JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

예쁜꼬마선충(C. elegans) 흥분독성 모델에서 이 프로토콜은 생체 내 이미징을 사용하여 괴사성 신경퇴행의 조절, 후보 매개체를 암호화하는 유전자의 영향 및 미토콘드리아의 관여를 분석합니다. 세포 해리 및 분류는 신경 퇴행 및 신경 보호 메커니즘에 대한 세포 특이적 전사체 분석을 위해 위험에 처한 뉴런을 구체적으로 얻는 데 사용됩니다.

초록

외부 독성 괴사는 신경 퇴행의 주요 형태입니다. 이러한 조절된 괴사 과정은 신경전달물질인 글루타메이트의 시냅스 축적과 시냅스후 수용체의 과도한 자극에 의해 유발됩니다. 그러나 이러한 유형의 신경 퇴행의 뚜렷한 신경 세포 팽창 형태에서 절정에 이르는 후속 분자 사건에 대한 정보는 부족합니다. 특정 세포 내 구획의 변화 또는 뚜렷한 뉴런 아형의 차별적 세포 취약성의 기초와 같은 다른 측면은 아직 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 또한, 시험관 내 또는 생체 외 제제를 사용하는 연구에서 작용하는 다양한 요인은 이러한 형태의 신경 퇴행의 자연스러운 진행을 수정하고 왜곡할 수 있습니다. 따라서 선충 Caenorhabditis elegans의 유전적으로 순응하고 투명한 모델 시스템에서 신경 괴사의 정도를 조절하는 중재의 효과를 모니터링하여 살아있는 동물의 흥분독성 괴사를 연구하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans) 뉴런의 흥분독성 괴사를 연구하는 방법을 설명하며, 광학적, 유전적, 분자적 분석을 결합합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 흥분독성 상태를 유도하기 위해 글루타메이트 수송 유전자(glt-3)의 녹아웃(knockout)을 신경 세포 민감성 유전자 배경(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)])과 결합하여 글루타메이트 수용체 과자극 및 신경 퇴행을 생성합니다. 살아있는 동물을 대상으로 한 Nomarski 미분 간섭 대비(DIC), 형광 및 컨포칼 현미경 검사는 신경 퇴행을 정량화하고, 형광 표지된 단백질의 세포 내 국소화를 추적하고, 퇴행 뉴런의 미토콘드리아 형태를 정량화하는 데 사용되는 방법입니다. FACS(Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting)는 신경 퇴행의 세포 유형 특이적 전사체 분석을 위해 위험에 처한 뉴런을 뚜렷하게 분류하는 데 사용됩니다. 실시간 이미징 및 FACS 방법의 조합과 예쁜꼬마선충 모델 유기체의 이점을 통해 연구자들은 이 시스템을 활용하여 큰 표본 크기로 재현 가능한 데이터를 얻을 수 있습니다. 이러한 분석에서 얻은 통찰력은 신경퇴행성 질환에 대한 치료 개입을 위한 새로운 표적으로 해석될 수 있습니다.

서문

외부 독성은 뇌 허혈에서 신경 세포 사멸의 주요 원인이며 여러 신경 퇴행성 질환 1,2,3,4,5,6,7,8,9의 기여 요인입니다. 뇌로 가는 산소가 공급된 혈류의 중단(예: 혈전으로 인해)은 글루타메이트 수송체의 오작동을 일으켜 시냅스에 글루타메이트가 축적되도록 합니다. 이러한 글루타메이트의 과잉은 시냅스 후 글루타메이트 수용체(GluRs)를 과도하게 활성화하여 Ca2+가 뉴런으로 과도한(촉매적, 비화학량론적) 유입을 초래합니다(그림 1A). 이러한 해로운 유입은 형태학적으로나 기계적으로 세포사멸(apoptosis)에서 조절된 괴사(regulated necrosis)에 이르기까지 진행성 시냅스후 신경퇴행으로 이어진다 10,11,12. 비록 동물 모델에 대한 성공적인 중재에 기초하고 있지만, Ca2+ 진입을 차단하고 세포 생존력을 촉진하기 위한 GluR 길항제에 대한 여러 임상 시험은 임상 환경에서 실패했습니다 13,14,15,16. 이러한 실패의 결정적인 원인일 수 있는 것은 (동물 모델과는 달리) 임상 환경에서의 치료가 뇌졸중 발병 후 몇 시간 후에 시행되어 중재가 GluRs 14,16,17의 하류에서 퇴행성 신호를 차단하지 않으면서 늦게 작용하는 신경 보호 메커니즘을 차단한다는 사실입니다. 혈전용해술에 기초한 대안적 접근법은 극도로 제한된 시간 내에만 시행할 수 있기 때문에 많은 환자들(발병 시점을 잘 알 수 없는 집에서 뇌졸중을 앓고 있는)은 이 방법의 혜택을 받지 못하고 있다17. 이러한 좌절은 흥분독성 연구를 GluR 초자극 후 발생하는 사건 연구에 집중하고 후속 퇴행성 연쇄 반응을 동시 신경 보호 과정과 구별해야 할 필요성을 강조합니다. 이 접근법은 세포 손상을 예방하고 손상 발병 후 나중에 투여할 수 있는 효율적인 약물 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

흥분독성의 후속 사건을 식별하는 한 가지 방법은 미토콘드리아 붕괴로 이어지는 것과 같은 GluR 과자극의 하류에서 세포 사멸 신호 전달 메커니즘을 연구하는 것입니다. 미토콘드리아 생리학 및 역학의 급격한 오작동은 흥분독성 18,19,20에서 볼 수 있듯이 신경 퇴행의 특징입니다. 모든 세포가 생존, 활동 및 세포 유지를 위해 미토콘드리아 기능과 가용성에 의존하는 반면, 뉴런은 신호 전달 및 전파를 지원하기 위해 특히 미토콘드리아 에너지 생산에 의존합니다. 구체적으로, 뉴런은 산소와 포도당에 대한 의존도가 높은, 시냅스후 수용체/채널21의 활성화 후 휴지막 전위를 회복하기 위해 신호 관련 에너지 소비의 ~50%를 소비합니다. 뇌졸중에서 관찰되는 포도당과 산소의 가용성 감소는 심각한 미토콘드리아 변화를 일으켜 ATP 생산을 더욱 감소시킵니다 19,22,23,24. 그러나 미토콘드리아 붕괴로 이어지는 일련의 사건을 규명하기 위한 연구는 논란의 여지가 있는 결과를 낳았고 합의가 부족했습니다. 미토콘드리아 형태를 분석하면 미토콘드리아 병리학으로 이어지는 이러한 사건을 이해하는 데 도움이 될 수 있는데, 이는 미토콘드리아 병리학이 뉴런 건강의 좋은 지표이기 때문입니다 25,26,27,28,29. 사상(filamentous mitochondria)은 건강한 뉴런을 대표하는 반면, 단편화된 미토콘드리아는 세포 사멸로 이어질 수 있는 상당한 뉴런 손상을 나타냅니다. 다양한 유전적 조건에서 살아있는 동물의 미토콘드리아 형태를 분석하면 흥분독성에서 미토콘드리아 의존성 신경 변성과 관련된 특정 유전자 및 경로에 초점을 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다.

흥분독성 신경퇴행의 정도를 조절할 수 있는 후속 사건을 확인하는 또 다른 접근법은 흥분독성의 영향 중 일부를 완화하는 전사 신경보호 메커니즘을 연구하는 것입니다14,16. 그러나 주요 신경보호 전사 인자의 특이성 부족과 실험 설정의 차이는 핵심 신경보호 프로그램(특히 조절된 괴사)을 명확하게 식별하려는 노력의 성공을 방해합니다.

그러므로, 다운스트림 사망 신호 경로에 대한 연구와 흥분독성에 대한 전사 신경 보호에 대한 연구는 모두 관찰된 결과에 대해 큰 어려움과 의견 불일치에 직면했습니다. 이러한 논란의 대부분은 흥분독성에 대한 체외 또는 체외 모델의 사용과 다양한 실험 설정의 특이성으로 인해 발생하는 가변성에서 발생할 가능성이 높습니다. 따라서 고도로 보존된 핵심 메커니즘을 식별하는 데 집중하고 생체 내에서 연구하는 것이 매우 유익합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 단순 모델 시스템은 특히 강력하고 다양한 연구 도구의 강력한 조합, 핵심 세포 사멸 경로의 보존, 신경계의 구조 및 연결성에 대한 풍부한 정보 30,31,32,33. 실제로, 기계감각 뉴런에서 괴사성 신경퇴행의 유전자 분석에 대한 드리스콜 연구실의 독창적인 연구는 이 접근법의 힘을 보여주는 훌륭한 사례이다34. 흥분독성 분석에 중요한 것은 선충의 신호 전달 경로 보존에는 글루타메이터성 신경 전달의 모든 주요 구성 요소가 포함된다는 것입니다35,36.

선충 흥분독성 모델은 이러한 독창적인 연구를 기반으로 하여 연구자가 글루타메이트 의존성 신경독성의 영향을 받는 뇌졸중 및 기타 신경퇴행성 질환에서 발생하는 것과 유사한 생화학적 과정을 연구할 수 있도록 합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 흥분독성 상태를 유도하기 위해 이 실험적 접근법은 글루타메이트 수송 유전자(glt-3)의 녹아웃과 신경 세포 감작 유전자 배경(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)])의 조합인 흥분독성 균주를 사용하여 GluR 과자극 및 신경퇴행을 생성합니다37. 이 흥분독성 균주는 시냅스에서 글루타메이터성 연결, 흥분독성 신경퇴행에 대한 30개의 특이적(glr-1 발현) 뉴런을 노출시킵니다. 이 30개의 위험에 처한 뉴런 중 개별 뉴런은 동물이 발달을 통해 진행됨에 따라 괴사를 겪으며(혼합된 확률성과 특정 특정 뉴런에 대한 부분적인 선호38), 동시에 세포 사체도 점차적으로 제거되고 있습니다. 많은 돌연변이 균주에 대한 접근성과 함께 이 접근 방식을 사용하면 신경 퇴행 및 신경 보호에 영향을 미치는 여러 경로를 연구할 수 있습니다. 이러한 접근법은 이미 일부 다운스트림 죽음 신호 캐스케이드(downstream death signaling cascades)39 및 흥분독성(excitotoxicity)에서 흥분독성 신경퇴행의 전사 조절인자(transcriptional regulators)38,40를 분석하는 데 사용되었다. 기생충41에서 괴사성 신경퇴행의 다른 사례와 마찬가지로, 선충의 흥분독성 신경변성은 고전적인 세포사멸40을 포함하지 않는다.

이 방법 논문은 예쁜꼬마선충 에서 흥분독성 괴사성 신경변성을 유도, 정량화 및 조작하는 기본 시스템을 설명합니다.또한, 선충 흥분독성의 특정 측면에 대한 연구를 간소화하기 위해 현재 사용 중인 두 가지 주요 프로토콜에 대해 간략하게 설명합니다. 형광 리포터와 실시간 생체 내 이미징을 사용하여 연구원은 흥분독성 신경퇴행의 선충 모델에서 미토콘드리아 관여 및 역학을 연구할 수 있습니다. 특정 신경 보호 전사 인자의 효과를 결정하기 위해 연구자는 형광 마커의 세포 유형별 발현, 동물을 단일 세포로 해리 및 FACS를 사용하여 흥분 독성으로부터 괴사 위험이 있는 특정 뉴런을 분리할 수 있습니다. 이러한 세포 유형 특이적 분리된 뉴런은 주요 전사 인자에 돌연변이가 있는 균주에서 RNA 염기서열분석에 사용할 수 있습니다. 이러한 방법을 종합하면 연구자들은 흥분독성 신경퇴행 및 신경보호의 분자적 토대를 매우 명확하고 정밀하게 생체 내에서 밝혀낼 수 있습니다.

프로토콜

1. Excitotoxic Neurodegeneration & Neuroprotection을 조사하기 위하여 이용되는 긴장

  1. 선충 흥분독성 균주 ZB1102를 표준 흥분독성 신경변성의 기준점으로 사용합니다.
    참고: 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 글루타메이트 의존성 흥분독성(glutamate-dependent excitotoxicity)은 글루타메이트 수송체의 녹아웃(KO) 과 이러한 동물의 뉴런을 신경독성에 민감하게 만드는 전이유전자(transgene)를 결합하여 ZB1102 균주에서 생성되며, 이는 시냅스에서 글루타메이터성 연결로의 시냅스 후 뉴런의 하위 집합에서 발현됩니다37. 이 유전적 조합은 선충 흥분독성 균주(nematode excitotoxicity strain)라고 하며, Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에서 무료로 구할 수 있습니다.
  2. 흥분독성 괴사의 후보 조절인자를 암호화하는 유전자의 효과를 연구하려면 이러한 유전자의 돌연변이(예: dapk-1 또는 crh-1)를 선충 흥분독성 균주와 결합하십시오.
  3. wormbook.org42,43에 설명된 바와 같이 표준 C. elegans 방법30에 따라 유전자 교배를 수행합니다.
  4. 돌연변이의 분자적 기초는 일반적으로 문서화되어 있기 때문에 PCR을 사용하여 특정 유전자 자리의 유전형 분석을 통해 교차 자손을 따릅니다. WT와 돌연변이를 단편 크기(결실의 경우) 또는 염기서열분석(점 돌연변이의 경우)으로 구별합니다.
    참고: 표 1 은 특히 이 프로토콜에 대해 신경 퇴행 및 신경 보호의 뚜렷한 경로를 연구하는 데 사용된 균주를 간략하게 설명합니다.
  5. 두 개의 독립적인 라인으로 모든 임계 균주를 도출하고 별도로 테스트하여 관찰된 표현형의 유효성을 확인합니다.

2. 성장 매체와 축산

  1. 표준 방법에 따라 OP50 E.coli를 파종한 표준 NGM 플레이트30,37,42 또는 MYOB 플레이트38,44에서 16-25°C에서 웜을 성장시킵니다.
    참고: MYOB 플레이트는 NGM 플레이트와 동일한 결과를 제공하지만 준비하기가 약간 더 쉽습니다.
  2. 실험 균주를 일관되게 잘 먹이면서 유지하십시오.
    참고: 굶주림은 신경 퇴행에 영향을 미치고 죽어가는 머리 뉴런의 수를 줄일 수 있습니다. 지렁이가 제대로 먹지 못하거나 굶주리면 새 접시에 접시에 담고 실험을 계속하기 전에 몇 세대를 기다립니다. 세대를 초월한 기아의 영향은 몇 세대가 지나면 약해질 것이다.

3. Nomarski 미분 간섭 대비(DIC) 및 채점에 의한 퇴화 머리 뉴런의 정량화

  1. 선충 흥분독성 균주(ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V)를 정량을 위한 실험 대조군으로 사용하여 정상적인 흥분독성 수준을 나타냅니다. 이 프로토콜은 다른 발달 단계를 통해 동일한 동물을 따르지 않습니다. 대신, 혼합된 단계의 동물 개체군에 대한 스냅샷을 제공하므로 전체적으로 모든 발달 단계를 나타내기 위해 다른 동물로부터 정보를 수집합니다.
    참고: nuls5 전이유전자[Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (시냅스 후 글루타메이터 연결에서 뉴런에서 활성화된 Gαs 및 GFP를 발현)는 ~1 죽어가는 머리 뉴런/동물(발달 중 주어진 시간에)의 배경 GluR 독립 괴사성 신경퇴행 수준을 생성합니다. glt-3 (ko) 의 추가는 GluR 의존적 방식으로 시냅스후 nuIs5 발현 뉴런의 괴사성 신경 퇴행을 증가시켜 세 번째 유충 단계 (L3) 37에서 4-5 개의 죽어가는 머리 뉴런까지 올라갑니다.
  2. 테스트 균주의 경우 최근에 완료된 유전자 교배의 동물을 사용하거나 신선한 교배에서 준비된 -80 °C 냉동 스톡에서 관심 균주를 해동합니다. 표현형과 신경 퇴행을 기록하기 전에 몇 세대(≥4)를 기다립니다.
  3. 잘 먹은 동물의 혼합 단계 개체군의 접시에서 한천의 작은 조각을 잘라 제거하고 한천 덩어리를 뒤집어 커버 슬립에 장착하여 한천 표면을 기어 다니던 동물이 이제 커버 슬립을 향하도록합니다.
    참고: 동물은 여전히 움직일 수 있지만 이제 다소 구속되어 마취제 없이 관찰할 수 있습니다. 이러한 덩어리는 새 덩어리로 교체하기 전에 ~ 1 시간 동안 사용할 수 있습니다.
  4. x10 안구 및 x40 또는 x63 대물렌즈가 있는 반전된 DIC 스코프를 사용하여 커버슬립을 수동으로 밀어 동물을 무작위로 스캔합니다. 아래에 설명된 다른 이미징 단계는 도립 현미경 또는 정립 현미경에서 수행할 수 있지만, 한천 덩어리의 벌레를 검사하려면 거꾸로 된 스코프가 필요합니다.
  5. 자궁의 모양으로 각 동물의 발달 단계를 식별합니다(wormbook.org 의 자궁 다이어그램 참조).
  6. 각 동물에 대해 발달 단계와 죽어가는(즉, 진공 상태의) 뉴런 수를 기록합니다. 머리에서 죽어가는 뉴런의 총 수, 후방포신경절(retrovesicular ganglion)에서 죽어가는 뉴런의 수(특정 세포를 쉽게 식별할 수 있음), 꼬리에서 죽어가는 뉴런의 수(글루타메이트의 영향을 받지 않고 내부 대조군 역할을 하여 감작 이식유전자 nuIs5 가 완전히 활성화되었음을 확인)를 세고 기록합니다.
  7. 이 데이터를 주어진 균주의 동물이 발달 단계의 범주별로 그룹화된 표에 기록합니다.
  8. 각 세션에서 여러 발달 단계의 웜에서 무작위로 데이터를 수집합니다. 통계 분석을 위한 충분한 데이터를 수집하기 위해 여러 날에 걸쳐 여러 점수 매기기 세션을 수행합니다. 여러 단계에서 신경 퇴행 수준을 기록하고 그림 1C와 유사한 막대 그래프를 구성합니다.
    참고: 이 방법을 사용하면 특정 치료 또는 돌연변이가 모든 단계에서 신경퇴행 수준을 높이거나 낮추는지(분포를 위/아래로 이동) 또는 신경퇴행의 정점을 이전 또는 후기 발달 단계로 이동시키는지(분포를 왼쪽/오른쪽으로 이동)를 결정할 수 있습니다.
  9. 유전자형의 정체를 알지 못하는 상태에서 데이터 수집을 수행합니다. 유전자 계통의 두 개의 독립적인 분리물에서 확인하고(분리된 세포 간의 다른/예상치 못한 유전적 차이로 인한 의도하지 않은 영향의 위험을 최소화하기 위해) 분석을 위해 데이터를 풀링합니다.
  10. 각 균주에서, 각 발달 단계에서 머리(후방포신경절 포함)에 있는 퇴화 뉴런 수의 평균과 SEM을 계산합니다(그림 1D). 필요에 따라 죽어가는 후방포성 신경절(retrovesicular ganglion)과 꼬리 뉴런(tail neuron)에 대해서도 유사한 분석을 수행합니다.

4. 특정 퇴화하는 머리 뉴런의 확인

  1. 한천 패드46에 개별(또는 작은 그룹의) 동물을 장착하고 테트라미솔로 벌레를 마비시킵니다(아래 섹션 5 참조).
  2. 형광 및 DIC 범위(직립 또는 반전)가 결합되어 특정 진공 뉴런을 찾습니다.
  3. GFP 표지된 프로세스를 추적하고 세포체의 위치 및 프로세스의 모양을 WormAtlas47을 사용하여 glr-1을 발현하는 것으로 알려진 뉴런의 모양과 비교하여 진공 뉴런의 특정 뉴런 정체성을 결정합니다.
    참고: 대안적으로, Hobert lab48에서 곧 제공될 다색 라벨링을 통해 뉴런을 신속하게 식별할 수 있는 새로운 방법에 의해 식별이 지원될 수 있습니다.

5. 리포터 균주의 형광 현미경에 의한 신경 미토콘드리아 형태의 라이브 이미징

  1. 퇴화하는 시냅스후 뉴런(원래 흥분독성 균주에서 세포질 GFP로 표지됨)의 미토콘드리아 변화를 이미징하려면 mito-mCherry 형광을 검사하십시오.
  2. 시냅스후 뉴런의 미토콘드리아를 적색 형광으로 표지하는 균주로 테스트 흥분독성 균주를 교차시킵니다( glr-1 프로모터 하에서 형광 단백질과 TOM-20의 N-말단 사이의 융합을 발현함으로써, 구성 및 균주에 대한 자세한 내용은49 참조). 이제 일반 epifluorescence microscope(정립 또는 도립형) 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 동물을 이미지화할 수 있습니다.
  3. 신경 세포 생존에 영향을 주지 않고 기생충을 마비시키기 위해 5μL의 10mM 테트라미솔을 갓 준비한 아가로스 패드에 피펫으로 분사합니다. 패드 준비에 대한 자세한 프로토콜은 Arnold et al.46 을 참조하십시오.
  4. 동물을 테트라미솔 드롭의 중앙에 놓고 커버슬립으로 장착합니다.
  5. 커버슬립의 측면을 매니큐어로 밀봉하고 매니큐어를 말리십시오.
  6. 테트라미솔 처리 후 20분 이내에 DIC 및 형광 이미징이 있는 내시경을 사용하여 20x 대물렌즈를 사용하여 기생충을 찾습니다.
  7. 기생충의 머리(또는 관심 뉴런)를 찾으면 100x 오일 대물렌즈로 이동하여 체액에 있는 미토콘드리아의 형광 표지에 초점을 맞춥니다.
  8. DIC, GFP 및 TxRed 필터 설정을 사용하여 Z 스택 이미지를 캡처합니다.

6. 뉴런 미토콘드리아 형태학, 채점 및 정량화

  1. 웜의 실시간 이미징 중 또는 ImageJ 또는 기타 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득 후에 미토콘드리아 형태를 분석합니다.
  2. 특정 뉴런을 쉽게 식별하고 반복적으로 분석하기 위해 후방포신경절에 있는 3개의 뉴런, RIGL/R 및 AVG를 식별합니다(경우에 따라 흥분독성으로 인한 세포 사체 청소로 인해 2개만 존재함).
  3. 미토콘드리아는 세 가지 주요 그룹으로 분류합니다 : 필라멘트, 중간, 단편화50,51,52.
    참고: 필라멘트 미토콘드리아는 일반적으로 핵을 둘러싸고 있는 뉴런의 소마에서 연속적이고 얇은 구조로 나타납니다. 중간 미토콘드리아는 비록 단절이 있기는 하지만 적어도 하나의 명백한 필라멘트 네트워크의 조합으로 나타나며 체마의 일부 단편화로 나타납니다. 단편화된 미토콘드리아는 미토콘드리아 네트워크가 완전히 끊어지고, 부풀어 오르며, 체세포 전체에 흩어져 있습니다(그림 2A).
  4. 각 웜에 대해 총 30개 이상의 웜에 대해 필라멘트, 중간 또는 단편화된 미토콘드리아가 있는 뉴런의 백분율을 점수화합니다.
  5. 일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행한 후 균주53 간의 각 미토콘드리아 형태에 대해 사후 투키(Post hoc Tukey) 검정을 수행합니다.

7. 신경 퇴행 위험이 있는 뉴런의 FACS에 대한 웜 해리를 위한 완충액 및 시약 준비

  1. 다음과 같이 M9 완충액을 준비한다 : KH2PO4 3g, Na2HPO4 6g, NaCl 5g, H2O 내지 1 L. 오토 클레이브로 살균한다. 필터 멸균된 1M MgSO4 1mL를 추가합니다. 실온에서 보관하십시오.
  2. 다음과 같이 계란 완충액을 준비합니다 : 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 ; 살균하기 위하여 오토클레이브. 2M의 HEPES pH 7.3 원액 (이전에 0.2 μm 병 상단 필터로 여과 됨)을 최종 농도 25mM에 첨가합니다. 1N NaOH(10mL 이하)로 pH를 7.3으로 조정합니다. 삼투압계를 사용하여 최종 삼투압이 335 -345mOsm 사이인지 확인합니다. 필터는 0.2μm 보틀탑 필터로 난자 완충액을 살균합니다. 4 °C에 보관하십시오.
    참고 : MgCl2 ·6H2O 및 CaCl2·2H2O를 사용하여 각각의 MgCl2 및 CaCl2 원액을 만들 때 염이 더 쉽게 용해됩니다. 또한 10x 계란 완충액을 만들고 필요할 때 멸균 탈이온수에 희석할 수 있습니다.
  3. 다음과 같이 SDS-DTT를 준비합니다 : 20 mM HEPES pH 8.0, 0.25 % SDS, 200 mM DTT, 3 % 자당. 조직 배양 후드에서 0.2μm 주사기 필터로 SDS-DTT를 멸균합니다. 300 μL 분취액을 -20 °C에서 호일로 덮어 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
  4. 다음과 같이 pronase 용액을 준비하십시오 : 난자 완충액에서 15 mg / mL pronase 해리 일을 준비하십시오. 얼음에 보관하세요.

8. 뉴런 특이적 FACS에 대한 연령 동기화

  1. 흥분독성 유전자형(및 원하는 경우 다른 돌연변이)을 분류에 쉽게 사용할 수 있는 강력한 형광 마커의 형질전환 발현과 결합하는 동물을 사용합니다(예: FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. 20°C에서 2개 또는 3개의 100mm NGM/MYOB 플레이트에서 플레이트가 주로 임신성 지렁이로 가득 찰 때까지 동물을 성장시킵니다.
  2. M9 버퍼를 사용하여 플레이트에서 벌레를 씻어냅니다. 유리 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 웜을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  3. 실온에서 250x g 에서 2.5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
  4. 10mL의 표백제 용액(멸균 탈이온수에 2% 10N NaOH 및 5% 신선한 가정용 표백제)에 웜 펠릿을 재현탁합니다.
  5. 셰이커에 튜브를 수평으로 놓고 저속으로 흔듭니다. 벌레가 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 하십시오. 표백제는 기생충의 표피를 갈라뜨리지만 난자 껍질로 보호되는 배아에는 영향을 미치지 않습니다.
    1. 이 표백 단계는 약 5분이 소요되지만 상황에 따라 다릅니다. 과도한 백화가 발생하지 않도록 하려면 1분마다 샘플을 회수하여 프로세스를 모니터링하십시오. 유리 현미경 슬라이드의 각 튜브에서 10μL를 부드럽게 피펫팅하고 해부 현미경을 사용하여 벌레를 검사합니다.
  6. 대부분의 gravid worms가 금이 가 열렸지만 완전히 용해되지 않으면 원뿔형 튜브에 난자 완충액을 채워 표백 단계를 멈춥니다.
  7. 난자/배아를 채취하려면 250x g 에서 2.5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 난자 완충액으로 다시 씻습니다.
  8. 네 번 더 씻으십시오.
  9. 펠릿을 부드럽게 피펫팅하여 난자를 다시 현탁시키고 100mm 파종된 NGM/MYOB 플레이트 4개에 펴 바릅니다. 배아가 부화하여 20°C에서 3일 동안 자라게 합니다.
    참고: 이제 접시는 주로 중력이 있는 벌레로 가득 차야 합니다.
  10. 이 표백제/연령 동기화 프로토콜을 반복하여 연령 동기화를 반복합니다.
  11. 8개의 100mm NGM/MYOB 플레이트에 난자를 피펫으로 넣습니다. 동물이 원하는 유충 단계까지 20 °C에서 부화하고 자라게하십시오.

9. FACS를 위한 전체 웜 세포 해리

  1. 동기화된 웜을 원하는 발달 단계로 성장시킵니다. M9 버퍼와 유리 혈청학 피펫으로 100mm 플레이트를 부드럽게 씻어내고 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  2. 차가운 M9를 최대 45mL까지 첨가합니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 올려 놓으면 지렁이가 중력에 의해 바닥에 가라앉을 수 있고, 플레이트에 남아 있는 박테리아 파편은 상층액에 떠 있습니다.
  3. 상층액을 제거하고 새 M9로 벌레를 씻으십시오.
  4. 얼음 위에 중력이 가라앉는 과정을 30분 동안 반복합니다.
  5. 상층액을 제거하고 M9를 최대 45mL까지 첨가한 후 250 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 펠릿을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 M9를 최대 1mL까지 추가합니다.
  7. 탁상용 원심분리기에서 14,000rpm으로 1분 동안 회전하고 상층액을 제거합니다.
  8. 큐티클을 파괴하려면 펠릿 부피의 (대략) 두 배를 사용하여 SDS-DTT로 웜 펠릿을 재현탁하고 L2-성체 단계의 경우 4분 동안 실온에서 흔들면서 배양합니다.
    알림: SDS-DTT 처리가 길어질수록 형광 단백질 신호가 급격히 감소하므로 SDS-DTT에서 4분을 초과하여 배양하지 마십시오. SDS-DTT는 빛에 민감하기 때문에 시간이 지남에 따라 용액의 효능이 손실되었을 수 있으므로 3개월을 넘지 않아야 합니다. 해리는 최근에 준비된 SDS-DTT 솔루션에서 가장 잘 작동합니다.
  9. SDS-DTT 처리를 중지하려면 최대 1mL까지 1x 계란 완충액(pH 7.3, 335-345 mOsm)을 추가합니다.
  10. 탁상용 원심분리기에서 14,000rpm으로 1분 동안 회전하고 상층액을 제거합니다.
  11. 큐티클을 추가로 파괴하고 동물의 세포를 해리하려면 펠릿 부피의 3배를 사용하여 펠릿을 실온 프로나제 용액으로 재현탁합니다.
  12. 실온에서 15-30분 동안 배양합니다.
  13. P-200 또는 P-1000 피펫을 사용하여 5분마다 40회 위아래로 피펫을 만들고 피펫 팁으로 튜브 바닥을 만집니다.
    알림: 팁이 튜브 바닥에 닿을 때 생성되는 압력은 웜 해리를 촉진합니다. 필터 팁을 사용하여 신속한 피펫팅 중에 웜이 실수로 피펫 샤프트에 들어가지 않도록 하십시오.
  14. 15분 후 유리 슬라이드에 5μL를 부드럽게 피펫팅하고 해부 현미경으로 진행 상황을 관찰하여 웜 해리의 진행 상황을 확인합니다. 손상되지 않은 웜의 대부분(~90%)이 터지면 프로세스가 완료된 것입니다.
    참고: 많은 벌레가 손상되지 않은 경우 Pronase 배양을 확장할 수 있습니다.
  15. 세포 배양 후드에 최대 1.5mL까지 1x 난자 완충액을 추가하여 프로나제 처리를 중단합니다.
  16. FACS 튜브로 옮기고 5mL 계란 완충액을 추가한 다음 800 x g 에서 5분 동안 회전합니다.
  17. 상층액을 제거하고 3mL pf 난자 완충액에 재현탁합니다.
  18. 새 FACS 튜브에 70μm 세포 스트레이너 캡을 놓고 스트레이너에 피펫 세포 현탁액을 놓고 800 x g 에서 1분 동안 회전합니다. 유출 세포 현탁액을 수집합니다.
  19. 새 FACS 튜브에 5μm 셀 스트레이너 캡을 놓고 스트레이너에 피펫 셀 현탁액을 놓고 800 x g 에서 1분 동안 회전합니다.
  20. 계란 완충액에 최종 농도 0.5μg/mL를 위해 DAPI를 추가하고 빛으로부터 보호하기 위해 뚜껑/덮개가 있는 얼음 위에 놓습니다.
  21. 가능한 한 빨리 FACS를 수행합니다. 형광 단백질 신호는 시간과 빛에 노출됨에 따라 감소하므로 가능한 한 빨리 해리 프로토콜을 수행하고 해리가 완료된 직후 FACS를 수행하는 것이 중요합니다.
    참고: 웜 해리 프로토콜은 Miller 연구소55,56,57, Murphy 연구소58 및 Shaham 연구소59의 프로토콜에서 채택되었습니다.

10. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 뉴런 동정을 위한 FACS 기계 작동 수정

  1. C. elegans 뉴런을 분류할 때 표준 칼집 유체 대신 4리터의 냉장(4°C) 난자 완충액을 사용하십시오.
    참고: 예쁜꼬마선충 세포의 삼투압은 포유류 세포보다 훨씬 높으며 표준 초액은 뉴런을 파열시킵니다. 모든 기계 설정 및 보정은 계란 버퍼의 점도가 표준 칼집 유체의 점도와 다르기 때문에 계란 버퍼가 추가된 후에 수행됩니다. 선별 기술자는 레이저가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 기계를 통해 진단 비드를 실행합니다.
  2. 분류된 뉴런을 후속 전사체학 연구에 사용하는 경우, 최소 100,000개의 GFP+ 세포를 800 μL의 Trizol-LS + 10 μL의 RNase inhibitor로 직접 분류합니다.
  3. Trizol의 세포를 15회 뒤집어 혼합합니다.
  4. 드라이 아이스/에탄올 수조에서 스냅 동결하고 한 번의 RNA 염기서열분석 실험을 위해 모든 샘플에서 RNA를 추출할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 대부분의 분류된 세포는 전사체 분석을 위해 Trizol에 직접 수집되지만, 분류 효율성에 대한 현미경 검증을 위해 난자 완충액에 수집된 GFP+ 분류된 세포(각 균주에서)의 작은 샘플을 검색해야 합니다.

11.FACS 게이팅 전략

  1. GFP 포지티브 신호를 식별하려면 530/30 필터 및 502 롱 패스(LP)와 함께 488nm 레이저를 사용하십시오.
  2. DAPI 양성 및 음성 세포를 식별하려면 450/50 필터와 함께 405nm 레이저를 사용하십시오.
  3. GFP 양성 세포로 오인될 수 있는 자가형광 세포를 식별하기 위해 610/20 필터 및 595 LP가 장착된 488nm 레이저를 사용하십시오(개인 커뮤니케이션, Stanka Semova, Rockefeller University 유세포 분석 리소스 센터 운영 관리자).
  4. 표준 게이팅 전략을 수행하고 세포와 파편 덩어리를 나타낼 가능성이 있는 큰 측면 산란 영역(SSC-A) 및 작은 전방 산란 영역(FSC-A)이 있는 이벤트를 제거합니다.
  5. 서문 scatter singlets를 분리한 다음 side scatter singlelet을 분리합니다.
  6. 높은 GFP 신호와 낮은 자가형광 신호로 세포를 분리합니다.
    참고: 자가형광이 높고 GFP가 낮은 세포는 진정한 GFP 양성 세포가 아닙니다.
  7. GFP+ 게이트에 대한 임계값은 GFP- 세포(즉, N2)와 GFP+ 세포55,56을 비교하여 결정됩니다.
  8. 사세포에 대한 DAPI의 선택적 투과성에 따라 live/dead gate가 있는 dead cell 제거: live dead gate의 임계값은 염색되지 않은 세포와 DAPI 염색된 세포를 비교하여 결정됩니다.
    알림: 여러 샘플을 분류할 때amp교차 오염이 없는지 확인하기 위해 샘플 사이의 스트림을 플러시하십시오.

12. FACS 게이팅 전략의 효율성을 검증하기 위한 정렬된 뉴런의 현미경 검사

  1. 유리 현미경 슬라이드에 액체 발수 펜으로 원을 그립니다.
  2. 피펫 10 μL의 정렬된 세포가 원 내부의 난자 완충액에 현탁되어 있습니다. 샘플 위에 커버슬립을 놓고 커버 슬립 둘레를 매니큐어로 밀봉합니다.
  3. 매니큐어가 마르면 정립/도립 형광 현미경으로 분류된 세포가 실제로 주로 GFP + 세포인지 확인합니다.
    참고: 각 정렬 세션 후에 이 검사를 수행하여 FACS 게이팅 전략57을 검증합니다.

13. 품질 관리 자동 전기영동 시스템에서 RNA 추출 및 RNA 품질 정량화

참고: 모든 RNA 작업은 RNase로 인한 오염을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여 실행해야 합니다(시약, 소모품 및 RNase 안전 모범 사례의 신중한 준비 포함).

알림: 샘플에 흄 후드에 페놀 및/또는 클로로포름이 포함된 모든 단계를 수행하십시오.

  1. Trizol의 세포 바이알을 실온에서 해동합니다.
  2. 필터 팁 P200 피펫 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 여러 번 사용하여 샘플을 균질화합니다.
  3. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 용해에 사용되는 Trizol 시약 1mL당 클로로포름 0.2mL를 추가한 다음 튜브를 단단히 닫습니다.
  5. 튜브를 15회 뒤집고 2-3분 동안 (20-25 °C에서) 배양합니다.
  6. 4°C에서 12,000 × g 에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 혼합물은 하부 적색 페놀-클로로포름, 계기 및 무색 상부 수성상으로 분리됩니다.
  7. RNA를 포함하는 상부 수성상(upper aqueous phase)을 독점적으로 수집하여 새로운 low DNA/RNA 결합 1.5 mL 튜브로 전달합니다.
    참고: 경우에 따라 세포 분류기에서 Trizol로 떨어진 난자 완충액의 세포 비율이 1:3 샘플:Trizol-LS 비율보다 큰 경우 난자 완충액의 높은 염분 함량으로 인해 층이 반전될 수 있습니다. 이 경우 Trizol-LS를 더 추가하고 반전 및 원심분리를 반복합니다. 이것은 또한 분류 후 샘플 부피의 증가에 유의하면 피할 수 있습니다. 1:3 비율이 유지되지 않으면 RNA 추출을 시작하기 전에 충분한 트리졸을 첨가합니다.
  8. RNA를 추가로 정제하려면 RNA 추출 컬럼 화학을 사용하십시오.
  9. 품질 관리 자동 전기영동 시스템을 사용하여 RNA Integrity Number(RIN)를 측정하고 후속 RNA 염기서열분석 실험에 입력하기 위해 RNA RIN이 8.0 이상인지 확인합니다.

결과

흥분독성의 선충 모델 및 진공 퇴화 뉴런의 식별
여기에 표시된 데이터는 이전 간행물37,38에서 복제한 것입니다. 흥분독성 유발 신경퇴행을 모방하기 위해 글루타메이트 수송체 유전자 녹아웃(glt-3)을 신경 민감성 형질전환 배경(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]과 결합합니다. Pglr-1::...

토론

널리 퍼진 논란과 실패는 흥분독성이 해독하기 매우 어려운 과정을 제시한다는 것을 시사하지만, 선충의 흥분독성 분석은 이 중요한 형태의 신경퇴행에서 보존된 신경세포 사멸 경로를 밝히는 특히 매력적인 전략을 제공합니다. 연구자는 이 시스템에서 사용할 수 있는 풍부한 연구 도구 모음, 특히 동물의 투명성(생체 내 분석 가능)과 생존 가능한 돌연변이의 대규모 레?...

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

Mano Lab과 Li lab(현재 및 최근)의 모든 구성원의 도움과 지원에 감사드립니다. 선충의 괴사성 신경퇴행 분석을 개척하고 지속적인 지원을 제공한 Monica Driscoll(Rutgers Univ.)에게 감사드립니다. 지원 및 조언을 제공하는 Dr. Chris Li (CCNY); 세포 분류에 대한 실질적인 지원과 조언을 해준 Jeffery Walker(CCNY 유세포 분석 핵심 시설), Dr. Bao Voung(CCNY) 및 Stanka Semova(Rockefeller Univ. Sorting Faculty Core); 시약에 대한 Chris Rongo 박사(Rutgers Univ.); David Miller 박사(Vanderbilt Univ.), Coleen Murphy(Princeton Univ.), Shai Shaham, Menachem Katz, Katherine Varandas 박사(모두 Rockefeller Univ.) 박사. 예쁜꼬마선충 해리 프로토콜.

Mano 실험실은 NIH NINDS(NS096687, NS098350, NS116028)에서 I.M.으로, 그리고 NIH U54 CCNY-MSKCC 파트너십(CA132378/CA137788)을 통해 자금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

참고문헌

  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523 (2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1 (1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  36. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  37. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  38. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25 (2015).
  39. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060 (2014).
  40. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  41. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  42. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  43. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368 (2020).
  44. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  45. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
  46. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  47. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  48. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  49. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180 (2016).
  50. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  51. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42 (2005).
  52. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  53. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  54. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882 (2019).
  55. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  56. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  57. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유