뮤린 테일 림프부종 모델

요약

림프부종은 림프 기능 장애로 인한 사지 부종입니다. 우리는 림프부종의 만성 뮤린 꼬리 모델과 꼬리에 유전화물 전달을위한 조직 나노 트랜스펙션 기술 (TNT)의 새로운 사용을 설명합니다.

초록

림프부종은 림프 기능 장애로 인한 사지 부종입니다. 영향 받은 사지는 액체의 축적 때문에 확대합니다, 지방, 및 섬유증. 이 질병에 대한 치료법은 없습니다. 꼬리 의 밑면 근처에서 초점 전체 두께 피부 절제를 사용하는 마우스 꼬리 모델은 꼬리 부종을 초래하여 림프부종을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이 모형은 혈관 포함 및 결과적인 꼬리 괴사 및 초기 꼬리 팽윤 해상도 귀착될 수 있습니다, 그것의 임상 번역성을 제한하. 만성 뮤린 꼬리 림프부종 모델은 15 주 이상 지속적인 림프부종과 꼬리에 신뢰할 수있는 관류를 유도합니다. 전통적인 뮤린 꼬리 림프부종 모델의 개선은 1) 정밀한 전체 두께 절제 및 림프 클리핑 을 포함 수술 현미경을 사용하여, 2) 고해상도 레이저 반글을 사용하여 수술 후 동맥 및 정맥 관류의 확인, 3) 적외선 레이저 림프 촬영 근처 indocyanine 녹색을 사용하여 기능 평가. 우리는 또한 마우스 꼬리 혈관에 유전화물의 새로운 비 바이러스, 경피, 초점 전달을 위한 조직 나노 트랜스페션 기술 (TNT)를 사용합니다.

서문

림프부종은 림프 기능 장애로 인한 사지 부종입니다. 영향 받은 사지는 액체의 축적 때문에 확대합니다, 지방, 및 섬유증^1. 림프부종은 전 세계적으로^2억5천만 명에게 영향을 미치며^2,3,4. 유방암, 흑색종, 부인과/비뇨기과 종양, 또는 육종과 같은 고체 악성 종양치료를 받는 환자의 20~40%가 림프부종^2,4,5를개발하는 것으로 추정된다. 림프부종으로부터의 이환율은 재발성 감염, 통증 및 기형^6을포함한다. 이 점진적인 평생 질병에 대한 치료법은 없습니다. 현재 치료법은 variaby 효과적인^7및 물리 치료사에 의한 압축, 완전한 충혈 치료, 절제 절차 및 혈관 성 림프 우회^{7,8,9,10,11,12,13,14를}포함하는 미세 수술 수술을 포함한다. 림프부종에 대한 이상적인 치료는 아직 발견되지 않았습니다.

림프부종의 메커니즘과 치료를 공부하는 것은 제한되어 있습니다. ^{림프손상(15,16)에} 이어 1년 동안 평균 지연개시가 발생하고 방사선 및 수술로 이단성 모욕을 경험하는 대부분의 개인은 림프부종^4,6,17을개발하지 않는다. 개, 양, 돼지 를 포함한 대형 동물 모델이^{18,19,20으로}설명되었지만 마우스 꼬리 모델은 용이성, 비용 및 재현성으로 인해 가장 널리 적용되었습니다. 림프부종을 조사하기 위한 마우스 모델은 꼬리 모델, 디프테리아 독소 매개 림프절 제절, 및 축액 또는 포플라이트 림프절 해부^{21,22,23,24,25,26을}포함한다. 대부분의꼬리 모델은^{꼬리(22)의}기저 부근에서 수행되는 림프채널 클리핑으로 초점, 전체 두께 피부 절제를 사용하며, 이로 인해 사람의 림프부종(24,^27,28,29)과유사한 꼬리 부종 및 조직학적 특징이 생긴다. 그러나, 표준 뮤린 테일 모델은 전형적으로 20일 이내에 자발적으로 해결되며 주기적인 꼬리^{괴사(30)를}동반한다. 림프부종 마우스 꼬리 모델은 15주 이상 지속적인 림프부종을 연장하고, 확인된 동맥 및 정맥 안식처를 보여주며, 기능성 림프 기능 장애 평가를 허용합니다.

림프부종의 뮤린 테일 모델은 림프부종을 치료하는 새로운 치료법의 평가를 허용합니다. 유전자 기반 전략은 바이러스^{벡터(31)및32에}의해 중재된 마우스 모델에서 사용되어 왔다. 우리는 또한 림프부종 마우스 꼬리에 유전화물 전달을 위한 새로운 조직 나노 트랜스페션 기술 (TNT)를 사용합니다. TNT는 급속집중전기장^{33,34,35,36에서}나노채널을 이용한 칩을 이용한 직접, 경피유전자^전달을용이하게 한다. 본 모델은 TNT_2.0을 사용하여 마우스^{꼬리(35)의}림프 손상 부위에 잠재적인 유전자 기반 치료제의 초점 전달을 허용하는 것을 포함한다.

프로토콜

이 프로토콜은 기관의 동물 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 동물 실험은 인디애나 대학 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 동물들은 음식과 물 광고 리비툼으로 12시간 밝은 어두운 주기 아래에 보관되었습니다.

1. 마우스 꼬리 림프제의 외과 중단

1. 동등한 성별 분포의 8 주 된 C57BL/6 마우스를 사용 하십시오.
2. 전신 마취 하에 마우스를 100% 산소로 3-4% 이소플루란으로 유도 챔버에 놓고 시술 중에 1-3%의 유지 보수 체이션을 유지합니다.
3. 통증 조절을 위해 0.5 mg/kg 지속 방출(SR) 부프레노르핀을 피하로 투여하십시오.
   참고: 추가 진통제 투여 후 투여: 카프로펜 은 적어도 48 h에 대 한 매 24 시간 및 부피바카인 한 번 절개가 만들어진 후 또는 절개를 닫기 전에, 피부 가장자리에 떨어지는 에 의해 적용 (4 – 6 시간까지 지속).
4. 마우스를 등쪽으로 배치하고 70 %의 이소 프로필 알코올로 꼬리를 준비합니다.
5. 캘리퍼를 사용하여 꼬리의 기지에서 20mm부터 시작하는 5mm 증분에서 절차 전에 꼬리 직경을 측정합니다. 이러한 측정은 잘린 콘^{방정식(37)을}사용하여 볼륨을 계산하는 데 사용됩니다.
6. 베이스에서 20mm 떨어진 꼬리에 3mm 할례 절개를 표시합니다.
7. 멸균 수술 블레이드 (크기 15)로 세심한 3mm 전체 두께 의 피부 절개를 수행하여 모든 근본적인 혈관을 수술 미세 배율하에서 그대로 유지합니다. 우수한 할례 마크(꼬리 베이스로부터 20mm)를 먼저 진피를 통과한 다음, 일주 전체 두께 절개 3mm 단장절에 첫 번째 절개한다.
   1. 수직 전체 두께의 수직 절개를 사용하여 두 절개를 연결합니다. 이쑤시개 미세 픽업을 사용하여 최첨단을 파악하고 현미경을 사용하여 혈관 평면 깊숙한 곳까지 진피와 피상적 인 정맥 내림탈을 조심스럽게 해부하십시오.
8. 0.1 mL의 이소술판 블루(1%)를 꼬리 끝에 피하한다.
9. 수술 현미경의 밑에 측면 꼬리 정맥에 인접한 2개의 림프 채널을 확인합니다. 림프제 는 이소술판 주입 때문에 파란색으로 나타납니다. 직선 미세 수술 가위를 사용하여 림프액을 트랜스캐트합니다. 가위를 사용하여 측면 정맥과 림프절 사이의 평면을 조심스럽게 해부합니다. 그런 다음 림프 용기와 측면 정맥 사이에 한 가위 블레이드의 끝을 통과하고 림프혈관을 트랜스포우기 위해 블레이드를 닫습니다.
10. 무균 부착 투명 드레싱으로 꼬리 상처를 입습니다. 매일 수술 후 절개를 확인하여 감염되거나 출혈이 발생하지 않도록 하고 2주 동안 상처 치료를 제공합니다.
11. 꼬리에 더 이상의 부상을 방지하고 수술 합병증으로 이어질 것 서로를 물에서 동물을 방지하기 위해 동물을 노래하는 집.

2. 레이저 반점 대비 이미징을 갖춘 꼬리 혈관 평가

1. 1.2 단계에서와 같이 마우스를 마취합니다.
2. 꼬리 혈관을 시각화하는 레이저 반점 대비 이미징을 사용하려면 폭을 0.8cm로 설정하고 높이는 1.8cm로, 포인트 밀도를 높고, 프레임 속도는 44개의 이미지/초로, 30초로, 색상 사진을 10초당 1로 설정합니다.
3. 간부와 동맥 관류를 평가하여 가부장제에 대해 평가합니다. 질적으로 흐름의 연속성을 시각화해야 합니다.

3. 근적외선 레이저 혈관 조영술 기능 성 림프 평가

1. 1.2 단계와 같이 동물을 마취
2. 내도시닌 그린(ICG)(ICG)(25 mg/10 mL)을 재구성하고 팁 근처의 탈산 마우스 꼬리에 피하로 0.1mL을 투여한다.
3. 방 조명을 어둡게 합니다. 근거리 레이저 혈관 조영술을 버퍼링 설정에 놓고 라이브 캡처를 배치합니다.

4. TNT를 사용하여 마우스 꼬리에 핵산화물의 초점 전달

1. 1.2 단계에서와 같이 동물을 마취합니다.
2. 국소 피부 각질 제거 크림을 사용하여 마우스 꼬리를 각질 제거합니다.
3. 마우스 꼬리를 콜라게나제 용액(10 mg/mL)에 37°C에서 5분간 담급니다.
4. TNT_2.0 칩^{저장소(35)에}DNA를 적재한다.
5. TNT_2.0 실리콘 칩 장치를 꼬리와 접촉하는 나노니들로 꼬리에 전달되는 원하는 초점 부위위에 놓습니다.
6. 저수지에 양수 전기 프로브를 배치합니다. 음의 프로브를 30G 바늘에 부착하고 바늘을 꼬리에 피하하여 전달 부위에 삽입합니다.
7. 정사각형 파 펄스 전기 자극 (10 x 10 ms 펄스, 250 V, 10 mA)를 적용합니다.

결과

지속적인 림프부종에 대한 마우스 꼬리 모델에 대한 기술은 도 1에도시된다. 그림은 마우스 꼬리 모델의 관련 해부학을 나타낸다. 도 2는 림프부종 유도 후 마우스 꼬리에서 점진적인 붓기와 지속성 림프부종을 보여줍니다. 잘린 원뿔 방정식에 의해 계산된 마우스 꼬리 부피는 주 4에서 피크를 6주차로 정점에 그었으며, 그 다음...

토론

림프부종은 1 차 (선천성) 또는 이차 (iatrogenic 림프) 상해^38,39로분류된다. 이차 림프부종은^{케이스 39의 99%를}포함합니다. 이차 림프부종은 가장 일반적으로 감염에 의해 발생 (filariasis) 또는 림프절절제술 또는^방사선을가진 사후 종양학 치료^4,39. 림프절및 방사선으로 치료된 동물의 70%가 림프?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tegaderm Film		1626W
Surgical Microscope	Leica, Wetzlar, Germany	MSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)	3M, St. Paul, Minn.	1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )	Perimed AB, Stockholm, Sweden)	PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)	Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)	LU3000
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth	Fine Science Tools (USA) Inc.	11019-12
V-Hook	Fine Science Tools (USA) Inc.	18052-12
Scalpel SS NO15	Fischer Scientific	29556
Disposable Needle 30GX1	Fischer Scientific	305128
Operating Scissors	Fischer Scientific	12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in	Fischer Scientific	50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge	Fine Science Tools (USA) Inc.	15024-10
Cardiogreen	Sigma	I2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5ml	Mylan	67457-220-05