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요약

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

초록

전통적으로 대량 생화학 분석에 사용되는 Xenopus laevis 계란 추출물은 세포질 분열, 유사분열 방추 형성 및 핵 조립과 같은 세포질 현상을 연구하기 위한 강력한 이미징 기반 도구로 부상했습니다. 희박한 시점에서 샘플링된 고정 추출물을 이미지화하는 초기 방법을 기반으로 하는 최근의 접근 방식은 타임랩스 현미경을 사용하여 라이브 추출물을 이미지화하여 향상된 시간 해상도로 보다 역동적인 특징을 드러냅니다. 이러한 방법은 일반적으로 이미징 용기의 정교한 표면 처리가 필요합니다. 여기에서는 화학적 표면 처리가 필요하지 않은 계란 추출물의 라이브 이미징을 위한 대체 방법을 소개합니다. 구현이 간단하고 대량 생산된 실험실 소모품을 이미징에 활용합니다. 우리는 광시야 및 컨포칼 현미경 모두에 사용할 수 있는 시스템을 설명합니다. 2차원(2D) 분야의 이미징 추출물을 위해 설계되었지만 3D 이미징으로 쉽게 확장할 수 있습니다. 세포질 내에서 공간 패턴 형성을 연구하는 데 적합합니다. 대표적인 데이터를 통해 우리는 이 방법을 사용하여 제조된 간기 추출물에서 미세소관, 핵 및 미토콘드리아의 전형적인 동적 조직을 보여줍니다. 이러한 이미지 데이터는 세포질 역학 및 공간 조직에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다.

서문

세포질은 세포의 주요 부피를 구성하며 뚜렷한 조직을 가지고 있습니다. 진핵 세포질의 성분은 미세 소관 과꽃 및 골지체와 같은 광범위한 공간 구조로 자체 조립 될 수 있으며, 이는 세포의 정체성과 생리적 상태에 따라 동적으로 배열되고 뒤집어집니다. 따라서 세포질의 공간적 조직과 세포 기능과의 연관성을 이해하는 것은 세포가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 중요합니다. Xenopus laevis 계란 추출물은 전통적으로 벌크 생화학 분석 1,2,3,4,5,6,7,8에 사용되어 왔지만 최근의 연구는 세포질 구조 및 세포 기능에 대한 기계 론적 연구를위한 강력한 라이브 이미징 시스템으로 확립되었습니다 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. 이들 희석되지 않은 추출물은 세포질의 많은 구조 및 기능을 보존하는 한편, 종래의 세포 기반 모델(19,20)에서는 달성할 수 없는 세포질 내용물의 직접 조작을 허용한다. 이것은 세포질 현상을 특성화하고 기계적 토대를 해부하는 데 이상적입니다.

추출물을 이미징하기 위한 기존의 방법은 화학적 표면 개질 또는 미세유체 장치의 제조를 필요로 한다. 하나의 커버슬립-기반 방법은 유리 커버슬립(21)의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 패시베이션을 필요로 한다. 마이크로 에멀젼 기반 방법은 유리 표면22,23에 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H- 퍼플 루오로 옥틸) 실란의 증착을 필요로한다. 미세유체 기반 시스템은 추출물 액적의 부피, 형상 및 조성을 정밀하게 제어할 수 있지만, 특수한 미세가공 설비(11,12,24)가 필요하다.

여기에서는 구현하기 쉽고 쉽게 구할 수 있는 저렴한 재료를 활용하는 계란 추출물을 이미징하는 대체 방법을 소개합니다. 여기에는 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 테이프로 코팅된 슬라이드와 커버슬립이 있는 이미징 챔버의 준비가 포함됩니다. 이 챔버는 입체경과 정립 및 도립 현미경을 포함한 다양한 현미경 시스템으로 추출물을 이미징하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 위에서 논의한 기존 유리 기반 방법으로 얻은 유사한 광학 선명도를 달성하면서 표면의 화학적 처리가 필요하지 않습니다. 2D 필드에 걸쳐 균일한 두께의 추출물 층을 이미지화하도록 설계되었으며 추출물의 3D 볼륨을 이미지화하도록 쉽게 확장할 수 있습니다. 넓은 시야에서 집단 세포질 행동의 타임 랩스 이미징에 매우 적합합니다.

우리는 이미징 방법을 시연하기 위해 간기 정지 계란 추출물을 사용했습니다. 추출물 제제는 Deming 및 Kornbluth19의 프로토콜을 따릅니다. 간단히 말해서, 감수 분열 II의 중기에서 자연적으로 체포 된 난자는 저속 스핀에 의해 분쇄됩니다. 이 스핀은 감수 분열 정지로부터 세포질을 방출하고 추출물이 간기로 진행되도록합니다. 일반적으로, 사이토칼라신 B는 F-액틴 형성을 억제하기 위해 분쇄 스핀 전에 첨가된다. 다만, F-액틴이 필요한 경우에는 생략할 수 있다. 사이클로헥시미드는 또한 간기 추출물이 다음 유사분열로 들어가는 것을 방지하기 위해 분쇄 스핀 전에 첨가됩니다. 추출물은 이후 전술한 이미징 챔버에 배치되고 현미경에 놓입니다. 마지막으로, 현미경에 연결된 카메라에 의해 정의된 간격으로 시간이 지남에 따라 이미지가 기록되어 2D 필드에서 추출물의 동적 동작을 캡처하는 타임랩스 이미지 시리즈를 생성합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 슬라이드 및 커버슬립 준비

  1. 불소화 에틸렌 프로필렌(FEP) 접착 테이프 층을 롤러 어플리케이터가 있는 유리 슬라이드에 적용합니다. 깨끗한 면도날로 가장자리에 과도한 테이프를 잘라냅니다. 같은 방법으로 FEP 테이프 코팅 커버슬립을 준비합니다(그림 1A).
  2. 양면 접착 이미징 스페이서를 슬라이드의 FEP 테이프 코팅면에 적용합니다. 상단의 보호 라이너를 벗겨지지 않은 상태로 둡니다(그림 1A).
    알림: 슬라이드와 커버 슬립은 실험 전에 준비해야합니다. 즉시 사용하거나 상자에 보관하여 표면에 먼지가 쌓이는 것을 방지할 수 있습니다. 이미징 스페이서의 웰은 깊이가 120μm이고 직경이 9mm입니다.

2. 간기 정지 계란 추출물의 제조 및 라이브 이미징

참고: 다음 프로토콜은 Deming and Kornbluth19, Murray20, Smythe 및 Newport25 에서 수정되었습니다. 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행해야 합니다.

  1. 난자 채취 3-10 일 전에 성숙한 암컷 Xenopus laevis 개구리를 100IU의 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)으로 등쪽 림프낭에 피하 주사하십시오.
  2. 계획된 난자 수집 16 시간에서 18 시간 전에 2.1 단계의 개구리에 500IU의 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG)을 주입합니다. 개구리를 산란 완충액(100mM NaCl, 2mM KCl, 1mM MgSO 4·7H2O, 2.5mM CaCl2·2H2O, 0.5mM hepes, 0.1mM EDTA)에 18°C로 방치하고 pH7.4에서 20x 원액으로 준비하고 사용하기 전에 깨끗한 개구리 탱크 물로 1x로 희석하여 알을 모을 때까지.
  3. 실험 당일, 큰 유리 페트리 접시에 계란을 모으고 계란 품질을 평가하십시오. 흰색의 푹신한 공처럼 보이거나 끈에 나타나는 계란은 버립니다(그림 1B). 입체경 아래에서 계란을 검사하고 계란을 정상적인 모양으로 유지하고(그림 1C) 불규칙하거나 얼룩덜룩한 색소가 있는 계란은 버립니다(그림 1D).
    알림: 이 프로토콜은 일반적으로 hCG 주사 후 25시간까지 16mL의 알을 낳는 단일 개구리에서 채취한 알과 함께 작동합니다. 일반적으로 hCG에 의해 총 3-6 마리의 개구리가 유도되며, 추출물 제조 실험을 위해 계란 품질이 가장 높은 개구리가 선택됩니다.
  4. 계란을 400mL 유리 비커에 옮기고 디캔팅하여 가능한 한 많은 알을 낳는 완충액을 제거합니다.
  5. 계란을 새로 준비한 탈염 용액 100mL(물에 2% w/v L-시스테인, NaOH로 pH 8.0으로 조정)에 넣고 주기적으로 부드럽게 소용돌이칩니다. 약 3 분 후, 용액을 붓고 100mL의 신선한 탈염 용액을 첨가한다. 알이 단단히 채워질 때까지 (계란 사이에 공간 없음) 배양을 계속하되 총 5 분 이상 탈염 용액에 알을 두지 마십시오.
  6. 디캔팅에 의해 가능한 한 많은 탈염 용액을 제거하고, 계란을 0.25x MMR 완충액(25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.25 mM MgCl2, 0.5 mMCaCl2, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM Hepes)에서 세척하고, 10x 원액으로 제조하고, NaOH로 pH 7.8로 조정하고, 완충액을 첨가하여 Milli-Q 물에 희석하고, 계란을 소용돌이 치고 버퍼를 붓습니다. 세척에 총 1L의 완충액이 사용될 때까지 몇 번 반복하십시오.
  7. 총 400mL의 계란 용해 완충액(250mM 자당, 10mM hepes, 50mM KCl, 2.5mMMgCl2, 1mM DTT, 신선하게 만들고 KOH로 pH 7.7로 조정)으로 계란을 몇 번 씻습니다. 세척 사이에 파스퇴르 피펫을 사용하여 비정상적인 모양의 계란을 제거하십시오.
    알림: 비정상적인 모양의 계란은 흰색 푹신한 공처럼 보이거나(그림 1B), 얼룩덜룩한 색소 침착이 있거나(그림 1D), 성장하는 흰색 영역과 함께 악화되거나(그림 1E), 동물 반구에서 어둡고 수축된 색소 영역을 보이는 계란을 나타냅니다(그림 1F).
  8. 끝 부분을 활짝 연 상태로 이송 피펫을 사용하여 계란을 계란 용해 완충액 1mL가 들어 있는 17mL 둥근 바닥 원심분리 튜브로 옮깁니다. 400 x g 의 임상 원심 분리기에서 튜브를 15 초 동안 돌려 계란을 포장합니다.
  9. 파스퇴르 피펫을 사용하여 포장된 계란 상단에서 계란 용해 완충액을 최대한 제거합니다.
    알림: 계란 추출물의 희석을 최소화하기 위해 포장된 계란에서 가능한 한 많은 완충액을 제거하는 것이 중요합니다. 때로는 이를 달성하기 위해 잔류 완충액과 함께 느슨한 계란을 제거해야 합니다.
  10. 포장된 계란의 대략적인 부피를 결정한 다음 포장된 계란 위에 직접 5μg/mL 아프로티닌, 5μg/mL 류펩틴, 5μg/mL 사이토칼라신 B 및 50μg/mL 시클로헥시미드를 추가합니다.
    참고: 아프로티닌과 류펩틴은 프로테아제 억제제입니다. 사이토 칼라 신 B는 액틴 중합을 억제하여 추출물이 수축하고 겔화되는 것을 방지합니다26. 사이클로 헥시 미드는 단백질 합성을 억제하여 추출물을 세포주기의 간기에 유지합니다.
  11. 스윙 버킷 로터에서 튜브를 12,000 x g, 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 계란을 분쇄합니다.
    참고: 원심분리가 끝나면 난자가 파열되고 용해물이 세 개의 주요 층으로 분리되어야 합니다: 상단의 노란색 지질 층, 중간의 세포질 추출물(조추출물이라고도 함), 하단에 안료 과립을 포함하는 어두운 조밀한 층(그림 1G).
  12. 18 게이지 바늘을 주사기에 부착하십시오. 바늘 끝 경사가 위를 향하게하여 세포질 층의 바닥 측면에서 튜브를 뚫고 천천히 그려서 추출물을 회수합니다.
    참고: 노란색 지질층에서 오염 물질이 포함되지 않도록 세포질 추출물을 천천히 그립니다.
  13. 회수된 세포질 추출물을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 올려 놓습니다. 1 시간 이내에 추출물을 사용하십시오.
  14. 이미징할 준비가 되면 원하는 시약과 형광 이미징 프로브로 추출물을 보충합니다.
    참고: 형광 이미징 프로브는 형광 현미경으로 시각화할 수 있도록 특정 세포질 구조에 레이블을 지정합니다.
  15. 단계 1.2에서 준비된 슬라이드의 이미징 스페이서에서 상단 보호 라이너를 제거하고 웰 중앙에 약 7μL의 추출물을 침착시킵니다. FEP 면이 추출물을 향하도록 FEP 테이프 코팅된 커버슬립을 즉시 적용하여 웰을 밀봉합니다. 이미징을 빠르게 진행합니다(그림 1H, I).
  16. 전동 스테이지와 디지털 카메라가 있는 도립 또는 직립 현미경에 슬라이드를 놓습니다. 명시야 채널과 형광 채널 모두에서 원하는 공간 위치와 시간 간격으로 추출물을 이미지화합니다.
    참고: 일반적으로 5x 대물렌즈가 이미징에 사용됩니다. 전동 스테이지는 정의된 여러 공간 위치에서 자동화된 이미지 획득을 가능하게 합니다. 명시야 현미경은 투명도가 다른 세포질 구조를 시각화합니다. 형광 현미경은 단계 2.14에서 추가된 형광 이미징 프로브에 의해 특이적으로 표지된 세포질 구조를 시각화합니다. 카메라는 이러한 구조의 타임 랩스 이미지를 기록하여 세포질 조직의 역학을 캡처합니다.

결과

Xenopus laevis 계란 추출물은 간기 동안 세포질의자가 조직을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 도 2A는 성공적인 실험으로부터의 결과를 도시한다. 간기 핵의 재구성 및 시각화를 허용하기 위해 27 핵 / μL 및 0.38 μM 정제 된 GST-GFP-NLS27,28,29,30 (글루타티온 -S- 트랜스퍼 라제,...

토론

Xenopus laevis 계란 추출물은 다양한 세포 내 구조 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 및 세포질 조직 전체에 대한 이미징 기반 연구를위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다.

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 원고에 대한 의견을 주신 J. Kamenz, Y. Chen 및 W. Y. C. Huang에게 감사드립니다. 이 작업은 James E. Ferrell, Jr.에게 수여된 국립 보건원(R01 GM110564, P50 GM107615 및 R35 GM131792)의 보조금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
17 ml centrifuge tubeBeckman Coulter337986
22x22 mm square #1 cover glassCorning284522
AprotininMilliporeSigma10236624001Protease inhibitor
CycloheximideMilliporeSigma01810Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin BMilliporeSigmaC6762Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogsNascoLM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin proteinCytoskeleton, Inc.TL488M-AFor visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin proteinCytoskeleton, Inc.TL670M-AFor visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tapeCS Hyde company23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)MilliporeSigmaCG10
Imaging spacerElectron Microscopy Sciences70327-8S
LeupeptinMilliporeSigma11017101001Protease inhibitor
Microscope slidesFisher Scientific12-518-100B
Mineral oilMilliporeSigma330760
MitoTracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)BioVendorRP1782725000
Roller applicatorAmazonB07HMBJSP8For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640For removing excessive FEP tape
Transfer pipetteFisher Scientific13-711-7M

참고문헌

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