후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

요약

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

초록

Drosophila melanogaster male embryonic gonad는 생식 세포 발달, piRNA 생물학 및 틈새 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 발달 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 유리한 모델입니다. 여기에서, 우리는 생체 내 라이브 이미징이 매우 비효율적 인 기간 동안 생식선 ex vivo 영상을 생중계하는 해부 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 배아를 이미징 접시로 옮기고, 적절하게 준비된 수컷 배아를 선택하고, 구조적 무결성을 유지하면서 주변 조직에서 생식선을 해부하는 방법을 설명합니다. 해부 후, 생식선은 공초점 현미경을 사용하여 이미징되어 동적 세포 과정을 시각화 할 수 있습니다. 해부 절차는 정확한 타이밍과 손재주가 필요하지만 일반적인 실수를 예방하는 방법과 이러한 문제를 극복하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리가 아는 한, 이것은 초파리 배아 생식선에 대한 첫 번째 해부 프로토콜이며, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 시간 동안 라이브 이미징을 허용합니다. 이 기술은 약리학적 또는 세포형 특이적 트랜스제닉 조작과 결합하여 그들의 자연적인 생식선 환경에서 세포 내 또는 세포 사이에서 발생하는 임의의 동적 과정을 연구할 수 있다.

서문

Drosophila melanogaster 고환은 많은 역동적 인 세포 과정에 대한 우리의 이해를위한 패러다임으로 사용되었습니다. 이 모델에 대한 연구는 줄기 세포 분열 조절 1,2,3, 생식 세포 발달^4,5, piRNA 생물학 ^6,7,8 및 틈새 줄기 세포 신호 전달 사건^{9,10,11,12,13}에 대해 밝혀 냈습니다. 이 모델은 유전적으로 견인성이 있고 14,15 이고 자연 환경^3,16,17,18에서 줄기 세포를 생생하게 볼 수 있는 몇 안되는 곳 중 하나이기 때문에 유리하다. 그러나이 모델의 라이브 이미징은 성인 조직과 초기 배아 단계로 제한되어 틈새 시장이 처음 형성되고 기능하기 시작하는 정확한 단계 인 후기 배아의 생식선 역학에 대한 지식에 틈을 남겼습니다.

후기 단계의 배아 생식선은 구형으로, 전방의 체세포 틈새 세포와 더 많은 후부 영역에 걸쳐 체세포 생식선 세포에 의해 경화 된 생식 세포⁽¹⁹)로 구성됩니다. 이러한 장기는 초기 배아 단계 17^17,20,21까지 생체내에서 생포상화될 수 ^있다. 추가 이미징은 대규모 근육 수축의 시작으로 인해 예방됩니다. 이러한 수축은 너무 심해서 이미징 프레임에서 생식선을 밀어 내며 이미징 소프트웨어로는 이러한 움직임을 수정할 수 없습니다. 우리 실험실은 라이브 이미징을위한이 애매한 기간 동안 발생하는 틈새 형성의 메커니즘을 공개하는 데 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 배아 단계 16에서 시작하는 생식선을 살아있는 이미지화하기 위한 생체외 접근법을 생성하여, 생식선 발달의 이 중요한 기간 동안 세포 역학에 대한 연구를 용이하게 하였다. 우리 실험실의 이전 연구는이 생체 외 영상이 생체 내 생식선 발달¹⁷을 충실하게 되풀이한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 초파리 배아 생식선에 대한 최초이자 유일한 종류입니다.

여기에서, 우리는 후기 배아 단계 동안 생식선의 생체외 생생 영상화에 필요한 해부 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 약리학적 치료, 또는 생식선 내 특정 세포 계보의 형질전환 조작과 조합될 수 있다. 이 기술을 사용하여, 우리는 줄기 세포 틈새 형성¹⁷의 단계를 성공적으로 이미지화했습니다. 따라서이 이미징 접근법은 자연 환경^15,17 내에서 실시간으로 틈새 형성의 초기 단계를 시각화 할 수 있기 때문에 줄기 세포 생물학 분야에 도움이됩니다. 이 방법은 줄기 세포 생물학 분야에 유익하지만, 세포 재배열 22, 세포 부착^2,12,23 및 세포 이동 ^{23을 포함}하여이 발달 시점 동안 생식선에서 발생하는 임의의 동적 과정을 시각화하는 데 추가로 적용 가능합니다. 따라서 이 해부 프로토콜은 많은 근본적인 세포 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것이다.

프로토콜

1. 전일 해부 준비

1. 생성된 직경이 대략 0.03 mm가 되도록 텅스텐 바늘⁽²⁴ )을 전해적으로 날카롭게 한다. 공급되는 전압을 약 14V로 조정하고 3.3M NaOH를 사용합니다. 선명하게하는 데는 1 ~ 2 분을 넘지 않아야합니다.
   주의: NaOH는 부식성이 강하며 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 취급하는 동안 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드 내부에서 작업하십시오.
   참고: 사용 후 NaOH를 폴리프로필렌 팔콘 튜브에 보관하십시오.
2. 준비된 이미징 미디어를 만듭니다. 15mL 원뿔형 튜브에서 슈나이더 배지 4.25mL를 750μL의 태아 소 혈청(FBS, 최종 농도 15%)과 페니실린-스트렙토마이신 27.5μL(페니실린 0.05U/μL, 최종 농도 0.05μg/μL)와 결합합니다. 이렇게 제조된 이미징 배지를 4°C에서 보관한다.
3. 헵탄 접착제 용액을 만드십시오. 약 0.5 mL 헵탄을 약 20 cm 양면 테이프로 채워진 20 mL 밀봉가능한 바이알에 첨가한다. 약 한 시간 동안 너트 테이터에 올려 놓거나 물과 글리세롤 사이의 일관성이 달성 될 때까지 피펫 팁으로 저어줍니다. 용해 된 접착제의이 용액은 헵탄이 증발하기 전에 며칠 동안 지속됩니다. 용액을 신선하게하려면 0.5 mL의 헵탄을 추가로 넣고 흔들어줍니다.
   참고 : 효과적인 헵탄 접착제 용액은 테이프에 대한 헵탄의 다양한 비율뿐만 아니라 흔들림 / 교반의 다양한 기간을 사용하여 준비 할 수 있습니다. 위의 사양은 그러한 적절한 솔루션 중 하나를 준비하거나 신선하게하기위한 제안 일뿐입니다.

2. 배아 채취—해부 전 15~17시간

1. 신선한 효모 페이스트를 사과 주스 한천 플레이트⁽²⁵)에 첨가하십시오. 작은 구멍²⁶으로 천공 된 빈 음식 병에 성인 파리 (10 일 미만)를 추가하여 배아 수집 케이지를 설정하십시오. 효모화된 한천 플레이트를 사용하여 수집 케이지를 캡핑하고, 병에 테이핑하고, 플레이트 측과 함께 케이지를 25°C 어두운 인큐베이터에서 1시간 동안 아래로 놓는다.
   참고 : 파리는 생식선을 형광으로 표시하는 이식 유전자를 발현해야합니다 (예 : six4-eGFP : : Moesin²⁰)는 배아의 해부가 입체 형광 현미경으로 발생하기 때문입니다. 생식선을 표시하는 데 사용되는 유전자형 목록은 자료 표를 참조하십시오.
2. 인큐베이터에서 케이지를 제거하고 첫 번째 컬렉션을 버리십시오. 갓 효모 한천 접시로 교체하고 케이지를 2 시간 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
   참고 : 첫 번째 배아 수집은 수정 된 배아의 암컷을 지우고 배아를 발달시키는 데 사용되어 단단히 정해진 두 번째 배아 수집을 달성합니다.
3. 케이지에서 한천 플레이트를 꺼내 밀봉 가능한 플라스틱 용기 내부의 촉촉한 종이 타월에 효모가 묻은 쪽을 위쪽으로 향하게하십시오. 이 습한 챔버를 25 °C 인큐베이터에 두어 배아를 14.5 시간 동안 숙성시킵니다 (최종 나이, 알을 낳은 후 14.5-16.5 시간).
   참고: 2.4단계를 시작하기 직전에 3.1단계와 3.2단계를 완료하십시오.
4. 인큐베이터에서 한천 플레이트를 제거하고 분출 병을 사용하여 한천 플레이트에 충분한 물을 첨가하여 페인트 브러시로 가볍게 양치하여 효모 페이스트를 용해시킵니다. 배아를 헹구고 효모를 계량 보트 안에 앉아있는 작은 메쉬 스크린 바구니에 녹입니다. 대부분의 효모 페이스트가 메쉬를 통해 여과 될 때까지 물 분출 병으로 바구니를 헹구십시오.
5. 계량 보트에서 물을 제거하고 바구니를 다시 안에 넣으십시오. 배아를 50 % 표백제 용액에 담그고 분출 병을 사용하여 배아를 Dechorionate하십시오. 표백제 용액의 깊이는 3-5mm이어야합니다. 배아를 표백제에 잠기고 ~ 2 분 동안 가끔 소용돌이치게하십시오.
   주의: 표백제는 부식성이 있으며 눈과 호흡기를 자극하거나 손상시킬 수 있습니다. 표백제를 다루는 동안 장갑과 고글을 착용하십시오.
   참고: 이 시간 동안 3.3단계를 가능한 한 많이 완료하십시오. 데코리오네이션 진행은 바스켓을 스테레오 현미경 아래에 놓고 등쪽 부속기가 없는지 확인하여 확인할 수 있습니다. 필요한 경우 배아를 표백제 용액에 추가 시간 동안 잠급니다.
6. 표백제를 버리고 바구니 안의 배아를 분출 병의 물로 철저히 헹구십시오 (~ 3 초 동안 메쉬 바구니를 종이 타월로 얼룩지게하고 2-3 번 반복하십시오).

3. 해부 당일 준비

1. 30 μL 인슐린 (10 mg/mL)을 1.5 mL 에펜도르프 튜브 (0.2 mg/mL 최종 농도)에서 준비된 이미징 배지 (단계 1.2 참조)에 첨가하십시오. 잘 섞어서 튜브를 벤치 탑에 두어 실온과 평형을 유지하십시오.
2. 접착제로 코팅 된 커버 슬립 스트립을 준비하십시오.
   1. 다이아몬드 팁이 달린 나이프를 사용하여 22mm x 22mm 커버슬립을 동일한 크기의 네 개의 스트립으로 자릅니다(그림 1A).
   2. 포셉을 사용하여 스트립 하나를 집어 들고 총 약 30μL의 헵탄 접착제 용액을 스트립의 양쪽에 퍼뜨립니다(그림 1B). 접착제 잔류 물의 균일 한 층을 얻으려면 헵탄이 증발하는 동안 스트립을 다양한 각도로 기울이십시오.
   3. 접착제로 덮인 스트립을 커버 슬립 박스의 빈 슬롯에 보관하십시오. 끈적임을 유지하려면 스트립을 기울어지지만 똑바로 세운 위치에 놓고 상자 가장자리에 기대어 상자 표면과의 접촉을 최소화합니다(그림 1C). 공기 중의 미립자가 접착제를 코팅하지 않고 끈적 거림을 줄이도록 상자를 닫으십시오.
3. 벤치 탑에 다음 품목을 놓습니다 : 6 인치 유리 파스퇴르 피펫, 현미경 슬라이드, 적절한 피펫 팁이있는 P200 및 P1000 피펫만, 링거 용액²⁷ (NaOH로 pH가 7.3으로 조정됨) 및 밝혀지지 않은 Poly-D-Lysine 코팅 35mm 이미징 디쉬.
4. 메쉬 스크린 바구니에서 배아를 500-750 μL 헵탄으로 채워진 작은 시계 유리로 옮깁니다.
   1. 바구니의 측면과 바닥을 블롯하여 티슈 닦아내기로 말립니다. 헵탄에 페인트 브러시를 적시고 페인트 브러시를 배아에 닿은 다음 (소수성 비텔린 막은 강모에 달라 붙어야합니다), 페인트 브러시를 시계 유리의 헵탄에 다시 담그십시오 (배아는 바닥에 가라 앉아야합니다).
      참고 : 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행해야합니다. 배아는 20 초 이상 공기에 노출되어서는 안됩니다.
5. 배아를 파스퇴르 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드 상으로 옮깁니다(그림 1D). 배아를 피펫에 천천히 넣고 피펫의 좁은 부분으로 제한하십시오. 피펫 배아를 슬라이드에 천천히 올려 놓으면 슬라이드로 흘러 들어가기 전에 피펫 끝 바로 안쪽에 응집됩니다. 조직의 모서리를 닦아내고 미세한 팁으로 닦아내고 슬라이드의 배아에서 헵탄을 떼어냅니다. 그들은 더 작은 영역을 집계하고 덮을 것이므로 다음 단계에서 접착제로 덮인 스트립에서 쉽게 캡처 할 수 있습니다.
6. 포셉으로 접착제로 덮인 스트립을 집어 들고 배아에 부드럽게 만집니다 (그림 1E). 스트립을 이미징 접시, 배아 사이드 업 및 Poly-D-Lysine 코팅 센터 바로 바깥에 놓습니다. 포셉을 사용하여 접시에 스트립을 눌러 제자리에 고정되도록하십시오. 즉시 접시에 2-3.5 mL 링거의 용액을 넘치게하십시오. 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 배아를 먼저 잠수시킵니다 (그림 1F).

4. 해부

참고: 이러한 단계는 스테레오 형광 현미경으로 수행해야 합니다.

1. 10-15 개의 배아를 일탈시킵니다.
   참고 : 이것은 초보자를위한 두 개의 배아에서 전문가를위한 열 다섯 개의 배아에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.
   1. 장 형태학에 따라 16단계 배아를 선택합니다(그림 2). 이 단계에서 배아는 네 개의 누적 된 장 세그먼트를 만드는 세 가지 장 수축을 가지고 있습니다 (그림 2 B, B'). devitellinization을 시작하려면, 텅스텐 바늘로 한쪽 끝, 바람직하게는 앞쪽에 선택된 배아를 관통하십시오. 배아는 비텔린 막에서 튀어 나올 수 있지만, 그렇지 않은 경우 배아에서 막을 벗겨냅니다.
      참고: 해부하기에는 너무 어린 배아는 비지역화된 내장을 가지고 있습니다(그림 2C). 17 단계 배아의 해부는이 단계에서 큐티클이 발달하기 시작하기 때문에 16 단계 배아의 해부보다 더 어렵습니다. 초기 단계 17 배아는 서로 상대적으로 이동되는 네 개의 장 세그먼트와 함께 존재합니다 (그림 2 D, D').
   2. 생식선에서 멀리 떨어진 지역의 배아를 통해 바늘을 걸으십시오. 후크 된 배아를 접시의 폴리 라이신 코팅 영역 (여기서부터 단순히 "커버 슬립"이라고 함)으로 옮기고 부착 될 때까지 바닥에 드래그하십시오. 이 단계를 반복하고, 폴리라이신 코팅 커버 슬립(그림 3A)의 상단을 따라 파괴된 배아를 연속적으로 배열하고, 추가 해부를 위해 아래에 충분한 공간을 남겨 둡니다.
      참고 : 생식선은 사용 된 특정 마커와 전이유전자 사본 수에 따라 밝게 형광을 띄어야하는 세포의 작은 구형 응집체로 나타납니다. 이 단계에서 생식선은 A5 세그먼트에 측면으로 위치하며 앞쪽에서 배아 길이의 약 70 % -80 %에 위치합니다. 해부 프로토콜 전반에 걸쳐, 조직은 바늘에 달라 붙을 수 있습니다. 파편의 바늘을 제거하려면 링거 용액의 표면 바로 위에 올려 놓습니다. Devitellinization은 적절한 생식선이 가능한 한 적게 방해받는 한 깔끔하지 않을 수 있습니다.
2. 생식선을 배아에서 꺼내 접시 위에 올려 놓습니다 (그림 3C, D).
   1. 먼저, 배아를 파일럿하여 그 내부를 노출시킨다(도 3C). 배아를 중심에서 슬라이스하여 바늘을 후방으로, 생식선 사이로 움직입니다. 외부 큐티클보다 접시에 훨씬 잘 달라 붙을 것이므로 내부 조직을 놀리십시오. 조직의 끈적 거림은 다음 조작이 생식선을 드러내고 커버 슬립에 부착 할 수있게합니다.
      참고 : 조직이 접시에 달라 붙지 않으면 코팅 된 커버 슬립의 오염되지 않은 영역에 동축하십시오. 커버 슬립의 외부 영역은 특히 끈적 끈적합니다. 단계 4.1.2에서 언급했듯이, 해부 조작이 생식선이 상처가없는 한 맹글링 된 배아 시체를 초래하는지 여부는 중요하지 않습니다.
   2. 바늘을 사용하여 생식선을 포함한 조직 조각이 나머지 시체에서 분리 될 때까지 생식선 주위를 슬라이스하십시오. 바늘로이 조직을 코팅 된 커버 슬립의 신선한 부위에 당기고 접시에 부착 될 때까지 바닥에 대고 동축하십시오.
      참고 : 생식선 자체가 덮여있는 조직을 통한 간접적 인 부착보다는 덮개 슬립에 직접 부착되는 경우에 가장 적합한 이미징이 달성됩니다. 따라서 조직이 시체에서 멀어지면서 생식선이 외부 조직보다는 덮개 슬립을 먼저 만지도록 시도하십시오.
   3. 바늘로 생식선으로부터 부착 조직을 부드럽게 드래그하여 가능한 한 많은 주변 조직을 생식선으로부터 제거한다(그림 3D). 생식선을 직접 만져서 손상되지 않도록 하십시오(그림 4E). 생식선이 접시에 충분히 부착되도록 하려면 바늘을 생식선 주위의 부드러운 원형 운동으로 움직입니다 - 움직이면 바늘을 나머지 부착 조직에 대고 고나드를 끈적 끈적한 덮개 슬립의 신선한 영역으로 향하게하십시오. 생식선의 감지 가능한 움직임이 없을 때까지이 과정을 반복하십시오.
   4. 배아 시체로 돌아가서 두 번째 생식선을 해부하십시오. 가능한 한 많은 배아에서이 과정을 반복하지만 25 분을 초과하지 마십시오. 조직 생존력은 ~ 40-45 분 이상 후에 링거의 솔루션에서 손상 될 것입니다.
3. 해부가 완료되면 지울 수없는 마커를 사용하여 이미징 접시의 바깥 쪽 테두리에 등록 마크를 추가하여 해부 중 방향을 기록하십시오.
4. 접시에서 접착제로 코팅 된 스트립을 제거하십시오.
   1. 스트립 아래에 포셉 한 쌍의 바닥 단자를 부드럽게 삽입하고 걸쇠를 천천히 위쪽으로 기울여 링거 용액의 슬로싱을 최대한 줄이면서 접시에서 꺼내어 부착 된 생식선의 방해를 최소화하십시오.
      참고 : 스트립은 해부 된 생식선에서 멀리 기울여야합니다.
5. 링거 용액의 슬로싱을 피하는 방식으로 접시를 이미징 현미경으로 부드럽게 운반하십시오.

5. 이미징

1. 이미징 접시를 무대 홀더에 놓고 등록 마크를 사용하여 접시를 해부 중과 같이 대략적인 방향으로 놓습니다. 밝은 필드 현미경과 저전력 (~ 10x) 목표를 사용하여 커버 슬립에 부착 된 조직 조각을 식별하고 초점을 맞 춥니 다. 아이피스 설정을 전환하여 형광을 드러내고, 쌍안경 접안 렌즈를 사용하여 접시를 체계적으로 스캔하여 이미징 소프트웨어 내에서 각 생식선의 위치를 표시합니다( 자료 표 참조).
   참고: 위치를 표시하기 전에 생식선이 시야각에 집중되어 있는지 확인하십시오.
2. 이미징 접시를 홀더에 넣고 전체 스테이지 홀더 어셈블리를 조심스럽게 분리하고 어셈블리를 작업대에 놓습니다.
3. 링거의 용액을 인슐린을 함유한 준비된 이미징 배지로 교체하십시오 (단계 1.2 및 3.1 참조).
   1. P1000을 사용하여 이미징 접시의 내부 상단 선반에서 모든 링거 용액을 제거합니다(중앙 커버 슬립 영역에서 링거를 피펫하지 마십시오). 그런 다음 P200으로 전환하고 팁을 중앙 영역의 나머지 링거 표면 바로 아래에 놓습니다. 조심스럽게 링거 50-100 μL를 제거하십시오. 전체 솔루션을 제거하지 마십시오.
   2. ~200μL의 이미징 미디어를 뽑아서 P200 팁을 나머지 링거의 표면 바로 아래에 다시 놓고 천천히 이 이미징 미디어를 추가합니다. 다음으로, 나머지 이미징 매체 (~ 1,300 μL)를 상단 선반의 최외곽 테두리에서 시작하여 접시에 추가하십시오. 피펫팅하는 동안 유체의 중앙 돔쪽으로 이동하고 결국 두 가지를 가로 질러 피펫 팁을 브러시하여 두 가지를 병합합니다. 뚜껑을 접시에 올려 놓습니다.
      참고: 이미징 미디어는 증발을 방지하기 위해 접시의 전체 내부 직경(약 2mm 깊이)을 덮어야 합니다(그림 4D).
4. 현미경을 더 높은 동력 목표 (63x, 1.2 NA)로 전환하고 사용 된 목표 (목표에 필요한 침지 유체 유형 및 굴절률)에 따라 적절한 침지 유체를 적용한 다음 스테이지 홀더 어셈블리를 교체하십시오. 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미징 접시의 바닥에 부착 된 조직에 초점을 맞 춥니 다.
   참고 : 무대가 움직이지 않았다면, 목표가 집중되면 마지막 생식선이 보입니다.
5. 표시된 각 생식선 위치를 단계별로 실행하고 필요에 따라 해당 위치를 조정하십시오. 이미지 선명도, 생식선 섹스 등을 기반으로 이미지 할 생식선을 선택하십시오. 이미징 설정(다중 채널, 노출 시간, 레이저 강도, Z 시리즈 증분, 적절한 간격의 타임랩스 등)을 사용자 지정합니다. 이미징을 시작합니다.
   참고 : 남성 생식선은 틈새 시장과 생식선의 반대쪽 끝, 남성 특이적 체세포 생식선 전구체 (msSGPs)라고 불리는 작고 매우 원형의 체세포 클러스터의 존재로 식별 할 수 있습니다. six4-eGFP::moesin 형광 마커가 사용되는 경우, 틈새 세포는 생식선에서 두 번째로 밝은 세포이며, 가장 밝은 것은 msSGP입니다. 이 단계에서 여성 생식선에는 틈새 시장이나 msSGP가 없습니다.

결과

우리는 "해부 준비의 날"에 설명 된 바와 같이 그림 1의 이미징 접시의 준비를 보여줍니다. 이러한 방법은 궁극적으로 덮개 슬립 스트립에 잘 수화 된 배아를 발생시켜야하며, 이는 일시적으로 접시의 바닥에 고정되고 링거 용액에 잠겨 있습니다 (그림 1F). 다이아몬드 팁 나이프를 사용하면 22mm x 22mm 커버 슬립을 서너 개의 작은 스트립으로 깨끗하게 슬?...

토론

생식선 형성 동안, 배아 생식선, 특히 남성 생식선⁽¹⁵) 내의 줄기 세포 틈새는 급속한 형태 학적 변화를 겪습니다. 이러한 역동적 인 변화의 기초가되는 발달 메커니즘은 라이브 이미징 기술을 통해 가장 잘 이해됩니다. 그러나, 배아 단계 17에서, 생식선의 생체내 영상화는 대규모 근육 수축(¹⁷)의 시작에 의해 불가능하게 된다. 이 프로토콜을 통해 우리는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024