석하기 전에 염색되지 않은 시료를 실행하여 측면 산란(SSC) 대 전방 산란(FSC) 플롯에서 세포 집단을 조정하여 세포 집단이 플롯의 중앙에 있고 스케일을 벗어나지 않도록 유세포 분석기를 조정합니다.
4. 염색된 샘플을 잠깐 실행하여 FSC 및 SSC와 각 채널에 대한 전압을 조정하여 이벤트가 각 채널의 로그 스케일을 벗어나지 않도록 합니다. 각 보상 제어에 대해 5,000개의 이벤트를 기록한 다음 양성 및 음성 모집단의 게이팅을 수행합니다. 보상 행렬을 계산한 다음 표본을 실행하여 관심 있는 모집단에 대해 최소 1,000개의 이벤트를 수집합니다.
   알림: 더 큰 색상 패널에 대한 보정은 자동 보정이 과대 또는 과소 보정되기 쉬울 수 있으므로 확인해야 합니다. 각 매개변수는 과잉 또는 과소 보정의 징후를 모니터링하기 위해 다른 모든 매개변수에 대해 그래프로 표시되어야 하며 각 단일 색상 컨트롤을 평가해야 합니다. 더 큰 색상의 실험에 대한 복잡한 보정은 광범위한 유세포 분석 경험이 있는 공동 연구자 또는 핵심 시설의 도움을 받아 수행해야 합니다. 스펙트럼 세포분석기와 같은 새로운 유형의 유세포 분석기는 스펙트럼 불혼합(spectral unmixing)으로 알려진 프로세스를 통해 형광단의 전체 스펙트럼을 활용하며, 이는 표준 보상만 사용하는 것에 비해 형광 중첩을 더 명확하게 구분할 수 있습니다²².

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결과

면역 분석을 위한 유세포 분석 패널의 개발 과정은 종종 기존 데이터 및 해당 분야의 문헌과 결과를 비교하는 데 의존합니다. 유세포 분석에서 집단이 어떻게 존재할 수 있는지에 대한 지식은 데이터의 적절한 해석에 매우 중요합니다. 어쨌든 개체군과 세포 유형은 조직마다 다르게 나타날 수 있으므로 약간의 변동성이 예상됩니다. 잘 정의된 대조 조직의 맥락에서, 이러?...

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토론

본 연구에서는 균일한 세포 현탁액을 얻기 위해 생체재료 임플란트에서 세포를 분리하는 상세한 방법론을 기술한다. 또한 multicolor 유세포 분석을 위한 세포 현탁액을 염색하기 위한 자세한 프로토콜과 최적의 결과를 위해 유세포 분석기를 구성하는 단계가 제공되었습니다. 세포 분리 방법은 여러 단계를 포함할 수 있으며, 종종 수동 조직 절개 후 단백질 분해 효소를 사용한 효소 분해를 사용하?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate